सेल स्प्रेडिंग के दौरान सेल एज डायनेमिक्स का मात्रात्मक विश्लेषण
Summary
इस प्रोटोकॉल में, हम परख फैलाने वाली कोशिका की प्रायोगिक प्रक्रियाएं प्रस्तुत करते हैं जो लाइव-सेल माइक्रोस्कोपी पर आधारित है। हम फ्लोरोसेंटली लेबल कोशिकाओं के निष्पक्ष विभाजन और कोशिका के प्रसार के दौरान लैमेलिपोडिया गतिशीलता के मात्रात्मक विश्लेषण के लिए एक ओपन-सोर्स कंप्यूटेशनल टूल प्रदान करते हैं।
Abstract
सेल स्प्रेडिंग एक गतिशील प्रक्रिया है जिसमें मीडिया में निलंबित एक सेल एक सब्सट्रेट से जुड़ता है और एक गोल से पतले और फैलाव वाले आकार तक खुद को सपाट कर देता है। सेल-सब्सट्रेट अटैचमेंट के बाद, कोशिका कोशिका शरीर से निकलने वाली लैमेलिपोडिया की एक पतली शीट बनाती है। लैमेलिपोडिया में, गोलाकार ऐक्टिन (जी-ऐक्टिन) मोनोमर एक घने फिलामेंटस ऐक्टिन (एफ-ऐक्टिन) मेशवर्क में बहुल हो जाते हैं जो प्लाज्मा झिल्ली के खिलाफ धक्का देता है, जिससे कोशिका को फैलने के लिए आवश्यक यांत्रिक बल प्रदान होते हैं। विशेष रूप से, मॉलिक्यूलर प्लेयर्स जो लैमेलिपोडिया में ऐक्टिन पॉलीमराइजेशन को नियंत्रित करते हैं, सेल माइग्रेशन और एंडोसाइटोसिस जैसी कई अन्य सेलुलर प्रक्रियाओं के लिए आवश्यक हैं।
चूंकि फैलने वाली कोशिकाएं निरंतर लैमेलिपोडिया बनाती हैं जो पूरे सेल परिधि में फैली होती हैं और लगातार जावक का विस्तार करती हैं, इसलिए कोशिका फैलने वाली परखें लैमेलिपोडियाल फलाव के काइनेटिक्स का आकलन करने के लिए एक कुशल उपकरण बन गई हैं। यद्यपि परख फैलाने वाले सेल के कई तकनीकी कार्यान्वयन विकसित किए गए हैं, लेकिन कार्यप्रवाह का विस्तृत विवरण, जिसमें डेटा विश्लेषण के लिए कदम-दर-कदम प्रोटोकॉल और कम्प्यूटेशनल टूल दोनों शामिल होंगे, वर्तमान में कमी है। यहां, हम परख फैलाने वाले सेल की प्रायोगिक प्रक्रियाओं का वर्णन करते हैं और प्रसार के दौरान सेल एज गतिशीलता के मात्रात्मक और निष्पक्ष विश्लेषण के लिए एक ओपन-सोर्स उपकरण प्रस्तुत करते हैं। जब औषधीय जोड़तोड़ और/या जीन-मुंह बंद करने की तकनीकों के साथ संयुक्त, यह प्रोटोकॉल लमेलियोपियल फलाव को विनियमित करने वाले आणविक खिलाड़ियों की एक बड़े पैमाने पर स्क्रीन के लिए उत्तरदायी है ।
Introduction
लैमेलिपोडियल प्रोट्रूस माइग्रेट सेल के सामने बनने वाली प्रमुख साइटोस्केलेल संरचनाएं हैं। लैमेलिपोडिया में, एआरपी 2/3 कॉम्प्लेक्स और फॉर्मिन की सहायता से ऐक्टिन का बहुलीकरण एक तेजी से बढ़ते ब्रांच्ड ऐक्टिन मेशवर्क बनाता है जो प्लाज्मा झिल्ली1,2के खिलाफ धक्का देता है। ऐक्टिन मेशवर्क द्वारा उत्पन्न बल शारीरिक रूप से कोशिका को आगे बढ़ाता है1,3,4,5. एआरपी2/3 परिसर की कमी या लैमेलियोपियल फलाव के लिए आवश्यक सिग्नलिंग रास्तों में व्यवधान अक्सर सेल माइग्रेशन 6, 7को ख़राब कर देताहै । यद्यपि लमेलिपोडिया की कमी वाली कोशिकाओं के प्रवास की भी सूचना दी गई है8,9, कोशिका प्रवास में लैमेलिपोडिया का महत्व स्पष्ट है क्योंकि इस फलावरोधी संरचना की कमी से कोशिका की जटिल जैविक माइक्रोएनवायरमेंट्स6,10के माध्यम से स्थानांतरित करने की क्षमता में कमी आती है ।
प्रवास कोशिकाओं में लैमेलिपोडिया के नियमन को समझने में एक बड़ी बाधा लैमेलियोपियल प्रोट्रूजेशन काइनेटिक्स, आकार और आकार11, 12,13,14में प्राकृतिक परिवर्तनशीलता है। इसके अलावा, हाल के अध्ययनों से पता चला है कि लैमेलिपोडिया जटिल फलाव व्यवहार प्रदर्शित करते हैं, जिसमें उतार-चढ़ाव, आवधिक और फलाव14, 15में तेजीशामिलहै। कोशिकाओं के प्रसार के दौरान बनने वाली प्रवासी कोशिकाओं के अत्यधिक परिवर्तनीय लैमेलिपोडिया की तुलना में6,16 ,लमेलिपोडियाअधिक समानहैं। चूंकि कोशिकाओं के प्रसार और पलायन की फलती गतिविधि समान मैक्रोमॉलिक्यूलर असेंबली द्वारा संचालित होती है, जिसमें एक शाखादार ऐक्टिन नेटवर्क, अनुबंधित एक्टोमायोसिन बंडल, और इंटीग्रिन-आधारित सेल-मैट्रिक्स आसंजन17,18शामिल हैं, इसलिए फैलने वाली कोशिकाओं को लमेलिपोडिया गतिशीलता के नियमन की जांच के लिए एक मॉडल के रूप में व्यापक रूप से उपयोग किया गया है।
सेलस्प्रेडिंग एक गतिशील मशीनोकेमिकल प्रक्रिया है जहां निलंबन में एक कोशिका पहले एकीकृत-आधारित आसंजन17, 19,20 के माध्यम से एक सब्सट्रेट का पालन करती है और फिर ऐक्टिन आधारित फलाव21, 22,23का विस्तार करके फैलती है। प्रसार चरण के दौरान, कोशिका शरीर से निकलने वाले लैमेलिपोडिया इसोट्रॉपिक रूप से और लगातार थोड़ा-थोड़ा करके कोई रिऐक्शन या12को ठप नहीं करते हैं। सबसे अधिक उपयोग किए जाने वाले सेल प्रसार प्रोटोकॉल एंडपॉइंट्स परखते हैं, जहां19,24चढ़ाना के बाद विभिन्न समयों पर फैलने वाली कोशिकाओं को तय किया जाता है। ये परख, हालांकि त्वरित और सरल, लैमेलिपोडिया की गतिशील विशेषताओं में परिवर्तन का पता लगाने के लिए उनकी नैदानिक शक्ति में सीमित हैं। लमेलिपोडिया गतिशीलता को नियंत्रित करने वाले आणविक तंत्रों को निर्धारित करने के लिए, शीट्ज़ समूह ने लाइव स्प्रेडिंग कोशिकाओं के मात्रात्मक विश्लेषण के उपयोग का बीड़ा उठाया औरसेल एज प्रोट्रूस11, 12,22के कई मौलिक गुणों का पर्दाफाश किया। इन अध्ययनों से पता चला है कि परख फैलाने वाली लाइव-सेल एक सेल जीव विज्ञान प्रयोगशाला के टूलबॉक्स में एक मजबूत और शक्तिशाली तकनीक है। इसके बावजूद, एक लाइव-सेल प्रसार परख के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल और ओपन-सोर्स कंप्यूटेशनल टूल वर्तमान में सेल जीव विज्ञान समुदाय के लिए अनुपलब्ध हैं। इस उद्देश्य के लिए, हमारा प्रोटोकॉल इमेजिंग लाइव स्प्रेडिंग कोशिकाओं की प्रक्रियाओं को रेखांकित करता है और एक स्वचालित छवि विश्लेषण उपकरण प्रदान करता है। इस विधि को मान्य करने के लिए, हमने एक प्रयोगात्मक उपचार के रूप में Arp2/3 निषेध का उपयोग किया और दिखाया कि Arp2/3 परिसर के कार्य को बाधित करने से कोशिका के प्रसार को गिरफ्तार नहीं किया गया, बल्कि सेल प्रोट्रूशन गति में उल्लेखनीय कमी आई, साथ ही सेल किनारे के फलाव की स्थिरता, दांतेदार सेल किनारों को जन्म दे रही है। ये डेटा प्रदर्शित करता है कि लाइव-सेल इमेजिंग और स्वचालित छवि विश्लेषण का संयोजन सेल एज गतिशीलता का विश्लेषण करने और आणविक घटकों की पहचान करने के लिए एक उपयोगी उपकरण है जो लैमेलिपोडिया को विनियमित करता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
वर्णित कोशिका प्रसार परख रूपात्मक परिवर्तनों(जैसे, सेल आकार और आकार) और सेल एज आंदोलनों(यानी, फलाव गति और रिऐक्शन आवृत्ति) की निरंतर ट्रैकिंग के लिए अनुमति देती है, जो अधिकांश सेल प्रसार प्रोटोक?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को कनॉट फंड न्यू इन्वेस्ट्रो अन्वेषक पुरस्कार द्वारा एसपी, कनाडा फाउंडेशन फॉर इनोवेशन, एनएसईआरसी डिस्कवरी ग्रांट प्रोग्राम (अनुदान आरजीपिन-2015-05114 और आरजीपिन-2020-05881), मैनचेस्टर विश्वविद्यालय और यूनिवर्सिटी ऑफ टोरंटो ज्वाइंट रिसर्च फंड और यूनिवर्सिटी ऑफ टोरंटो एक्ससीड प्रोग्राम को समर्थन मिला ।
Materials
| 0.05% Trypsin (0.05%), 0.53 mM EDTA | Wisent Bioproducts | 325-042-CL | |
| 10.0 cm Petri Dish, Polystyrene, TC Treated, Vented | Starstedt | 83.3902 | |
| 15 mL High Clarity PP Centrifuge Tube, Conical Bottom, with Dome Seal Screw Cap, Sterile | Falcon | 352097 | |
| 1-Well Chamlide CMS for 22 mm x 22 mm Coverslip | Quorum Technologies | CM-S22-1 | |
| 35 mm TC-treated Easy-Grip Style Cell Culture Dish | Falcon | 353001 | |
| 50 mL Centrifuge Tube, Transparent, Plug Seal | Nest | 602002 | |
| 6.0 cm Cell Culture Dishes Treated for Increased Cell Attachment, Sterile | VWR | 10861-658 | |
| Arp2/3 Complex Inhibitor I, CK-666 | Millipore Sigma | 182515 | |
| Camera, Prime 95B-25MM | Photometrics | ||
| Dimethyl Sulfoxide, Sterile | BioShop | DMS666 | |
| DMEM, 1x, 4.5 g/L Glucose, with L-Glutamine, Sodium Pyruvate and Phenol Red | Wisent Bioproducts | 319-005 CL | |
| DMEM/F-12, HEPES, No Phenol Red | Gibco | 11039021 | |
| D-PBS, 1X | Wisent Bioproducts | 311-425 CL | |
| Fetal Bovine Serum | Wisent Bioproducts | 080-110 | |
| Fiji Software | ImageJ | ||
| HEPES (1 M) | Gibco | 15630080 | |
| Human Plasma Fibronectin Purified Protein 1 mg | Millipore Sigma | FC010 | |
| Immersion Oil | Cargille | 16241 | |
| L-Glutamine Solution (200 mM) | Wisent Bioproducts | 609-065-EL | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Gibco | 11140050 | |
| Micro Cover Glasses, Square, No. 11/2 22 x 22 mm | VWR | CA48366-227-1 | |
| Microscope Body, Eclipse Ti2-E | Nikon | ||
| Objective, CFI Plan Apo Lambda 60X Oil | Nikon | MRD01605 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma | P4333 | |
| Spinning Disk, Crest Light V2 | CrestOptics | ||
| Spyder | Anaconda | ||
| Stage top incubator | Tokai Hit | ||
| Statistics Software, Prism | GraphPad | ||
| Tweezers, Style 2 | Electron Microscopy Sciences | 78326-42 |
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