Un proyecto de ciencia ciudadana fue diseñado para reclutar residentes de San Diego para recolectar muestras ambientales para el SARS-CoV-2. Se creó una plataforma multilingüe basada en la web para el envío de datos utilizando una interfaz de dispositivo móvil fácil de usar. Un sistema de gestión de la información de laboratorio facilitó la recolección de miles de muestras geográficamente diversas con seguimiento de resultados en tiempo real.
Para controlar la transmisión comunitaria del coronavirus 2 del síndrome respiratorio agudo severo (SARS-CoV-2) durante la pandemia mundial de 2020, la mayoría de los países implementaron estrategias basadas en pruebas directas en humanos, cobertura facial y desinfección de superficies. Bajo el supuesto de que la principal vía de transmisión incluye aerosoles y gotitas respiratorias, los esfuerzos para detectar el SARS-CoV-2 en fómites se han centrado en lugares sospechosos de alta prevalencia (por ejemplo, salas de hospitales, cruceros y sistemas de transporte masivo). Para investigar la presencia de SARS-CoV-2 en superficies en el entorno urbano que rara vez se limpian y rara vez se desinfectan, se alistó a 350 ciudadanos del condado de San Diego. En total, estos científicos ciudadanos recogieron 4.080 muestras. Se desarrolló una plataforma en línea para monitorear la entrega y recogida de kits de muestreo, así como para recopilar datos de muestras. Los kits de muestreo se construyeron en su mayoría a partir de suministros disponibles en tiendas con estrés pandémico. Las muestras se procesaron utilizando reactivos de fácil acceso a pesar de la escasez recurrente de suministros. Los métodos utilizados fueron altamente sensibles y resistentes a los inhibidores que están comúnmente presentes en muestras ambientales. El diseño experimental propuesto y los métodos de procesamiento tuvieron éxito en la participación de numerosos científicos ciudadanos que efectivamente recogieron muestras de diversas áreas de superficie. El flujo de trabajo y los métodos descritos aquí son relevantes para estudiar el entorno urbano en busca de otros virus, que son de interés para la salud pública y representan una amenaza para futuras pandemias.
Se cree que el SARS-CoV-2 se transmite principalmente a través de la inhalación de aerosoles y gotitas contaminados por contacto directo con individuos infectados1,2,3,4. Sin embargo, durante las fases iniciales de la pandemia mundial de COVID-19, los esfuerzos para controlar la transmisión del SARS-CoV-2 se centraron fuertemente en la desinfección de superficies, el lavado de manos y la desinfección. Para finales de 2020, las pautas de transmisión de la Organización Mundial de la Salud (OMS)5 y los Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades (CDC)6 de Estados Unidos consideraron que la transmisión en el aire era un peligro principalmente cuando se está en contacto cercano (<2 m) con una persona infectada o en presencia de procedimientos médicos generadores de aerosoles. La autoin inoculación después del contacto con superficies contaminadas o la inhalación de fómites aerosolizados aún no se han descartado como una vía de transmisión del SARS-CoV-2.
Se han reportado casos de COVID-19 en los que la transmisión aérea parece poco probable7,8. Los viriones del SARS-CoV-2 permanecen infecciosos en el cobre hasta 8 h, en el cartón y el acero inoxidable hasta 24 h, y en el plástico hasta 48 h9. En las cabinas de los cruceros, el ARN del SARS-CoV-2 se detectó 17 días después de que los pasajeros hubieran partido7. Muestras de aire y superficie de hospitales y sistemas de transporte masivo han dado positivo para SARS-CoV-2 y otros coronavirus8,10,11,12,13,14. Un estudio realizado en el embalaje exterior de caramelos de Halloween manejados por pacientes de COVID-19 asintomáticos y moderadamente/levemente sintomáticos, concluyó que la combinación de lavado de manos por parte del manipulador y lavado de los dulces con jabón de manos redujo el ARN del SARS-CoV-2 por debajo de los niveles umbral15.
Se han publicado varios métodos para el diagnóstico del SARS-CoV-2 basados en la reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa en tiempo real(RT-qPCR)16,17,la amplificación isotérmica mediada por bucle de transcripción inversa (RT-LAMP)11,18,19,20,21y las tecnologías CRISPR-Cas18,19,22,23. La mayoría requieren kits de extracción de ARN que a menudo escasean durante los períodos de demanda mundial significativa, y muy pocos se han utilizado para la detección ambiental del virus24. Se ha demostrado que la detección de ARN del SARS-CoV-2 mediante RT-LAMP es más del 83% concordante con el uso de RT-qPCR. Además, RT-LAMP dio lugar a una reducción del 25% en los resultados no concluyentes en comparación con RT-qPCR15.
RT-LAMP es una técnica sencilla que utiliza una transcriptasa inversa para sintetizar ADNc a partir de una plantilla de ARN25,seguida de una ADN polimerasa con fuerte actividad de desplazamiento de hebras que sintetiza ADN a temperatura constante (es decir, amplificación isotérmica)26. Una mayor especificidad de la detección del genoma viral se logra mediante el uso de cuatro o seis cebadores que reconocen seis u ocho regiones del ADN objetivo. La amplificación se inicia a partir de un cebador interno y produce una estructura de ADN semi-doble cadena. La hebra principal es entonces amplificada por una imprimación externa. Estas amplificaciones se repiten para los cebadores inversos. Los cebadores internos y externos en cada extremo tienen un sitio auto-complementario inverso interno que forma un bucle en el producto de amplificación26,27. En el desplazamiento de hebra isotérmica, la síntesis asíncrona de ADN genera altas cantidades de producto amplificado donde la polimerización continua amplifica la señal de tan solo 10 copias por reacción11,20,28. La mezcla colorimétrica RT-LAMP está débilmente tamponada y utiliza el rojo fenol como indicador de pH. Como la polimerasa incorpora un nucleótido, libera un protón, y suficientes protones cambiarán el pH de la solución así como su color de rosa a amarillo11,20,28,29.
RT-LAMP fue desarrollado para la detección de enfermedades transmitidas por mosquitos en centros de salud periféricos que carecen de laboratorios totalmente equipados25 y para la detección rápida de otros virus ARN como el virus de inmunodeficiencia humana30. Las poblaciones más vulnerables en los brotes epidémicos —según la definición de la OMS— a menudo carecen de recursos económicos suficientes y del equipo adecuado para llevar a cabo la detección (Programa mundial de salud pública de las Naciones Unidas). En la actual pandemia de SARS-CoV-2, los suministros como hisopos de grado médico y reactivos para kits de extracción de ARN no han podido satisfacer la demanda mundial, especialmente en los países no manufactureros. El protocolo propuesto utilizó una extracción de ARN crudo basada en tiocianato de guanidinio (GITC), que preservó eficazmente el ARN de una manera independiente de la cadena de frío y redujo significativamente la persistencia de los inhibidores de la muestra. Además, el protocolo de extracción gitc-cloroformo se basa en la separación del ARN del ADN y las proteínas seguida de la precipitación respectiva, lo que permite la recuperación de la mayor parte del material genético. Estas ventajas superan los peligros potenciales de los científicos ciudadanos que manipulan el producto químico si se toman medidas para informarles adecuadamente de los riesgos.
El flujo de trabajo propuesto utiliza materiales y reactivos que son de uso general. Requiere equipos que estén disponibles en entornos de laboratorio básicos, a menudo rurales. Estos métodos son baratos, altamente resistentes a los inhibidores que a menudo se encuentran en muestras ambientales o muestras que no se pueden procesar con kits de extracción, y eliminan la necesidad de un termociclador de alta precisión. Este estudio presenta una tubería para el muestreo y la detección del SARS-CoV-2 de reservorios ambientales en superficies comúnmente tocadas y raramente desinfectadas de los hogares y el medio ambiente urbano.
Participación ciudadana científica. Científicos ciudadanos fueron reclutados para hisopar superficies en todo el condado de San Diego para muestrear y detectar la presencia de SARS-CoV-2 en el entorno urbano. La mayoría de los kits de muestreo entregados (70%) fueron devueltas al laboratorio, y de ellas, casi todas las muestras estaban completas (91%) (Figura 3A, B y Cuadro 4). Los voluntarios podían solicitar fácilmente la entrega/recogida de kits a través de la plataforma basada en la web, y el software de planificación de rutas de entrega notificaba a los científicos ciudadanos los tiempos estimados de llegada, ambos factores probablemente significativos para el éxito observado. El tiempo promedio desde que se entregó el kit al científico ciudadano hasta que fue devuelto al laboratorio fue de 8 días, con una mediana de 3 días y un rango de 1-64 días (Figura 3A y Tabla 4). Recordatorios más frecuentes a los voluntarios probablemente reducirían este tiempo de retraso.
La plataforma de recopilación de datos fue utilizada con éxito por una gran mayoría de los usuarios (73%) (Cuadro 4). Si bien no se midieron los esfuerzos de los científicos ciudadanos, las pruebas de campo mostraron que la plataforma de recopilación de datos redujo significativamente el esfuerzo y el tiempo necesarios para completar adecuadamente la recolección de muestras. Por lo tanto, la reducción de la cantidad de contabilidad alentó la participación de los científicos ciudadanos. La plataforma basada en la web pretendía superar las limitaciones demográficas proporcionando un servicio de traducción automática neuronal multilingüe y proporcionando protocolos gráficos y audiovisuales en inglés y español. Esto fue solo parcialmente exitoso, ya que se recolectaron menos muestras tanto del Condado de South Bay como del Condado norte, donde reside la mayoría de la población hispana / latina del condadocon 45 años. Estas áreas también albergaban el 63% (1,700 casos por cada 100,000) del total de casos de COVID-19 en el condado de San Diego con la prevalencia más alta de la enfermedad46 y la tasa de hospitalizaciones (62%)47,48. Aunque la mayoría de las muestras provinieron del Condado Central, se recogió un número representativo de los distritos más afectados por COVID-19 y solo una pequeña fracción de las muestras fue positiva, lo que sugiere que los reservorios superficiales de SARS-CoV-2 en el entorno urbano son relativamente raros.
Procesamiento de muestras. Los hisopos de muestreo se humedecieron con SDS, que inactivaron el virus al interrumpir su envoltura y estabilizaron el ARN desnudo mediante el despliegue de RNases32. Convenientemente durante la recolección, el detergente en el hisopo limpió la superficie muestreada. Las muestras ambientales a menudo contienen cantidades muy pequeñas de ARN. Para maximizar la recuperación, el aislamiento del ARN fue realizado usando gitc-basado, columna-libre, método crudo de la extracción. GITC, un fuerte agente caotrópico, interrumpe los enlaces de hidrógeno que mantienen el plegamiento de proteínas (es decir, efecto hidrofóbico). Esta acción da lugar a la inactivación de partículas virales, y el ARN permanece estable debido a la inhibición de las ARN34,35,36. La solución GITC mantuvo la estabilidad de las muestras de ARN sin consideraciones estrictas de cadena de frío, lo que permitió a los ciudadanos mantener las muestras a temperatura ambiente si no se disponía de un congelador para las bolsas de hielo proporcionadas. Para reducir el peligro potencial que este reactivo representa cuando se produce un contacto directo con la piel o la mucosa, los ciudadanos fueron informados de estos riesgos mediante la inclusión de una hoja de datos de seguridad del material proporcionada en el kit y se colocó un sello de advertencia en la caja que contiene los tubos.
El método crudo de extracción de GITC-cloroformo ayudó a la recuperación de rastros de ARN de los hisopos, y como se muestra en la amplificación de muestras con picos, los inhibidores rara vez persistieron en las muestras después de la extracción. Las muestras, que fueron negativas para el SARS-CoV-2 y no mostraron inhibición de RT-LAMP, representaron verdaderos negativos o tuvieron un número de copias más bajo que el LOD con una frecuencia del 100%. Por el contrario, la detección de ARN viral en una superficie no implica directamente el riesgo de transmisión a través del contacto, ya que es necesario analizar la infectividad del virus a partir de muestras positivas. La detección rápida del medio ambiente, no limitada por la disponibilidad de suministros sofisticados o personal altamente calificado, es crucial para evaluar si las superficies constituyen un reservorio viral y para dirigir mejor los esfuerzos de prevención y contención.
RT-LAMP fue seleccionado para ser el mejor método adecuado para la tubería de detección propuesta. Demostró ser un método rápido y barato que era altamente resistente a la mayoría de los inhibidores restantes y tan sensible y específico como otros métodos de RT-qPCR. Debido a su uso en entornos clínicos durante la pandemia de SARS-CoV-2, la disponibilidad de kits rt-qPCR se vio afectada por la demanda mundial. Además, las técnicas de RT-qPCR,incluso las formuladas para resistir a los inhibidores, eran sensibles a las sustancias contenidas en las muestras ambientales recogidas por una cohorte piloto de científicos ciudadanos, incluso después del uso de otras estrategias comunes para reducir la competencia de los inhibidores por la unión enzimática49. Estos hallazgos son corroborados por un estudio reciente que comparó ambos métodos para detectar sars-CoV-2 en muestras de hisopos de caramelos manejados por pacientes de COVID-19 y encontró más del 83% de concordancia de resultados, con un 25% menos de inhibición en muestras analizadas por RT-LAMP15. Además, la extracción de crudo GITC-cloroformo, junto con RT-LAMP, redujo el costo de los reactivos y suministros en un 42% en comparación con la extracción del kit de ARN y RT-qPCR (Tabla de Materiales).
Este método permitió el análisis de alto rendimiento de miles de muestras de hisopos superficiales. Hasta 80 piscinas, que representan 640 muestras, se procesaron en 2 días desde la extracción de ARN hasta la detección de SARS-CoV-2 por RT-LAMP. El protocolo propuesto es semicuantitativo, limitado a la detección de ARN viral, y no indica la presencia de partículas virales infecciosas. Se requieren análisis adicionales para evaluar el riesgo de transmisión del SARS-CoV-2 de los fómites infectados presentes en las superficies hisopadas.
Este estudio presenta un protocolo para establecer rápidamente una estrategia de pruebas que incluya un flujo de trabajo efectivo cuando se enfrenta a una emergencia de salud con una enfermedad transmisible. El protocolo de muestreo propuesto es simple y utiliza suministros que se encuentran comúnmente en los hogares, y el método de detección viral se lleva a cabo en equipos disponibles en entornos básicos de laboratorio, como un baño de agua en lugar de un termocicloador. Los costos de los reactivos RT-LAMP son significativamente más bajos que los necesarios para RT-qPCR y menos susceptibles a escenarios de alta demanda global. Este estudio sirve de marco para la evaluación de reservorios virales ambientales en futuros brotes epidémicos y pandemias mundiales.
The authors have nothing to disclose.
Agradecemos a los investigadores del Instituto de Información Viral (VII), la Dra. Anca M. Segall, Willow Segall, Patricia L. Rohwer, Gary Rohwer, Cary L. Rohwer, Magda Silvia Pinetta, Elizabeth Cruz Cano, el Dr. Gregory Peters, el Dr. Stuart A. Sandin y la Dra. Jennifer Smith por tomarse el tiempo para recolectar numerosas muestras. También agradecemos al Dr. Rob Knight, al Dr. Jack Gilbert, al Dr. Pedro Balda-Ferre y a la Dra. Sarah Allard del departamento de Pediatría de la Facultad de Medicina de la Universidad de San Diego California (UCSD) por facilitar controles positivos y comentarios útiles. Agradecemos a Stacey Carota (SDSU Facultad de Ciencias) y Gina Spidel (SDSU) por el apoyo logístico y a Juan Rodríguez por el arte y diseño gráfico del protocolo de muestreo. Agradecemos a todos los participantes su compromiso y dedicación a este proyecto en tiempos muy difíciles. Este trabajo fue apoyado por una generosa donación de la Dra. Jo Ann Lane (SDSU College of Sciences) y la fundación nacional de ciencias RAPID: Environmental Reservoirs of SARS-CoV-2 grant (Número de premio: 2030479).
SMP, LIMS, and community outreach: | |||
Authentication Application Programming Interface | Google Sign-In | ||
Commercial hosting platform | GoDaddy | ||
Data Charting Application Programming Interface | Google Charts | ||
Database software | MySQL | ||
Delivery route planning software | Circuit | Circuit for Teams | |
Free email service | Google Email | ||
Geospatial Application Programming Interface | Google Maps API | ||
Multilingual neural machine translation service | Google Translate | ||
Online form | Google Form | ||
Operating system | Linux | ||
Web and database development | Big Rose Web Design | ||
Web server software | Apache | ||
Sampling kit: | |||
Coolers | Coleman (Amazon) | B00363X3F2 | Cost (US$) per 100 rxns: 70 |
Gallon Ziploc bags | Solimo (Amazon) | B07BJ495GL | Cost (US$) per 100 rxns: 18 |
Glycerol (hand sanitizer) | FischerScientific | G33-4 | Cost (US$) per 100 rxns: 9 |
Ice packs | Ice-Brix (Amazon) | B075GLD3X1 | Cost (US$) per 100 rxns: 110 |
Isopropanol (hand sanitizer) | FischerScientific | AA36644K7 | Cost (US$) per 100 rxns: 43 |
KN95 masks | Echo-Sigma | Echo-Sigma | Cost (US$) per 100 rxns: 400 |
Paper for Protocols and Trizol Safety Sheet | Office Depot | 348037 | Cost (US$) per 100 rxns: 36 |
30 mL spray bottles (SDS and hand sanitizer) | Anyumocz (Amazon) | B07T64FHXR | Cost (US$) per 100 rxns: 80 |
RNase, DNase, DNA & PCR inhibitors free Microcentrifuge tubes | Genesee Scientific | 22-281 | Cost (US$) per 100 rxns: 83 |
Sample ID solvent resistant labels | LABTAG | XST-10C1-1WH | Cost (US$) per 100 rxns: 68 |
Swiffer WetJet pads (swabs) | Swiffer (Amazon) | B001F0RBT2 | Cost (US$) per 100 rxns: 8 |
Toothpicks | Kitchen Essential (Amazon) | B00PBK4NG6 | Cost (US$) per 100 rxns: 8 |
Trizol Reagent (guanidinium isothiocyanate solution – GITC), not LS | Invitrogen | 15596018 | Cost (US$) per 100 rxns: 40 |
Tube boxes | Genesee Scientific | 21-119 | Cost (US$) per 100 rxns: 180 |
Small Ziploc bags | Ziploc (Amazon) | B01LRKEI9K | Cost (US$) per 100 rxns: 8 |
Zebra Thermal Transfer Desktop Printer | Zebra | GK420t | |
Total Sampling kit Cost (US$) per 100 rxns: 1,160 | |||
Trizol RNA extraction: | |||
Ammonium Acetate RNase-free | Invitrogen | AM9070G | Cost (US$) per 100 rxns: 2 |
Chloroform | FisherScientific | C298-500 | Cost (US$) per 100 rxns: 2 |
GlycoBlue (glycogen 15 mg/mL) | Invitrogen | AM9515 | Cost (US$) per 100 rxns: 80 |
Molecular-grade absolute (200 proof) Ethanol | FisherScientific | BP2818500 | Cost (US$) per 100 rxns: 30 |
Molecular-grade Isopropanol | FisherScientific | BP2618500 | Cost (US$) per 100 rxns: 3 |
TURBO DNA-free Kit | Invitrogen | AM1907 | Cost (US$) per 100 rxns: 110 |
Multiplexed colorimetric RT-LAMP: | |||
Guanidine Hydrochloride | Alfa Aesar | AAJ6548522 | Cost (US$) per 100 rxns: 1 |
RT-LAMP E1-Primers | IDT | n/a | Cost (US$) per 100 rxns: 7 |
RT-LAMP N2-Primers | IDT | n/a | Cost (US$) per 100 rxns: 7 |
Synthetic SARS-CoV-2 RNA | ATCC | VR-3276SD | Cost (US$) per 100 rxns: 14 |
WarmStart Colorimetric LAMP 2X Master Mix with UDG | NEB | M1800S | Cost (US$) per 100 rxns: 210 |
Eppendorf Mastercycler Pro Thermal Cycler | Eppendorf | 950030010 | |
Total Trizol RNA extraction + LAMP Cost (US$) per 100 rxns: 470 | |||
Kit for RNA extraction: | |||
QIAamp DSP Viral RNA Mini Kit | Qiagen | 61904 | Cost (US$) per 100 rxns: 570 |
RT-qPCR: | |||
Synthetic SARS-CoV-2 RNA | ATCC | VR-3276SD | Cost (US$) per 100 rxns: 14 |
TaqMan Fast Virus 1-Step Master Mix | Applied Biosystems | 4444432 | Cost (US$) per 100 rxns: 180 |
SARS-CoV-2 (2019-nCoV) N1,N2 Primers and Probes | IDT | 10006713 | Cost (US$) per 100 rxns: 20 |
qScript XLT 1-Step RT-qPCR ToughMix | Quantabio | 95132-100 | |
QuantiNova Pathogen | Qiagen | 208652 | |
QuantiNova Probe | Qiagen | 208352 | |
UltraPlex 1-Step ToughMix | Quantabio | 95166-100 | |
CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System | BioRad | 1855196 | |
Kit for RNA extraction + RT-qPCR Cost (US$) per 100 rxns: 790 | |||
RT-PCR: | |||
SuperScript IV One-Step RT-PCR | Invitrogen | 12594025 | |
Lab cleanup: | |||
DNAZap | Invitrogen | AM9890 | |
RNAZap | Invitrogen | AM9780 |