Quantitative Analyse der Zellkantendynamik während der Zellstreuung
Summary
In diesem Protokoll stellen wir die experimentellen Verfahren eines Zellstreu-Assays vor, der auf der Live-Zellmikroskopie basiert. Wir bieten ein Open-Source-Rechenwerkzeug für die unvoreingenommene Segmentierung fluoreszierend markierter Zellen und die quantitative Analyse der Lamellipodie-Dynamik während der Zellstreuung.
Abstract
Die Zellstreuung ist ein dynamischer Prozess, bei dem eine in Medien aufgehängte Zelle an einem Substrat befestigt wird und sich von einer abgerundeten zu einer dünnen und ausgebreiteten Form abflacht. Nach der Zellsubstrat-Anhaftung bildet die Zelle ein dünnes Blatt Lamellipodie, das aus dem Zellkörper ausgeht. In der Lamellipodia polymerisieren kugelförmige Actin-Monomere (G-Actin) in ein dichtes fadenförmiges Actin-Netz (F-Actin), das gegen die Plasmamembran drückt und so die mechanischen Kräfte bereitstellt, die für die Ausbreitung der Zelle erforderlich sind. Insbesondere die molekularen Akteure, die die Actin-Polymerisation in Lamellipodien steuern, sind für viele andere zelluläre Prozesse, wie Zellmigration und Endozytose, von wesentlicher Bedeutung.
Da sich streuende Zellen zu einer kontinuierlichen Lamellipodie bilden, die sich über die gesamte Zellperipherie erstrecken und sich dauerhaft nach außen ausdehnen, sind Zellstreuungstests zu einem effizienten Werkzeug geworden, um die Kinetik lamellipodischer Vorsprünge zu bewerten. Obwohl mehrere technische Implementierungen des Zellstreu-Assays entwickelt wurden, fehlt derzeit eine detaillierte Beschreibung des Workflows, die sowohl ein Schritt-für-Schritt-Protokoll als auch Rechenwerkzeuge für die Datenanalyse umfassen würde. Hier beschreiben wir die experimentellen Verfahren des Zellstreu-Assays und präsentieren ein Open-Source-Tool zur quantitativen und unvoreingenommenen Analyse der Zellkantendynamik während der Ausbreitung. In Kombination mit pharmakologischen Manipulationen und/oder Gen-Silencing-Techniken ist dieses Protokoll für einen groß angelegten Bildschirm von molekularen Akteuren zugänglich, die lamellipodiale Vorsprünge regulieren.
Introduction
Lamellipodiale Vorsprünge sind prominente zytoskelettale Strukturen, die an der Vorderseite einer wandernden Zelle gebildet werden. In lamellipodien erzeugt die Polymerisation von Actin mit Hilfe des Arp2/3-Komplexes und der Formine ein schnell wachsendes verzweigtes Aktin-Netz, das gegen die Plasmamembran1,2drückt. Die schubsende Kraft, die durch das Aktin-Netz erzeugt wird, treibt die Zelle physisch nach vorne1,3,4,5. Erschöpfung des Arp2/3-Komplexes oder Störung der Signalwege, die für lamellipodiale Vorsprünge unerlässlich sind, beeinträchtigen häufig die Zellmigration6, 7. Obwohl die Migration von Lamellipodie-defiziden Zellen ebenfalls berichtet wurde8,9, ist die Bedeutung der Lamellipodie bei der Zellmigration offensichtlich, da die Erschöpfung dieser protrusiven Struktur die Fähigkeit der Zelle stört, sich durch komplexe biologische Mikroumgebungen zu bewegen6,10.
Ein großes Hindernis für das Verständnis der Regulation von Lamellipodie n. B. in wandernden Zellen ist die natürliche Variabilität in der lamellipodialen Protrusionskinetik, Größe und Form11,12,13,14. Darüber hinaus haben neuere Studien gezeigt, dass Lamellipodie komplexe protrusive Verhaltensweisen aufweisen, einschließlich schwankender, periodischer und beschleunigender Vorsprünge14,15. Im Vergleich zu den hochvariablen Lamellipodien der wandernden Zellen6,16sind Lamellipodien, die bei der Zellausbreitung gebildet werden, gleichmäßiger12. Da die protrusive Aktivität der Sichtung und Migration von Zellen durch identische makromolekulare Baugruppen angetrieben wird, die ein verzweigtes Aktin-Netzwerk, kontraktile Actomyosin-Bündel und integrinbasierte Zellmatrix-Adhäsionen17,18umfassen, wurden Streuzellen weithin als Modell für die Untersuchung der Regulation der Lamellipodie-Dynamik verwendet.
Zellstreuung ist ein dynamischer mechanochemischer Prozess, bei dem eine Zelle in Suspension zuerst durch integrinbasierte Adhäsionen17,19,20 an einem Substrat haftet und sich dann durch Verlängerung der aktinbasierten Vorsprünge21,22,23ausbreitet. Während der Ausbreitungsphase ragen Lamellipodieaus dem Zellkörper istisch und anhaltend heraus, ohne dass es sich um ein Zurückziehen oder Stocken12geht. Die am häufigsten verwendeten Zellstreuprotokolle sind Endpunkt-Assays, bei denen Streuzellen nach der Beschichtung19,24zu verschiedenen Zeitpunkten fixiert werden. Diese Assays sind zwar schnell und einfach, aber in ihrer diagnostischen Leistungsfähigkeit begrenzt, um Veränderungen in den dynamischen Merkmalen der Lamellipodie zu erkennen. Um die molekularen Mechanismen zu bestimmen, die die Lamellipodie-Dynamik steuern, war die Sheetz-Gruppe Vorreiter bei der quantitativen Analyse von lebenden Streuzellen und deckte viele grundlegende Eigenschaften von Zellrandvorsprüngenauf 11,12,22. Diese Studien haben gezeigt, dass der Live-Zell-Verbreitungstest eine robuste und leistungsstarke Technik in der Werkzeugkiste eines Zellbiologielabors ist. Trotzdem sind ein detailliertes Protokoll und Ein-Quell-Rechentool für einen Live-Zell-Verbreitungstest derzeit für die Zellbiologie-Community nicht verfügbar. Zu diesem Zweck skizziert unser Protokoll die Verfahren zur Abbildung von lebenden Streuzellen und stellt ein automatisiertes Bildanalysetool zur Verfügung. Um diese Methode zu validieren, verwendeten wir die Arp2/3-Hemmung als experimentelle Behandlung und zeigten, dass die Hemmung der Funktion des Arp2/3-Komplexes die Zellausbreitung nicht festhielt, sondern eine signifikante Verringerung der Zellvorsprunggeschwindigkeit sowie die Stabilität von Zellkantenvorsprüngen verursachte, was zu gezackten Zellkanten führte. Diese Daten zeigen, dass die Kombination von Live-Zell-Bildgebung und automatisierter Bildanalyse ein nützliches Werkzeug ist, um die Zellkantendynamik zu analysieren und molekulare Komponenten zu identifizieren, die Lamellipodie regulieren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Der beschriebene Zellstreutest ermöglicht die kontinuierliche Verfolgung morphologischer Veränderungen(z. B. Zellgröße und -form) und Zellkantenbewegungen(d. h. Vorsprunggeschwindigkeit und Rückzugshäufigkeit), die in den meisten Zellstreuprotokollen19,24fehlen. Während häufig verwendete Endpunktzellstreuungs-Assays die Bestimmung der Zellstreugeschwindigkeit ermöglichen, können diese Assays die zeitliche Dynamik von Zellkantenbewegung…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch den Connaught Fund New Investigator Award an S.P., Canada Foundation for Innovation, NSERC Discovery Grant Program (Grants RGPIN-2015-05114 und RGPIN-2020-05881), University of Manchester und University of Toronto Joint Research Fund und University of Toronto XSeed Program unterstützt.
Materials
| 0.05% Trypsin (0.05%), 0.53 mM EDTA | Wisent Bioproducts | 325-042-CL | |
| 10.0 cm Petri Dish, Polystyrene, TC Treated, Vented | Starstedt | 83.3902 | |
| 15 mL High Clarity PP Centrifuge Tube, Conical Bottom, with Dome Seal Screw Cap, Sterile | Falcon | 352097 | |
| 1-Well Chamlide CMS for 22 mm x 22 mm Coverslip | Quorum Technologies | CM-S22-1 | |
| 35 mm TC-treated Easy-Grip Style Cell Culture Dish | Falcon | 353001 | |
| 50 mL Centrifuge Tube, Transparent, Plug Seal | Nest | 602002 | |
| 6.0 cm Cell Culture Dishes Treated for Increased Cell Attachment, Sterile | VWR | 10861-658 | |
| Arp2/3 Complex Inhibitor I, CK-666 | Millipore Sigma | 182515 | |
| Camera, Prime 95B-25MM | Photometrics | ||
| Dimethyl Sulfoxide, Sterile | BioShop | DMS666 | |
| DMEM, 1x, 4.5 g/L Glucose, with L-Glutamine, Sodium Pyruvate and Phenol Red | Wisent Bioproducts | 319-005 CL | |
| DMEM/F-12, HEPES, No Phenol Red | Gibco | 11039021 | |
| D-PBS, 1X | Wisent Bioproducts | 311-425 CL | |
| Fetal Bovine Serum | Wisent Bioproducts | 080-110 | |
| Fiji Software | ImageJ | ||
| HEPES (1 M) | Gibco | 15630080 | |
| Human Plasma Fibronectin Purified Protein 1 mg | Millipore Sigma | FC010 | |
| Immersion Oil | Cargille | 16241 | |
| L-Glutamine Solution (200 mM) | Wisent Bioproducts | 609-065-EL | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Gibco | 11140050 | |
| Micro Cover Glasses, Square, No. 11/2 22 x 22 mm | VWR | CA48366-227-1 | |
| Microscope Body, Eclipse Ti2-E | Nikon | ||
| Objective, CFI Plan Apo Lambda 60X Oil | Nikon | MRD01605 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma | P4333 | |
| Spinning Disk, Crest Light V2 | CrestOptics | ||
| Spyder | Anaconda | ||
| Stage top incubator | Tokai Hit | ||
| Statistics Software, Prism | GraphPad | ||
| Tweezers, Style 2 | Electron Microscopy Sciences | 78326-42 |
References
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