Kvantitativ analys av cellkantsdynamik under cellspridning
Summary
I detta protokoll presenterar vi de experimentella förfarandena för en cell som sprider analys som är baserad på levande cellmikroskopi. Vi tillhandahåller ett beräkningsverktyg med öppen källkod för opartisk segmentering av fluorescerande märkta celler och kvantitativ analys av lamellipodia dynamik under cell spridning.
Abstract
Cellspridning är en dynamisk process där en cell som är upphängd i media fäster vid ett substrat och plattar ut sig från en rundad till en tunn och spridd form. Efter cell-substratet bifogas, cellen bildar ett tunt ark av lamellipodia som härrör från cellkroppen. I lamellipodin polymeriseras klotformiga aktinmonomer (G-aktin) monomerer till ett tätt filamentöst aktin (F-aktin) nät som trycker mot plasmamembranet och därigenom ger de mekaniska krafter som krävs för att cellen ska spridas. Särskilt de molekylära aktörer som styr aktinpolymeriseringen i lamellipodi är viktiga för många andra cellulära processer, såsom cellmigration och endocytos.
Eftersom celler sprids bildar kontinuerlig lamellipodi som sträcker sig över hela cellperiphery och ständigt expanderar utåt, har cellspridningsanalyser blivit ett effektivt verktyg för att bedöma kinetiken hos lamellipodial utskjutningar. Även om flera tekniska implementeringar av cellspridningsanalysen har utvecklats saknas för närvarande en detaljerad beskrivning av arbetsflödet, som skulle innehålla både ett steg-för-steg-protokoll och beräkningsverktyg för dataanalys. Här beskriver vi de experimentella procedurerna för cellspridningsanalysen och presenterar ett verktyg med öppen källkod för kvantitativ och opartisk analys av cellkantsdynamik under spridning. I kombination med farmakologiska manipuleringar och/eller gen-silencing tekniker, detta protokoll är mottagliga för en storskalig skärm av molekylära spelare som reglerar lamellipodial utskjutningar.
Introduction
Lamellipodial utskjutningar är framträdande cytoskeletala strukturer bildas på framsidan av en migrerande cell. I lamellipodi skapar polymerisation av aktin med hjälp av Arp2/3-komplexet och forminer ett snabbväxande förgrenat aktinnät som trycker motplasmamembranet 1,2. Den tryckkraft som genereras av aktinnätet driver cellen fysiskt framåt1,3,4,5. Utarmning av Arp2/3-komplexet eller störning av signalvägar som är nödvändiga för lamellipodial utskjutningar försämrar ofta cellmigration6, 7. Även om migration av lamellipodia-bristfälliga celler också harrapporterats 8,9, är vikten av lamellipodi i cellmigration uppenbar som utarmning av denna utskjutande struktur stör cellens förmåga att röra sig genom komplexa biologiska mikromiljöer6,10.
Ett stort hinder för att förstå regleringen av lamellipodi i migrerande celler är den naturliga variationen i lamellipodial utskjutningskinetik, storlek och form11,12,13,14. Dessutom har nyligen genomförda studier visat att lamellipodia uppvisar komplexa utskjutande beteenden, inklusive fluktuerande, periodiska och accelererande utskjutningar14,15. Jämfört med den mycket varierande lamellipodin av migrerande celler6,16, lamellipodia bildas under cellspridning är merenhetliga 12. Eftersom den utskjutande aktiviteten att sprida och migrera celler drivs av identiska makromolekylära sammansättningar, som inkluderar ett förgrenat aktinnätverk, kontraktila actomyosin-buntar och integrinbaserade cellmatrisankomplikationer17,18, har spridande celler använts i stor utsträckning som en modell för att undersöka regleringen av lamellipodiadynamik.
Cellspridning är en dynamisk mekanokemisk process där en cell i suspension först klibbar sig vid ett substrat genom integrinbaserade vidhäftningar17,19,20 och sedan sprider sig genom att förlänga aktinbaserade utskjutningar21,22,23. Under spridningsfasen sticker lamellipodi ut från cellkroppen isotropiskt och ihållande med liten eller ingen upprullning eller stalling12. De vanligaste cellspridningsprotokollen är endpoints-analyser, där spridande celler åtgärdas vid olika tidpunkter efterplätering 19,24. Dessa analyser, även om de är snabba och enkla, är begränsade i sin diagnostiska kraft för att upptäcka förändringar i lamellipodias dynamiska egenskaper. För att bestämma de molekylära mekanismerna som kontrollerar lamellipodidynamiken var Sheetz-gruppen pionjär för användningen av kvantitativ analys av levande spridande celler och avslöjade många grundläggande egenskaper hos cellkantsprotruderingar11,12,22. Dessa studier har visat att live-cell spridningsanalysen är en robust och kraftfull teknik i verktygslådan för ett cellbiologilaboratorium. Trots det är ett detaljerat protokoll och beräkningsverktyg med öppen källkod för en live-cell spridningsanalys för närvarande otillgängliga för cellbiologigemenskapen. I detta syfte beskriver vårt protokoll procedurerna för att avbilda levande spridande celler och tillhandahåller ett automatiserat bildanalysverktyg. För att validera denna metod använde vi Arp2/3 hämning som en experimentell behandling och visade att hämma funktionen hos Arp2/3 komplexet inte arresterade cell spridning men orsakade en betydande minskning av cell utskjutning hastighet, liksom stabiliteten i cell edge utskjutningar, vilket ger upphov till ojämna cell kanter. Dessa data visar att kombinationen av live-cell imaging och automatiserad bild analys är ett användbart verktyg för att analysera cellkant dynamik och identifiera molekylära komponenter som reglerar lamellipodia.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den beskrivna cellspridningsanalysen möjliggör kontinuerlig spårning av morfologiska förändringar(t.ex. cellstorlek och form)och cellkantsrörelser (dvs. utskjutningshastighet och upprullningsfrekvens), som är funktioner som saknas i de flesta cellspridningsprotokoll19,24. Medan vanliga cellspridningsanalyser för slutpunktsceller möjliggör bestämning av cellspridningshastighet, misslyckas dessa analyser med att lösa den temporala dyna…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av Connaught Fund New Investigator Award till S.P., Canada Foundation for Innovation, NSERC Discovery Grant Program (grants RGPIN-2015-05114 och RGPIN-2020-05881), University of Manchester och University of Toronto Joint Research Fund och University of Toronto XSeed Program.
Materials
| 0.05% Trypsin (0.05%), 0.53 mM EDTA | Wisent Bioproducts | 325-042-CL | |
| 10.0 cm Petri Dish, Polystyrene, TC Treated, Vented | Starstedt | 83.3902 | |
| 15 mL High Clarity PP Centrifuge Tube, Conical Bottom, with Dome Seal Screw Cap, Sterile | Falcon | 352097 | |
| 1-Well Chamlide CMS for 22 mm x 22 mm Coverslip | Quorum Technologies | CM-S22-1 | |
| 35 mm TC-treated Easy-Grip Style Cell Culture Dish | Falcon | 353001 | |
| 50 mL Centrifuge Tube, Transparent, Plug Seal | Nest | 602002 | |
| 6.0 cm Cell Culture Dishes Treated for Increased Cell Attachment, Sterile | VWR | 10861-658 | |
| Arp2/3 Complex Inhibitor I, CK-666 | Millipore Sigma | 182515 | |
| Camera, Prime 95B-25MM | Photometrics | ||
| Dimethyl Sulfoxide, Sterile | BioShop | DMS666 | |
| DMEM, 1x, 4.5 g/L Glucose, with L-Glutamine, Sodium Pyruvate and Phenol Red | Wisent Bioproducts | 319-005 CL | |
| DMEM/F-12, HEPES, No Phenol Red | Gibco | 11039021 | |
| D-PBS, 1X | Wisent Bioproducts | 311-425 CL | |
| Fetal Bovine Serum | Wisent Bioproducts | 080-110 | |
| Fiji Software | ImageJ | ||
| HEPES (1 M) | Gibco | 15630080 | |
| Human Plasma Fibronectin Purified Protein 1 mg | Millipore Sigma | FC010 | |
| Immersion Oil | Cargille | 16241 | |
| L-Glutamine Solution (200 mM) | Wisent Bioproducts | 609-065-EL | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Gibco | 11140050 | |
| Micro Cover Glasses, Square, No. 11/2 22 x 22 mm | VWR | CA48366-227-1 | |
| Microscope Body, Eclipse Ti2-E | Nikon | ||
| Objective, CFI Plan Apo Lambda 60X Oil | Nikon | MRD01605 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma | P4333 | |
| Spinning Disk, Crest Light V2 | CrestOptics | ||
| Spyder | Anaconda | ||
| Stage top incubator | Tokai Hit | ||
| Statistics Software, Prism | GraphPad | ||
| Tweezers, Style 2 | Electron Microscopy Sciences | 78326-42 |
References
- Mullins, R. D., Heuser, J. A., Pollard, T. D. The interaction of Arp2/3 complex with actin: Nucleation, high affinity pointed end capping, and formation of branching networks of filaments. Proceedings of the National Academy of Sciences. 95 (11), 6181-6186 (1998).
- Yang, C., Czech, L., Gerboth, S., Kojima, S., Scita, G., Svitkina, T. Novel Roles of Formin mDia2 in Lamellipodia and Filopodia Formation in Motile Cells. PLoS Biology. 5 (11), 317 (2007).
- Mogilner, A., Oster, G. Cell motility driven by actin polymerization. Biophysical Journal. 71 (6), 3030-3045 (1996).
- Mogilner, A., Oster, G. Force Generation by Actin Polymerization II: The Elastic Ratchet and Tethered Filaments. Biophysical Journal. 84 (3), 1591-1605 (2003).
- Pollard, T. D., Borisy, G. G. Cellular Motility Driven by Assembly and Disassembly of Actin Filaments. Cell. 112 (4), 453-465 (2003).
- Wu, C., et al. Arp2/3 is critical for lamellipodia and response to extracellular matrix cues but is dispensable for chemotaxis. Cell. 148 (5), 973-987 (2012).
- Steffen, A., et al. Rac function is crucial for cell migration but is not required for spreading and focal adhesion formation. Journal of cell science. 126, 4572-4588 (2013).
- Gupton, S. L., et al. Cell migration without a lamellipodium. The Journal of Cell Biology. 168 (4), 619-631 (2005).
- Dimchev, V., et al. Induced Arp2/3 Complex Depletion Increases FMNL2/3 Formin Expression and Filopodia Formation. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 634708 (2021).
- Leithner, A., et al. Diversified actin protrusions promote environmental exploration but are dispensable for locomotion of leukocytes. Nature cell biology. 18 (11), 1253-1259 (2016).
- Giannone, G., Dubin-Thaler, B. J., Döbereiner, H. -. G., Kieffer, N., Bresnick, A. R., Sheetz, M. P. Periodic Lamellipodial Contractions Correlate with Rearward Actin Waves. Cell. 116 (3), 431-443 (2004).
- Dubin-Thaler, B. J., et al. Quantification of Cell Edge Velocities and Traction Forces Reveals Distinct Motility Modules during Cell Spreading. PLoS ONE. 3 (11), 3735 (2008).
- Suraneni, P., Rubinstein, B., Unruh, J. R., Durnin, M., Hanein, D., Li, R. The Arp2/3 complex is required for lamellipodia extension and directional fibroblast cell migration. The Journal of cell biology. 197 (2), 239-251 (2012).
- Wang, C., et al. Deconvolution of subcellular protrusion heterogeneity and the underlying actin regulator dynamics from live cell imaging. Nature Communications. 9 (1), 1688 (2018).
- Dimchev, G., et al. Lamellipodin tunes cell migration by stabilizing protrusions and promoting adhesion formation. Journal of cell science. 133 (7), 239020 (2020).
- Burnette, D. T., et al. A role for actin arcs in the leading-edge advance of migrating cells. Nature cell biology. 13 (4), 371-381 (2011).
- Yamada, K. M., Kennedy, D. W. Dualistic nature of adhesive protein function: fibronectin and its biologically active peptide fragments can autoinhibit fibronectin function. The Journal of Cell Biology. 99 (1), 29-36 (1984).
- Cai, Y., et al. Nonmuscle Myosin IIA-Dependent Force Inhibits Cell Spreading and Drives F-Actin Flow. Biophysical Journal. 91 (10), 3907-3920 (2006).
- Humphries, M. J. Cell adhesion assays. Molecular Biotechnology. 18 (1), 57-61 (2001).
- Cavalcanti-Adam, E. A., Volberg, T., Micoulet, A., Kessler, H., Geiger, B., Spatz, J. P. Cell Spreading and Focal Adhesion Dynamics Are Regulated by Spacing of Integrin Ligands. Biophysical Journal. 92 (8), 2964-2974 (2007).
- Dubin-Thaler, B. J., Giannone, G., Döbereiner, H. -. G., Sheetz, M. P. Nanometer Analysis of Cell Spreading on Matrix-Coated Surfaces Reveals Two Distinct Cell States and STEPs. Biophysical Journal. 86 (3), 1794-1806 (2004).
- Gauthier, N. C., Fardin, M. A., Roca-Cusachs, P., Sheetz, M. P. Temporary increase in plasma membrane tension coordinates the activation of exocytosis and contraction during cell spreading. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (35), 14467-14472 (2011).
- Wolfenson, H., Iskratsch, T., Sheetz, M. P. Early Events in Cell Spreading as a Model for Quantitative Analysis of Biomechanical Events. Biophysical Journal. 107 (11), 2508-2514 (2014).
- Guan, J. -. L., Berrier, A. L., LaFlamme, S. E. Cell Migration, Developmental Methods and Protocols. Methods in molecular biology. 294, 55-68 (2004).
- Raucher, D., et al. Phosphatidylinositol 4,5-Bisphosphate Functions as a Second Messenger that Regulates Cytoskeleton-Plasma Membrane Adhesion. Cell. 100 (2), 221-228 (2000).
- Machacek, M., Danuser, G. Morphodynamic Profiling of Protrusion Phenotypes. Biophysical Journal. 90 (4), 1439-1452 (2006).
- Zack, G. W., Rogers, W. E., Latt, S. A. Automatic measurement of sister chromatid exchange frequency. The journal of histochemistry and cytochemistry official journal of the Histochemistry Society. 25 (7), 741-753 (1977).
- Bardsley, W. G., Aplin, J. D. Kinetic analysis of cell spreading. I. Theory and modelling of curves. Journal of cell science. 61, 365-373 (1983).
