Hücre Yayma Sırasında Hücre Kenarı Dinamiklerinin Nicel Analizi
Summary
Bu protokolde canlı hücre mikroskopisi esas alınarak yapılan test yayılan bir hücrenin deneysel prosedürlerini sunuyoruz. Floresan etiketli hücrelerin tarafsız segmentasyonu ve hücre yayılması sırasında lamellipodia dinamiklerinin nicel analizi için açık kaynaklı bir hesaplama aracı sunuyoruz.
Abstract
Hücre yayma, medyada asılı bir hücrenin bir substrata bağlandığı ve yuvarlanmış bir şekilden ince ve yayılmış bir şekle düzleştirmesi dinamik bir işlemdir. Hücre-substrat ekini takiben, hücre gövdesinden yayılan ince bir lamellipodia tabakası oluşturur. Lamellipodia’da, globüler aktin (G-actin) monomerleri plazma zarına doğru iten yoğun bir filamentli aktin (F-actin) meshwork’e polimerize olur ve böylece hücrenin yayılması için gereken mekanik kuvvetleri sağlar. Özellikle, lamellipodia’daki aksin polimerizasyonunu kontrol eden moleküler oyuncular, hücre göçü ve endositoz gibi diğer birçok hücresel süreç için gereklidir.
Yayılan hücreler tüm hücre çevresini kapsayan ve sürekli olarak dışa doğru genişleyen sürekli lamellipodia oluşturduğundan, hücre yayma tahlilleri lamellipodial çıkıntıların kinetiğini değerlendirmek için etkili bir araç haline gelmiştir. Hücrenin yayılan tahlillerinin birkaç teknik uygulaması geliştirilmiş olsa da, iş akışının hem adım adım protokol hem de veri analizi için hesaplama araçlarını içerecek ayrıntılı bir açıklaması şu anda eksiktir. Burada, hücre yayılma tahlilinin deneysel prosedürlerini açıklıyoruz ve yayılma sırasında hücre kenar dinamiklerinin nicel ve tarafsız analizi için açık kaynaklı bir araç sunuyoruz. Farmakolojik manipülasyonlar ve/veya gen susturma teknikleri ile birleştirildiğinde, bu protokol lamellipodial çıkıntıları düzenleyen moleküler oyuncuların geniş ölçekli bir ekranına tabidir.
Introduction
Lamellipodial çıkıntılar, göç eden bir hücrenin önünde oluşan belirgin sitoskeletal yapılardır. Lamellipodia’da, Arp2/3 kompleksi ve forminlerin yardımıyla aktinin polimerizasyonu, plazma zarına1,2‘ye karşı iten hızlı büyüyen dallı bir aksin meshwork oluşturur. Aktüen meshwork tarafından oluşturulan itme kuvveti, hücreyi fiziksel olarakileriye doğru iterek 1,3,4,5. Arp2/3 kompleksinin tükenmesi veya lamellipodial çıkıntılar için gerekli sinyal yollarının bozulması genellikle hücre göçini bozar6, 7. Lamellipodia eksikliği olan hücrelerin göçü de bildirilmiş olsa da8,9Hücre göçünde lamellipodia’nın önemi, hücrenin karmaşık biyolojik mikroçevremeler 6,10arasında hareket etme yeteneğini besleyen bu çıkıntılı yapının tükenmesi olarak açıktır.
Göç eden hücrelerde lamellipodia’nın düzenlenmesini anlamanın en büyük engeli, lamellipodial çıkıntı kinetiği, boyutu ve şekli11 , 12,13,14’tekidoğal değişkenliktir. Ayrıca, son çalışmalar lamellipodia’nın dalgalanan, periyodik ve hızlanan çıkıntılar da dahil olmak üzere karmaşık çıkıntılı davranışlar sergilediğini göstermiştir14,15. Göç eden hücrelerin son derece değişken lamellipodia ile karşılaştırıldığında6,16, hücre yayılması sırasında oluşan lamellipodia daha düzgün12. Yayılan ve göç eden hücrelerin çıkıntılı aktivitesi, dallı bir aksin ağı, kontrtil akomiyosin demetleri ve integrin bazlı hücre matrisi yapışmaları17,18, yayılan hücreleri içeren özdeş makromoleküler montajlar tarafından yönlendirilmediğinden, yayılan hücreler lamellipodia dinamiklerinin düzenlenmesini araştırmak için yaygın olarak kullanılmıştır.
Hücre yayma, süspansiyondaki bir hücrenin önce integrin bazlı yapıştırmalar17 , 19,20 yoluyla bir substrata yapıştığı ve daha sonra aksin bazlı çıkıntıları21 ,22,23genişleterek yayıldığı dinamik bir mekanokimyasal süreçtir. Yayılma aşamasında, hücre gövdesinden yayılan lamellipodia izotropik olarak ve ısrarlı bir şekilde çok az geri çekilme veya oyalama ile çıkıntı12. En sık kullanılan hücre yayma protokolleri, yayılan hücrelerin kaplamadan sonra çeşitli zamanlarda sabitlendiği uç noktalar tahlilleridir19,24. Bu tahliller, hızlı ve basit olmasına rağmen, lamellipodia’nın dinamik özelliklerindeki değişiklikleri tespit etmek için tanılama güçlerinde sınırlıdır. Lamellipodia dinamiklerini kontrol eden moleküler mekanizmaları belirlemek için Sheetz grubu, canlı yayılan hücrelerin nicel analizinin kullanılmasına öncülük etti ve hücre kenarı çıkıntılarının birçok temel özelliğini ortaya çıkardı11,12,22. Bu çalışmalar, canlı hücre yayma tahlilinin bir hücre biyolojisi laboratuvarının alet çantasında sağlam ve güçlü bir teknik olduğunu göstermiştir. Buna rağmen, canlı hücre yayma tahlilleri için ayrıntılı bir protokol ve açık kaynaklı hesaplama aracı şu anda hücre biyolojisi topluluğu için kullanılamamaktadır. Bu amaçla, protokolümüz canlı yayılan hücreleri görüntüleme prosedürlerini özetler ve otomatik bir görüntü analizi aracı sağlar. Bu yöntemi doğrulamak için deneysel bir tedavi olarak Arp2/3 inhibisyonunu kullandık ve Arp2/3 kompleksinin işlevini engellemenin hücre yayılımını tutuklamadığını, hücre çıkıntı hızında önemli bir azalmaya neden olduğunu ve hücre kenarı çıkıntılarının stabilitesinin pürüzlü hücre kenarlarına yol açtığını gösterdik. Bu veriler, canlı hücre görüntüleme ve otomatik görüntü analizi kombinasyonunun hücre kenar dinamiklerini analiz etmek ve lamellipodia’yı düzenleyen moleküler bileşenleri tanımlamak için yararlı bir araç olduğunu göstermektedir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Açıklanan hücre yayma tahlili, çoğu hücre yayma protokolünde eksik olan morfolojik değişikliklerin(örneğin, hücre büyüklüğü ve şekli) ve hücre kenar hareketlerinin(örneğin, çıkıntı hızı ve geri çekme sıklığı) sürekli izlenmesini sağlar19,24. Yaygın olarak kullanılan son nokta hücre yayma tahlilleri hücre yayılma hızının belirlenmesine izin verirken, bu tahliller hücre kenar hareketlerinin zamansal dinam…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, Connaught Fund New Investigator Award to S.P., Canada Foundation for Innovation, NSERC Discovery Grant Program (RGPIN-2015-05114 ve RGPIN-2020-05881), Manchester Üniversitesi ve Toronto Üniversitesi Ortak Araştırma Fonu ve Toronto Üniversitesi XSeed Programı tarafından desteklenmiştir.
Materials
| 0.05% Trypsin (0.05%), 0.53 mM EDTA | Wisent Bioproducts | 325-042-CL | |
| 10.0 cm Petri Dish, Polystyrene, TC Treated, Vented | Starstedt | 83.3902 | |
| 15 mL High Clarity PP Centrifuge Tube, Conical Bottom, with Dome Seal Screw Cap, Sterile | Falcon | 352097 | |
| 1-Well Chamlide CMS for 22 mm x 22 mm Coverslip | Quorum Technologies | CM-S22-1 | |
| 35 mm TC-treated Easy-Grip Style Cell Culture Dish | Falcon | 353001 | |
| 50 mL Centrifuge Tube, Transparent, Plug Seal | Nest | 602002 | |
| 6.0 cm Cell Culture Dishes Treated for Increased Cell Attachment, Sterile | VWR | 10861-658 | |
| Arp2/3 Complex Inhibitor I, CK-666 | Millipore Sigma | 182515 | |
| Camera, Prime 95B-25MM | Photometrics | ||
| Dimethyl Sulfoxide, Sterile | BioShop | DMS666 | |
| DMEM, 1x, 4.5 g/L Glucose, with L-Glutamine, Sodium Pyruvate and Phenol Red | Wisent Bioproducts | 319-005 CL | |
| DMEM/F-12, HEPES, No Phenol Red | Gibco | 11039021 | |
| D-PBS, 1X | Wisent Bioproducts | 311-425 CL | |
| Fetal Bovine Serum | Wisent Bioproducts | 080-110 | |
| Fiji Software | ImageJ | ||
| HEPES (1 M) | Gibco | 15630080 | |
| Human Plasma Fibronectin Purified Protein 1 mg | Millipore Sigma | FC010 | |
| Immersion Oil | Cargille | 16241 | |
| L-Glutamine Solution (200 mM) | Wisent Bioproducts | 609-065-EL | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Gibco | 11140050 | |
| Micro Cover Glasses, Square, No. 11/2 22 x 22 mm | VWR | CA48366-227-1 | |
| Microscope Body, Eclipse Ti2-E | Nikon | ||
| Objective, CFI Plan Apo Lambda 60X Oil | Nikon | MRD01605 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma | P4333 | |
| Spinning Disk, Crest Light V2 | CrestOptics | ||
| Spyder | Anaconda | ||
| Stage top incubator | Tokai Hit | ||
| Statistics Software, Prism | GraphPad | ||
| Tweezers, Style 2 | Electron Microscopy Sciences | 78326-42 |
References
- Mullins, R. D., Heuser, J. A., Pollard, T. D. The interaction of Arp2/3 complex with actin: Nucleation, high affinity pointed end capping, and formation of branching networks of filaments. Proceedings of the National Academy of Sciences. 95 (11), 6181-6186 (1998).
- Yang, C., Czech, L., Gerboth, S., Kojima, S., Scita, G., Svitkina, T. Novel Roles of Formin mDia2 in Lamellipodia and Filopodia Formation in Motile Cells. PLoS Biology. 5 (11), 317 (2007).
- Mogilner, A., Oster, G. Cell motility driven by actin polymerization. Biophysical Journal. 71 (6), 3030-3045 (1996).
- Mogilner, A., Oster, G. Force Generation by Actin Polymerization II: The Elastic Ratchet and Tethered Filaments. Biophysical Journal. 84 (3), 1591-1605 (2003).
- Pollard, T. D., Borisy, G. G. Cellular Motility Driven by Assembly and Disassembly of Actin Filaments. Cell. 112 (4), 453-465 (2003).
- Wu, C., et al. Arp2/3 is critical for lamellipodia and response to extracellular matrix cues but is dispensable for chemotaxis. Cell. 148 (5), 973-987 (2012).
- Steffen, A., et al. Rac function is crucial for cell migration but is not required for spreading and focal adhesion formation. Journal of cell science. 126, 4572-4588 (2013).
- Gupton, S. L., et al. Cell migration without a lamellipodium. The Journal of Cell Biology. 168 (4), 619-631 (2005).
- Dimchev, V., et al. Induced Arp2/3 Complex Depletion Increases FMNL2/3 Formin Expression and Filopodia Formation. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 634708 (2021).
- Leithner, A., et al. Diversified actin protrusions promote environmental exploration but are dispensable for locomotion of leukocytes. Nature cell biology. 18 (11), 1253-1259 (2016).
- Giannone, G., Dubin-Thaler, B. J., Döbereiner, H. -. G., Kieffer, N., Bresnick, A. R., Sheetz, M. P. Periodic Lamellipodial Contractions Correlate with Rearward Actin Waves. Cell. 116 (3), 431-443 (2004).
- Dubin-Thaler, B. J., et al. Quantification of Cell Edge Velocities and Traction Forces Reveals Distinct Motility Modules during Cell Spreading. PLoS ONE. 3 (11), 3735 (2008).
- Suraneni, P., Rubinstein, B., Unruh, J. R., Durnin, M., Hanein, D., Li, R. The Arp2/3 complex is required for lamellipodia extension and directional fibroblast cell migration. The Journal of cell biology. 197 (2), 239-251 (2012).
- Wang, C., et al. Deconvolution of subcellular protrusion heterogeneity and the underlying actin regulator dynamics from live cell imaging. Nature Communications. 9 (1), 1688 (2018).
- Dimchev, G., et al. Lamellipodin tunes cell migration by stabilizing protrusions and promoting adhesion formation. Journal of cell science. 133 (7), 239020 (2020).
- Burnette, D. T., et al. A role for actin arcs in the leading-edge advance of migrating cells. Nature cell biology. 13 (4), 371-381 (2011).
- Yamada, K. M., Kennedy, D. W. Dualistic nature of adhesive protein function: fibronectin and its biologically active peptide fragments can autoinhibit fibronectin function. The Journal of Cell Biology. 99 (1), 29-36 (1984).
- Cai, Y., et al. Nonmuscle Myosin IIA-Dependent Force Inhibits Cell Spreading and Drives F-Actin Flow. Biophysical Journal. 91 (10), 3907-3920 (2006).
- Humphries, M. J. Cell adhesion assays. Molecular Biotechnology. 18 (1), 57-61 (2001).
- Cavalcanti-Adam, E. A., Volberg, T., Micoulet, A., Kessler, H., Geiger, B., Spatz, J. P. Cell Spreading and Focal Adhesion Dynamics Are Regulated by Spacing of Integrin Ligands. Biophysical Journal. 92 (8), 2964-2974 (2007).
- Dubin-Thaler, B. J., Giannone, G., Döbereiner, H. -. G., Sheetz, M. P. Nanometer Analysis of Cell Spreading on Matrix-Coated Surfaces Reveals Two Distinct Cell States and STEPs. Biophysical Journal. 86 (3), 1794-1806 (2004).
- Gauthier, N. C., Fardin, M. A., Roca-Cusachs, P., Sheetz, M. P. Temporary increase in plasma membrane tension coordinates the activation of exocytosis and contraction during cell spreading. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (35), 14467-14472 (2011).
- Wolfenson, H., Iskratsch, T., Sheetz, M. P. Early Events in Cell Spreading as a Model for Quantitative Analysis of Biomechanical Events. Biophysical Journal. 107 (11), 2508-2514 (2014).
- Guan, J. -. L., Berrier, A. L., LaFlamme, S. E. Cell Migration, Developmental Methods and Protocols. Methods in molecular biology. 294, 55-68 (2004).
- Raucher, D., et al. Phosphatidylinositol 4,5-Bisphosphate Functions as a Second Messenger that Regulates Cytoskeleton-Plasma Membrane Adhesion. Cell. 100 (2), 221-228 (2000).
- Machacek, M., Danuser, G. Morphodynamic Profiling of Protrusion Phenotypes. Biophysical Journal. 90 (4), 1439-1452 (2006).
- Zack, G. W., Rogers, W. E., Latt, S. A. Automatic measurement of sister chromatid exchange frequency. The journal of histochemistry and cytochemistry official journal of the Histochemistry Society. 25 (7), 741-753 (1977).
- Bardsley, W. G., Aplin, J. D. Kinetic analysis of cell spreading. I. Theory and modelling of curves. Journal of cell science. 61, 365-373 (1983).
