Et citizen science-prosjekt ble designet for å rekruttere innbyggere i San Diego til å samle inn miljøprøver for SARS-CoV-2. En flerspråklig nettbasert plattform ble opprettet for datainnsending ved hjelp av et brukervennlig grensesnitt for mobilenheter. Et laboratorieinformasjonsstyringssystem la til rette for innsamling av tusenvis av geografisk mangfoldige prøver med resultatsporing i sanntid.
For å kontrollere samfunnsoverføringen av alvorlig akutt respiratorisk syndrom coronavirus 2 (SARS-CoV-2) under den globale pandemien i 2020, implementerte de fleste land strategier basert på direkte menneskelig testing, ansiktsbelegg og overflatedesinfeksjon. Under forutsetning av at hovedveien for overføring inkluderer aerosoler og respiratoriske dråper, har arbeidet med å oppdage SARS-CoV-2 i fomitter fokusert på steder mistenkt for høy prevalens (f.eks. sykehusavdelinger, cruiseskip og massetransportsystemer). For å undersøke tilstedeværelsen av SARS-CoV-2 på overflater i bymiljøet som sjelden rengjøres og sjelden desinfiseres, ble 350 borgere vervet fra det større San Diego County. Totalt samlet disse borgerforskerne inn 4080 prøver. En online plattform ble utviklet for å overvåke levering og henting av prøvetakingssett, samt for å samle inn prøvedata. Prøvetakingssettene ble for det meste bygget av forsyninger tilgjengelig i pandemistresset butikker. Prøver ble behandlet ved hjelp av reagenser som var enkle å få tilgang til til tross for den tilbakevendende forsyningsmangelen. Metodene som ble brukt var svært følsomme og motstandsdyktige mot inhibitorer som ofte er til stede i miljøprøver. De foreslåtte eksperimentelle design- og prosesseringsmetodene lyktes med å engasjere mange borgerforskere som effektivt samlet prøver fra forskjellige overflateområder. Arbeidsflyten og metodene som er beskrevet her er relevante for å kartlegge bymiljøet for andre virus, som er av folkehelsehensyn og utgjør en trussel for fremtidige pandemier.
SARS-CoV-2 antas å hovedsakelig overføres via innånding av forurensede aerosoler og dråper fra direkte kontakt med infiserte personer1,2,3,4. I de første fasene av den globale COVID-19-pandemien fokuserte imidlertid arbeidet med å kontrollere overføringen av SARS-CoV-2 sterkt på desinfisering av overflater, håndvask og desinfisering. Ved utgangen av 2020, overføringsretningslinjer fra Verdens helseorganisasjon (WHO)5 og U.S. Centers for Disease Control and Prevention (CDC)6 anses luftbåren overføring en fare hovedsakelig når de er i nær kontakt (<2 m) med en smittet person eller i nærvær av aerosolgenererende medisinske prosedyrer. Selvinokulering etter kontakt med forurensede overflater eller innånding av aerosoliserte fomitter er ennå ikke utelukket som en overføringsvei for SARS-CoV-2.
COVID-19 tilfeller har blitt rapportert der luftbåren overføring virker usannsynlig7,8. SARS-CoV-2 virioner forblir smittsomme på kobber i opptil 8 timer, på papp og rustfritt stål i opptil 24 timer, og på plast i opptil 48 timer9. I cruiseskipshytter ble SARS-CoV-2 RNA oppdaget 17 dager etter at passasjerene hadde gått7. Luft- og overflateprøver fra sykehus og massetransittsystemer har testet positivt for SARS-CoV-2 og andre koronavirus8,10,11,12,13,14. En studie utført på den ytre emballasjen av Halloween-godteri håndtert av asymptomatiske og moderate / mildt symptomatiske COVID-19-pasienter, konkluderte med at kombinasjonen av håndvask av håndtereren og vasking av godteri med håndsåpe reduserte SARS-CoV-2 RNA til under terskelnivåer15.
Flere metoder for SARS-CoV-2-diagnostikk er publisert basert på sanntids omvendt transkripsjonspolymerasekjedereaksjon (RT-qPCR)16,17, omvendt transkripsjonssløyfemediert isotermisk forsterkning (RT-LAMP)11,18,19,20,21og CRISPR-Cas-teknologier18,19,22,22 , 22 , 23. De fleste krever RNA-ekstraksjonssett som ofte er mangelvare i perioder med betydelig global etterspørsel, og svært få har blitt brukt til miljøscreening av viruset24. Påvisning av SARS-CoV-2 RNA ved bruk av RT-LAMP har vist seg å være over 83% konkordans til bruk av RT-qPCR. Videre resulterte RT-LAMP i 25% reduksjon i inkonklusive resultater sammenlignet med RT-qPCR15.
RT-LAMP er en enkel teknikk som bruker en omvendt transkripsjon for å syntetisere cDNA fra en RNA-mal25, etterfulgt av en DNA-polymerase med sterk strandforskyvningsaktivitet som syntetiserer DNA ved konstant temperatur (dvs. isotermisk forsterkning)26. Høyere spesifisitet av viral genomdeteksjon oppnås ved å bruke fire eller seks primere som gjenkjenner seks eller åtte regioner av mål-DNA. Forsterkning er initiert fra en intern primer og gir en semi-dobbeltstrenget DNA-struktur. Den ledende tråden forsterkes deretter av en ytre primer. Disse forsterkningene gjentas for de omvendte primerne. Interne og ytre primere i begge ender har et internt omvendt selv komplementært område som danner en løkke i forsterkningsproduktet26,27. I isotermisk strandforskyvning genererer asynkron DNA-syntese høye mengder forsterket produkt der kontinuerlig polymerisering forsterker signalet på så få som 10 kopier per reaksjon11,20,28. Den kolorimetriske RT-LAMP-blandingen er svakt bufret og bruker fenolrød som pH-indikator. Som polymerase inkorporerer et nukleotid, frigjør det en proton, og nok protoner vil endre pH i løsningen samt fargen fra rosa til gul11,20,28,29.
RT-LAMP ble utviklet for påvisning av myggbårne sykdommer i perifere helseinstitusjoner som mangler fullt utstyrte laboratorier25 og for rask påvisning av andre RNA-virus som humant immunsviktvirus30. De mest sårbare populasjonene i epidemiske utbrudd – i henhold til WHO-definisjonen – mangler ofte tilstrekkelige økonomiske ressurser og riktig utstyr til å utføre deteksjon (FNs globale folkehelseagenda). I den nåværende SARS-CoV-2-pandemien har forsyninger som vattpinner og reagenser av medisinsk kvalitet for RNA-ekstraksjonssett ikke vært i stand til å møte global etterspørsel, spesielt i ikke-produksjonsland. Den foreslåtte protokollen brukte en guanidinium thiocyanate (GITC)-basert råolje RNA-ekstraksjon, som effektivt bevarte RNA på en kaldkjedet uavhengig måte og reduserte utholdenheten til inhibitorer fra prøven betydelig. Videre er GITC-kloroformutvinningsprotokollen basert på separasjon av RNA fra DNA og proteiner etterfulgt av den respektive nedbøren, slik at utvinning av det meste av det genetiske materialet. Disse fordelene oppveier de potensielle farene ved at borgerforskere håndterer kjemikaliet hvis det iverksettes tiltak for å informere dem om risikoen på riktig måte.
Den foreslåtte arbeidsflyten bruker materialer og reagenser som er til generell bruk. Det krever utstyr som er tilgjengelig i grunnleggende, ofte landlige, laboratoriemiljøer. Disse metodene er billige, svært motstandsdyktige mot inhibitorer som ofte finnes i miljøprøver eller prøver som ikke kan behandles med ekstraksjonssett, og eliminerer behovet for en høypresisjons termosykler. Denne studien presenterer en rørledning for prøvetaking og påvisning av SARS-CoV-2 fra miljøreservoarer på ofte berørte og sjelden desinfiserte overflater av husholdninger og bymiljøet.
Borgerforskerens engasjement. Borgerforskere ble rekruttert til vattpinneflater i hele San Diego County for å prøve og oppdage tilstedeværelsen av SARS-CoV-2 i bymiljøet. De fleste leverte prøvetakingssett (70 %) ble returnert til laboratoriet, og av disse var nesten alle prøver fullført (91%) (Figur 3A,B og Tabell 4). Frivillige kan enkelt be om levering/henting av sett gjennom den nettbaserte plattformen, og programvaren for planlegging av leveringsrute varslet borgerforskere om estimerte ankomsttider, begge sannsynligvis betydelige faktorer for den observerte suksessen. Gjennomsnittstiden fra da settet ble levert til borgerforskeren til da det ble returnert til laboratoriet var 8 dager, med en median på 3 dager og en rekkevidde på 1-64 dager (Figur 3A og Tabell 4). Hyppigere påminnelser til frivillige vil sannsynligvis redusere denne forsinkelsen.
Datainnsamlingsplattformen ble vellykket brukt av et stort flertall av brukerne (73%) (Tabell 4). Mens innsatsen til borgerforskerne ikke ble målt, viste felttester at datainnsamlingsplattformen reduserte innsatsen og tiden som kreves for å fullføre prøveinnsamlingen betydelig. Dermed oppmuntret reduksjon av mengden bokføring borgerforskerengasjement. Den nettbaserte plattformen hadde til hensikt å overvinne demografiske begrensninger ved å tilby en flerspråklig nevral maskinoversettelsestjeneste og ved å tilby grafiske og audiovisuelle protokoller på engelsk og spansk. Dette var bare delvis vellykket ettersom færre prøver ble samlet inn fra både South Bay og North County hvor det meste av fylkets latinamerikanske / latino befolkning bor45. Disse områdene inneholdt også 63% (1700 tilfeller per 100,000) av de totale COVID-19-tilfellene i San Diego County med høyest utbredelse av sykdommen46 og sykehusinnleggelser (62%)47,48. Selv om de fleste prøvene kom fra Central County, ble det samlet inn et representativt antall fra de mest COVID-19-berørte distriktene, og bare en liten brøkdel av prøvene var positive, noe som tyder på at overflatereservoarene til SARS-CoV-2 i bymiljøet er relativt sjeldne.
Eksempelbehandling. Prøvetaking av vattpinner ble fuktet med SDS, som inaktiverte viruset ved å forstyrre konvolutten og stabiliserte den nakne RNA ved å utfolde RNases32. Praktisk under oppsamlingen renset vaskemiddelet i vattpinnen den prøvede overflaten. Miljøprøver inneholder ofte svært små mengder RNA. For å maksimere utvinningen ble RNA-isolasjon utført ved hjelp av en GITC-basert, kolonnefri, rå utvinningsmetode. GITC, et sterkt chaotropisk middel, forstyrrer hydrogenbindingene som opprettholder proteinfolding (dvs. hydrofob effekt). Denne handlingen resulterer i inaktivering av viruspartikler, og RNA forblir stabil på grunn av hemming av RNAses34,35,36. GITC-løsningen opprettholdt stabiliteten til RNA-prøvene uten strenge hensyn i kjølekjeden, noe som gjorde det mulig for innbyggerne å opprettholde prøvene ved romtemperatur hvis en fryser for de medfølgende ispakkene ikke var tilgjengelig. For å redusere den potensielle faren dette reagenset utgjør når direkte hud- eller slimhinnekontakt oppstår, ble innbyggerne gjort oppmerksomme på disse risikoene ved å inkludere et materiell sikkerhetsdatablad som er gitt i settet, og en advarselsforsegling ble plassert i esken som inneholder rørene.
Den rå GITC-kloroformutvinningsmetoden hjalp til med å gjenopprette spor av RNA fra vattpinnene, og som vist ved forsterkning av spikede prøver, fortsatte inhibitorer sjelden i prøvene etter utvinning. Prøver, som var negative for SARS-CoV-2 og ikke viste noen RT-LAMP-hemming, representerte sanne negativer eller hadde et lavere kopinummer enn LOD med 100% frekvens. Omvendt innebærer påvisning av viral RNA på en overflate ikke direkte risiko for overføring gjennom kontakt, da virusets infektivitet fra positive prøver må testes. Rask screening av miljøet, ikke begrenset av tilgjengeligheten av sofistikerte forsyninger eller høyt kvalifisert personell, er avgjørende for å vurdere om overflater utgjør et viralt reservoar og for bedre direkte forebygging og inneslutning.
RT-LAMP ble valgt for å være den beste metoden som passer for den foreslåtte deteksjonsrørledningen. Det viste seg å være en rask og billig metode som var svært motstandsdyktig mot de fleste av de gjenværende inhibitorene og like følsomme og spesifikke som andre RT-qPCR-metoder. På grunn av deres bruk i kliniske omgivelser under SARS-CoV-2-pandemien, ble tilgjengeligheten av RT-qPCR-sett påvirket av global etterspørsel. Videre var RT-qPCR-teknikker – selv de som er formulert for å motstå inhibitorer – følsomme for stoffer som finnes i miljøprøvene samlet inn av en pilotkohort av borgerforskere, selv etter bruk av andre vanlige strategier for å redusere hemmerkonkurransen for enzymbinding49. Disse funnene er bekreftet av en nylig studie som sammenlignet begge metodene for å oppdage SARS-CoV-2 på vattpinneprøver fra godteri håndtert av COVID-19-pasienter og fant over 83% resultatkonkordans, med 25% lavere hemming i prøver analysert av RT-LAMP15. Videre reduserte GITC-kloroform råoljeutvinning, kombinert med RT-LAMP, kostnadene for reagenser og forsyninger med 42% sammenlignet med RNA-kit ekstraksjon og RT-qPCR (Materialliste).
Denne metoden tillot høy gjennomstrømningsanalyse av tusenvis av overflatepinneprøver. Opptil 80 bassenger, som representerer 640 prøver, ble behandlet på 2 dager fra RNA-ekstraksjon til SARS-CoV-2-deteksjon av RT-LAMP. Den foreslåtte protokollen er semikantiv, begrenset til påvisning av viral RNA, og indikerer ikke tilstedeværelsen av infektive viruspartikler. Videre analyse er nødvendig for å vurdere risikoen for overføring av SARS-CoV-2 fra infiserte fomitter tilstede på de vattlagte overflatene.
Denne studien presenterer en protokoll for raskt å sette opp en teststrategi som inkluderer en effektiv arbeidsflyt når du står overfor en helsekrise med en smittsom sykdom. Den foreslåtte prøvetakingsprotokollen er enkel og bruker forsyninger som vanligvis finnes i husholdninger, og virusdeteksjonsmetoden utføres på utstyr som er tilgjengelig i grunnleggende laboratorieinnstillinger som et vannbad i stedet for en termocycler. Kostnadene for RT-LAMP-reagenser er betydelig lavere enn de som trengs for RT-qPCR og mindre utsatt for scenarier med høy global etterspørsel. Denne studien fungerer som et rammeverk for vurdering av miljømessige virale reservoarer i fremtidige epidemiutbrudd og globale pandemier.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Etterforskerne av Viral Information Institute (VII), Dr. Anca M. Segall, Willow Segall, Patricia L. Rohwer, Gary Rohwer, Cary L. Rohwer, Magda Silvia Pinetta, Elizabeth Cruz Cano, Dr. Gregory Peters, Dr. Stuart A. Sandin og Dr. Jennifer Smith for å ha tatt seg tid til å samle inn mange prøver. Vi takker også Dr. Rob Knight, Dr. Jack Gilbert, Dr. Pedro Balda-Ferre og Dr. Sarah Allard fra barneavdelingen ved School of Medicine University of San Diego California (UCSD) for å legge til rette for positive kontroller og nyttige tilbakemeldinger. Vi takker Stacey Carota (SDSU College of Sciences) og Gina Spidel (SDSU) for logistisk støtte og Juan Rodríguez for kunsten og den grafiske utformingen av prøvetakingsprotokollen. Vi takker alle deltakere for deres engasjement og engasjement for dette prosjektet i svært vanskelige tider. Dette arbeidet ble støttet av en sjenerøs donasjon fra Dr. Jo Ann Lane (SDSU College of Sciences) og National Science Foundation RAPID: Environmental Reservoirs of SARS-CoV-2 grant (Award Number: 2030479).
SMP, LIMS, and community outreach: | |||
Authentication Application Programming Interface | Google Sign-In | ||
Commercial hosting platform | GoDaddy | ||
Data Charting Application Programming Interface | Google Charts | ||
Database software | MySQL | ||
Delivery route planning software | Circuit | Circuit for Teams | |
Free email service | Google Email | ||
Geospatial Application Programming Interface | Google Maps API | ||
Multilingual neural machine translation service | Google Translate | ||
Online form | Google Form | ||
Operating system | Linux | ||
Web and database development | Big Rose Web Design | ||
Web server software | Apache | ||
Sampling kit: | |||
Coolers | Coleman (Amazon) | B00363X3F2 | Cost (US$) per 100 rxns: 70 |
Gallon Ziploc bags | Solimo (Amazon) | B07BJ495GL | Cost (US$) per 100 rxns: 18 |
Glycerol (hand sanitizer) | FischerScientific | G33-4 | Cost (US$) per 100 rxns: 9 |
Ice packs | Ice-Brix (Amazon) | B075GLD3X1 | Cost (US$) per 100 rxns: 110 |
Isopropanol (hand sanitizer) | FischerScientific | AA36644K7 | Cost (US$) per 100 rxns: 43 |
KN95 masks | Echo-Sigma | Echo-Sigma | Cost (US$) per 100 rxns: 400 |
Paper for Protocols and Trizol Safety Sheet | Office Depot | 348037 | Cost (US$) per 100 rxns: 36 |
30 mL spray bottles (SDS and hand sanitizer) | Anyumocz (Amazon) | B07T64FHXR | Cost (US$) per 100 rxns: 80 |
RNase, DNase, DNA & PCR inhibitors free Microcentrifuge tubes | Genesee Scientific | 22-281 | Cost (US$) per 100 rxns: 83 |
Sample ID solvent resistant labels | LABTAG | XST-10C1-1WH | Cost (US$) per 100 rxns: 68 |
Swiffer WetJet pads (swabs) | Swiffer (Amazon) | B001F0RBT2 | Cost (US$) per 100 rxns: 8 |
Toothpicks | Kitchen Essential (Amazon) | B00PBK4NG6 | Cost (US$) per 100 rxns: 8 |
Trizol Reagent (guanidinium isothiocyanate solution – GITC), not LS | Invitrogen | 15596018 | Cost (US$) per 100 rxns: 40 |
Tube boxes | Genesee Scientific | 21-119 | Cost (US$) per 100 rxns: 180 |
Small Ziploc bags | Ziploc (Amazon) | B01LRKEI9K | Cost (US$) per 100 rxns: 8 |
Zebra Thermal Transfer Desktop Printer | Zebra | GK420t | |
Total Sampling kit Cost (US$) per 100 rxns: 1,160 | |||
Trizol RNA extraction: | |||
Ammonium Acetate RNase-free | Invitrogen | AM9070G | Cost (US$) per 100 rxns: 2 |
Chloroform | FisherScientific | C298-500 | Cost (US$) per 100 rxns: 2 |
GlycoBlue (glycogen 15 mg/mL) | Invitrogen | AM9515 | Cost (US$) per 100 rxns: 80 |
Molecular-grade absolute (200 proof) Ethanol | FisherScientific | BP2818500 | Cost (US$) per 100 rxns: 30 |
Molecular-grade Isopropanol | FisherScientific | BP2618500 | Cost (US$) per 100 rxns: 3 |
TURBO DNA-free Kit | Invitrogen | AM1907 | Cost (US$) per 100 rxns: 110 |
Multiplexed colorimetric RT-LAMP: | |||
Guanidine Hydrochloride | Alfa Aesar | AAJ6548522 | Cost (US$) per 100 rxns: 1 |
RT-LAMP E1-Primers | IDT | n/a | Cost (US$) per 100 rxns: 7 |
RT-LAMP N2-Primers | IDT | n/a | Cost (US$) per 100 rxns: 7 |
Synthetic SARS-CoV-2 RNA | ATCC | VR-3276SD | Cost (US$) per 100 rxns: 14 |
WarmStart Colorimetric LAMP 2X Master Mix with UDG | NEB | M1800S | Cost (US$) per 100 rxns: 210 |
Eppendorf Mastercycler Pro Thermal Cycler | Eppendorf | 950030010 | |
Total Trizol RNA extraction + LAMP Cost (US$) per 100 rxns: 470 | |||
Kit for RNA extraction: | |||
QIAamp DSP Viral RNA Mini Kit | Qiagen | 61904 | Cost (US$) per 100 rxns: 570 |
RT-qPCR: | |||
Synthetic SARS-CoV-2 RNA | ATCC | VR-3276SD | Cost (US$) per 100 rxns: 14 |
TaqMan Fast Virus 1-Step Master Mix | Applied Biosystems | 4444432 | Cost (US$) per 100 rxns: 180 |
SARS-CoV-2 (2019-nCoV) N1,N2 Primers and Probes | IDT | 10006713 | Cost (US$) per 100 rxns: 20 |
qScript XLT 1-Step RT-qPCR ToughMix | Quantabio | 95132-100 | |
QuantiNova Pathogen | Qiagen | 208652 | |
QuantiNova Probe | Qiagen | 208352 | |
UltraPlex 1-Step ToughMix | Quantabio | 95166-100 | |
CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System | BioRad | 1855196 | |
Kit for RNA extraction + RT-qPCR Cost (US$) per 100 rxns: 790 | |||
RT-PCR: | |||
SuperScript IV One-Step RT-PCR | Invitrogen | 12594025 | |
Lab cleanup: | |||
DNAZap | Invitrogen | AM9890 | |
RNAZap | Invitrogen | AM9780 |