Pruebas rápidas de susceptibilidad antimicrobiana mediante imágenes de dispersión Raman estimuladas de la incorporación de deuterio en una sola bacteria

Summary

Este protocolo presenta un ensayo rápido de prueba de susceptibilidad antimicrobiana (AST) dentro de las 2,5 h mediante imágenes de dispersión Raman estimuladas por células individuales del metabolismo de D₂O. Este método se aplica a las bacterias en la orina o en el entorno sanguíneo completo, que es transformador para la AST fenotípica unicelular rápida en la clínica.

Abstract

Para retrasar y prevenir la propagación de infecciones resistentes a los antimicrobianos, se necesitan urgentemente pruebas rápidas de susceptibilidad antimicrobiana (AST) para determinar cuantitativamente los efectos antimicrobianos sobre los patógenos. Por lo general, lleva días completar el AST mediante métodos convencionales basados en el cultivo a largo plazo, y no funcionan directamente para muestras clínicas. Aquí, informamos un método rápido de AST habilitado por imágenes de dispersión Raman estimulada (SRS) de la incorporación metabólica de óxido de deuterio (D₂O). La incorporación metabólica de_D2Oen la biomasa y la inhibición de la actividad metabólica tras la exposición a antibióticos a nivel de bacteria única se monitorean mediante imágenes SRS. La concentración de inactivación del metabolismo unicelular (SC-MIC) de las bacterias tras la exposición a antibióticos se puede obtener después de un total de 2,5 h de preparación y detección de la muestra. Además, este método rápido de AST es directamente aplicable a muestras bacterianas en entornos biológicos complejos, como orina o sangre total. Las imágenes metabólicas SRS de la incorporación de deuterio son transformadoras para la rápida AST fenotípica unicelular en la clínica.

Introduction

La resistencia a los antimicrobianos (RAM) es una amenaza mundial creciente para el tratamiento eficaz de las enfermedades infecciosas¹. Se predice que la RAM causará 10 millones de muertes adicionales por año y una pérdida del PIB mundial de $ 100 billones para 2050 si no se toman medidas para combatir las bacterias resistentes a los antibióticos ^1,2. Esto pone de relieve la necesidad urgente de métodos de diagnóstico rápidos e innovadores para las pruebas de sensibilidad a los antibióticos (AST) de las bacterias infecciosas para frenar la aparición de bacterias resistentes a los antibióticos y reducir la tasa de mortalidad relacionada³. Para garantizar el mejor resultado clínico posible, es crucial introducir una terapia efectiva dentro de las 24 h. Sin embargo, el método estándar de oro actual, como la difusión en disco o el método de dilución en caldo, generalmente requiere al menos 24 h para el procedimiento de preincubación para muestras clínicas y 16-24 h adicionales para obtener los resultados de concentración inhibitoria mínima (CMI). En general, estos métodos consumen demasiado tiempo para guiar una decisión inmediata para el tratamiento de enfermedades infecciosas en la clínica, lo que conduce a la aparición y propagación de resistencia a los antimicrobianos⁴.

Se han desarrollado métodos genotípicos de AST, como las técnicas basadas en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR)⁵, para la detección rápida. Tales técnicas miden las secuencias genéticas de resistencia específicas para proporcionar resultados rápidos de AST. No dependen del cultivo celular que consume mucho tiempo; Sin embargo, solo se prueban secuencias genéticas específicas conocidas con resistencia. Por lo tanto, su aplicación se limita a diversas especies bacterianas o diferentes mecanismos de resistencia. Además, no pueden proporcionar resultados de CMI para las decisiones terapéuticas ^6,7. Además, se están desarrollando nuevos métodos fenotípicos para AST rápido para superar estas limitaciones⁸, incluidos los dispositivos microfluídicos 9,10,11,12,13, los dispositivos ópticos^14,15,16, AST fenotípico que cuantifica la copia de ácidos nucleicos^{número 17,18} y los métodos espectroscópicos Raman ^19, 20,21,22,23,24. Estos métodos reducen el tiempo para guiar los resultados de AST, sin embargo, la mayoría de ellos solo son aplicables a aislados bacterianos, no directamente a muestras clínicas, y aún requieren una preincubación prolongada.

En este trabajo, presentamos un método para la determinación rápida de la susceptibilidad de las bacterias en la orina y la sangre total a través del monitoreo de la actividad metabólica celular mediante imágenes SRS. El agua (_H2O) participa en la gran mayoría de los procesos esenciales de síntesis biomolecular en las células vivas. Como un isotopólogo del agua, a través de la reacción de intercambio H/D catalizada por enzimas entre el átomo de hidrógeno redox activo en NADPH y el átomo D en D₂O, el deuterio puede incorporarse a la biomasa dentro de una celda^25,26. Una reacción de síntesis de ácidos grasos deuterados está mediada por el NADPH marcado con deuterio. La incorporación de_D2Oen reacciones de aminoácidos (AAs) resulta en la producción de proteínas deuteradas²⁶ (Figura 1). De esta manera, las biomoléculas recién sintetizadas que contienen enlaces C-D en células microbianas individuales pueden emplearse como un marcador general de actividad metabólica para ser detectado. Para leer los enlaces C-D sintetizados de novo, la espectroscopia Raman, una herramienta analítica versátil que proporciona información química específica y cuantitativa de biomoléculas, se usa ampliamente para determinar la susceptibilidad antimicrobiana y reducir significativamente el tiempo de prueba a unas pocas horas^27,28,29,30 . Sin embargo, debido a la baja eficiencia inherente del proceso de dispersión Raman, la espectroscopia Raman espontánea es de baja sensibilidad de detección. Por lo tanto, es difícil obtener resultados de imágenes en tiempo real utilizando espectroscopia Raman espontánea. La dispersión Raman coherente (CRS), incluida la dispersión Raman anti-Stokes coherente (CARS) y la dispersión Raman estimulada (SRS), ha alcanzado una alta sensibilidad de detección debido al campo de luz coherente para generar órdenes de magnitud mayores que la espectroscopia Raman espontánea, lo que representa imágenes químicas de alta velocidad, específicas y cuantitativas a nivel de una sola célula. 31,32,33,34,35 ,^36,37,38,39.

Aquí, basándonos en nuestro trabajo más reciente⁴⁰, presentamos un protocolo para la determinación rápida de la actividad metabólica y la susceptibilidad antimicrobiana mediante imágenes SRS C-D de femtosegundo de la incorporación de bacterias_D2Oen el medio normal, orina y ambiente de sangre total a nivel unicelular. La imagen SRS de femtosegundo facilita el monitoreo de la concentración de inactivación del metabolismo de una sola célula (SC-MIC) contra antibióticos a nivel de bacteria única dentro de las 2,5 h. Los resultados de SC-MIC se validan mediante una prueba MIC estándar mediante microdilución en caldo. Nuestro método es aplicable para determinar la susceptibilidad antimicrobiana de patógenos de infecciones del tracto urinario (ITU) e infecciones del torrente sanguíneo (BSI) con un tiempo de ensayo muy reducido en comparación con el método convencional, lo que abre la oportunidad de AST fenotípica rápida en la clínica a nivel de una sola célula.

Protocol

El uso de muestras de sangre humana está de acuerdo con las pautas del IRB de la Universidad de Boston y los Institutos Nacionales de Salud (NIH). En concreto, los ejemplares proceden de un banco y están completamente desidentificados. Estos especímenes no son considerados sujetos humanos por la oficina de la junta de revisión institucional (IRB) de la Universidad de Boston. 1. Preparación de la solución madre de bacterias y antibióticos Preparar la solución madre de antibió…

Representative Results

El efecto del tiempo de incubación en la incorporación de deuterio se mide mediante microespectroscopia Raman espontánea en las regiones C-D (2070 a 2250 cm-1) y C-H (2.800 a 3.100 cm-1) (Figura 4a). Los espectros Raman unicelulares de lapso de tiempo de P. aeruginosa cultivados en medio que contiene 70% de D 2 O muestran un aumento de la intensidad de CD / CH durante el tiempo de incubación de 0 a 180 min. (Figura 4b) La creci…

Discussion

Se puede obtener AST rápida evaluando la respuesta de la actividad metabólica bacteriana al tratamiento con antibióticos utilizando imágenes metabólicas SRS de una sola célula dentro de las 2,5 h desde la muestra hasta los resultados de SC-MIC. La respuesta de la actividad metabólica bacteriana y la susceptibilidad antimicrobiana se pueden detectar mediante la monitorización de la incorporación metabólica de_D2Opara la síntesis de biomoléculas utilizando imágenes SRS de enlaces C-D. Dado que el agu…

Materials

Acousto-optic modulation	Gooch&Housego	R15180-1.06-LTD	Modulating stokes laser beam
Amoxicillin	Sigma Aldrich	A8523-5G
Bandpass filter	Chroma	HQ825/150m	Block the stokes laser beam before the photodiode
Calcium chloride	Sigma Aldrich	C1016-100G	Cation adjustment
Cation-adjusted Mueller-Hinton Broth	Fisher Scientific	B12322	Antimicrobial susceptibility testing of microorganisms by broth dilution methods
Centrifuge	Thermo Scientific	75002542
Cover Glasses	VWR	16004-318
Culture tube with snap cap	Fisher brand	149569B
Daptomycin	Acros	A0386346
Deuterium oxide		151882	Organic solvent to dissolve antibiotics
Deuterium oxide-d6	Sigma Aldrich	156914	Organic solvent as a standard to calibrate SRS imaging system
Escherichia coli BW 25113	The Coli Genetic Stock Center	7636
Eppendorf polypropylene microcentrifuge tubes 1.5 mL	Fisher brand	05-408-129
Gentamicin sulfate	Sigma Aldrich	G4918
Hydrophilic Polyvinylidene Fluoride filters	Millipore-Sigma	SLSV025NB	pore size 5 µm
ImageJ software	NIH	Version: 2.0.0-rc-69/1.52t	Image processing and analysis
Incubating orbital shaker set at 37 °C	VWR	97009-890
Inoculation loop	Sigma	BR452201-1000EA
InSight DeepSee femtosecond pulsed laser	Spectra-Physics	Model: insight X3	Tunable laser source and fixed laser source at 1045 nm for SRS imaging
Lock-in amplifier	Zurich Instrument	HF2LI	Demodulate the SRS signals
Oil condenser	Olympus	U-AAC	NA 1.4
Pseudomonas aeruginosa ATCC 47085 (PAO1)	American Type Culture Collection	ATCC 47085
Photodiode	Hamamatsu	S3994-01	Detector
Polypropylene conical tube 15 mL	Falcon	14-959-53A
Polypropylene filters	Thermo Scientific	726-2520	pore size 0.2 µm
Sterile petri dishes	Corning	07-202-031
Syringe 10 mL	Fisher brand	14955459
UV/Vis Spectrophotometer	Beckman Coulter	Model: DU 530	Measuring optical density at wavelength of 600 nm
Vortex mixer	VWR	97043-562
Water objective	Olympus	UPLANAPO/IR	60×, NA 1.2