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Biology

単一細菌への重水素取り込みの誘導ラマン散乱イメージングによる迅速抗菌薬感受性試験

Published: February 14, 2022
doi:
10.3791/62398
, ,
1Department of Electrical and Computer Engineering,Boston University, 2Boston University Photonics Center,Boston University, 3Department of Biomedical Sciences and Pathobiology, Virginia-Maryland College of Veterinary Medicine,Virginia Polytechnic Institute and State University, 4Department of Biomedical Engineering,Boston University, 5Department of Chemistry,Boston University

Summary

このプロトコルは、D2O代謝の単一細胞刺激ラマン散乱イメージングによる2.5時間以内の迅速な抗菌剤感受性試験(AST)アッセイを提示します。この方法は、尿または全血環境の細菌に適用され、診療所での迅速な単一細胞表現型ASTに変化します。

Abstract

薬剤耐性感染症の拡大を遅らせ、防止するために、病原体に対する抗菌効果を定量的に決定するための迅速な抗菌薬感受性試験(AST)が緊急に必要です。通常、長時間の培養に基づく従来の方法でASTを完了するには数日かかり、臨床サンプルでは直接機能しません。ここでは、酸化重水素(D2O)代謝取り込みの誘導ラマン散乱(SRS)イメージングによって可能になる迅速なAST法について報告する。バイオマスへのD2Oの代謝取り込みおよび単一細菌レベルでの抗生物質への曝露時の代謝活性阻害は、SRSイメージングによってモニターされる。抗生物質への曝露時の細菌の単一細胞代謝不活化濃度(SC-MIC)は、合計2.5時間のサンプル調製および検出後に得ることができます。さらに、この迅速なAST法は、尿や全血などの複雑な生物学的環境の細菌サンプルに直接適用できます。重水素取り込みのSRS代謝イメージングは、臨床における迅速な単一細胞表現型ASTに変革的です。

Introduction

薬剤耐性(AMR)は、感染症の効果的な治療に対する世界的な脅威として増大しています1。AMRは、抗生物質耐性菌との闘いのための対策を講じなければ、2050年までに年間1,000万人が死亡し、世界のGDPが100兆ドル減少すると予測されています1,2。これは、抗生物質耐性菌の出現を遅らせ、関連する死亡率を低下させるために、感染性細菌の抗生物質感受性試験(AST)のための迅速かつ革新的な診断方法の緊急の必要性を強調しています3。可能な限り最良の臨床転帰を確実にするためには、24時間以内に効果的な治療法を導入することが重要です。ただし、ディスク拡散法やブロス希釈法などの現在のゴールドスタンダード法では、通常、臨床サンプルのプレインキュベーション手順に少なくとも24時間、最小阻害濃度(MIC)結果を得るにはさらに16〜24時間かかります。全体として、これらの方法は時間がかかりすぎて、診療所での感染症治療の即時決定を導くことができず、抗菌薬耐性の出現と拡大につながります4。

迅速な検出のために、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)ベースの技術5などの遺伝子型AST法が開発されています。このような技術は、迅速なAST結果を提供するために、特異的耐性遺伝子配列を測定する。それらは時間のかかる細胞培養に依存しません。ただし、耐性のある特定の既知の遺伝子配列のみがテストされます。したがって、その適用は、さまざまな細菌種またはさまざまな耐性メカニズムに限定されています。また、治療決定のためのMIC結果を提供することはできません6,7。さらに、これらの制限を克服するために、迅速なASTのための新しい表現型法が開発中であり、マイクロ流体デバイス9、10、11、12、13、光学デバイス14、15、16、核酸コピー数17、18、およびラマン分光法19を含む表現型ASTが含まれ、20、21、22、23、24。これらの方法はAST結果を導く時間を短縮しますが、それらのほとんどは細菌分離株にのみ適用でき、臨床検体に直接適用できず、それでも長時間のプレインキュベーションが必要です。

本研究では、SRSイメージングによる細胞代謝活性のモニタリングにより、尿中および全血中の細菌の感受性を迅速に決定する方法を提示します。水(H2O)は、生細胞における必須の生体分子合成プロセスの大部分に関与しています。水の同位体として、NADPHの酸化還元活性水素原子とD2OのD原子との間の酵素触媒H/D交換反応により、重水素を細胞内のバイオマスに取り込むことができる25,26。重水素化脂肪酸合成反応は、重水素標識NADPHによって媒介される。アミノ酸(AAs)の反応へのD2Oの取り込みは、重水素化タンパク質産生をもたらす26(図1)。このようにして、単一の微生物細胞内で新たに合成されたC−D結合含有生体分子は、検出される一般的な代謝活性マーカーとして採用することができる。de novo合成C-D結合を読み取るために、生体分子の特異的で定量的な化学情報を提供する汎用性の高い分析ツールであるラマン分光法は、抗菌剤感受性を決定し、テスト時間を数時間に大幅に短縮するために広く使用されています27,28,29,30.しかしながら、ラマン散乱プロセスの本質的に低い効率のために、自発ラマン分光法は低い検出感度を有する。そのため、自発ラマン分光法を用いてリアルタイムの画像結果を得ることは困難です。コヒーレント反ストークスラマン散乱(CARS)や誘導ラマン散乱(SRS)を含むコヒーレントラマン散乱(CRS)は、自発ラマン分光法よりも桁違いに大きな大きさを生成するコヒーレント光場により、高い検出感度に達し、単一細胞レベルで高速、特異的、定量的な化学イメージングを実現します31,32,33,34,35、36,37,38,39。

ここでは、我々の最新の研究40に基づいて、単一細胞レベルでの正常培地、尿、および全血環境における細菌のD2O取り込みのフェムト秒SRS C−Dイメージングによる代謝活性および抗菌感受性の迅速な決定のためのプロトコルを提示する。フェムト秒SRSイメージングは、2.5時間以内の単一細菌レベルでの抗生物質に対する単一細胞代謝不活化濃度(SC-MIC)のモニタリングを容易にします。SC-MICの結果は、ブロス微量希釈による標準的なMICテストによって検証されます。私たちの方法は、細菌尿路感染症(UTI)および血流感染(BSI)病原体の抗菌薬感受性を決定するために適用可能であり、従来の方法と比較してアッセイ時間が大幅に短縮され、単一細胞レベルでの臨床での迅速な表現型ASTの機会を開きます。

Protocol

ヒト血液検体の使用は、ボストン大学のIRBおよび国立衛生研究所(NIH)のガイドラインに準拠しています。具体的には、標本は銀行からのものであり、完全に非識別化されています。これらの標本は、ボストン大学の治験審査委員会(IRB)のオフィスではヒトの被験者とは見なされていません。 1.細菌および抗生物質原液の調製 抗生物質(硫酸ゲンタマイシンまたはア?…

Representative Results

重水素の取り込みに対するインキュベーション時間の影響は、C-D(2070〜2250 cm-1)およびC-H(2,800〜3,100 cm-1)領域での自発的ラマン顕微鏡法によって測定されます(図4a)。70O含有培地で培養した緑膿菌のタイムラプス単一細胞ラマンスペクトルは、0〜180分のインキュベーション時間にわたってCD/CH強度の増加を示しています(図4b<…

Discussion

迅速なASTは、サンプルからSC-MIC結果までの2.5時間以内のシングルセルSRS代謝イメージングを使用して、抗生物質治療に対する細菌代謝活性の応答を評価することによって得ることができます。細菌の代謝活性および抗菌感受性の応答は、C−D結合のSRSイメージングを用いて生体分子合成のためのD2Oの代謝取り込みをモニターすることによって検出することができる。水は生細胞に遍在…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この作業は、NIH R01AI141439からJ.-X.CおよびM.S、およびR35GM136223からJ.-X.C.のサポートを受けました。

Materials

Acousto-optic modulation Gooch&Housego R15180-1.06-LTD Modulating stokes laser beam
Amoxicillin Sigma Aldrich A8523-5G
Bandpass filter Chroma HQ825/150m Block the stokes laser beam before the photodiode
Calcium chloride Sigma Aldrich C1016-100G Cation adjustment
Cation-adjusted Mueller-Hinton Broth Fisher Scientific B12322 Antimicrobial susceptibility testing of microorganisms by broth dilution methods
Centrifuge Thermo Scientific 75002542
Cover Glasses VWR 16004-318
Culture tube with snap cap Fisher brand 149569B
Daptomycin Acros A0386346
Deuterium oxide 151882 Organic solvent to dissolve antibiotics
Deuterium oxide-d6 Sigma Aldrich 156914 Organic solvent as a standard to calibrate SRS imaging system
Escherichia coli BW 25113 The Coli Genetic Stock Center 7636
Eppendorf polypropylene microcentrifuge tubes 1.5 mL Fisher brand 05-408-129
Gentamicin sulfate Sigma Aldrich G4918
Hydrophilic Polyvinylidene Fluoride filters Millipore-Sigma SLSV025NB pore size 5 µm
ImageJ software NIH Version: 2.0.0-rc-69/1.52t Image processing and analysis
Incubating orbital shaker set at 37 °C VWR 97009-890
Inoculation loop Sigma BR452201-1000EA
InSight DeepSee femtosecond pulsed laser Spectra-Physics Model: insight X3 Tunable laser source and fixed laser source at 1045 nm for SRS imaging
Lock-in amplifier Zurich Instrument HF2LI Demodulate the SRS signals
Oil condenser Olympus U-AAC NA 1.4
Pseudomonas aeruginosa ATCC 47085 (PAO1) American Type Culture Collection ATCC 47085
Photodiode Hamamatsu S3994-01 Detector
Polypropylene conical tube 15 mL Falcon 14-959-53A
Polypropylene filters Thermo Scientific 726-2520 pore size 0.2 µm
Sterile petri dishes Corning 07-202-031
Syringe 10 mL Fisher brand 14955459
UV/Vis Spectrophotometer Beckman Coulter Model: DU 530 Measuring optical density at wavelength of 600 nm
Vortex mixer VWR 97043-562
Water objective Olympus UPLANAPO/IR 60×, NA 1.2
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References

  1. O’Neill, J. Tackling drug-resistant infections globally: final report and recommendations. The review on Antimicrobial Resistance. , (2016).
  2. Sugden, R., Kelly, R., Davies, S. Combatting antimicrobial resistance globally. Nature Microbiology. 1 (10), 16187 (2016).
  3. Kumar, A., et al. Duration of hypotension before initiation of effective antimicrobial therapy is the critical determinant of survival in human septic shock. Critical Care Medicine. 34 (6), 1589-1596 (2006).
  4. Reller, L. B., Weinstein, M., Jorgensen, J. H., Ferraro, M. J. Antimicrobial susceptibility testing: a review of general principles and contemporary practices. Clinical Infectious Diseases. 49 (11), 1749-1755 (2009).
  5. Frickmann, H., Masanta, W. O., Zautner, A. E. Emerging rapid resistance testing methods for clinical microbiology laboratories and their potential impact on patient management. BioMed Research International. 2014, 375681 (2014).
  6. Avesar, J., et al. Rapid phenotypic antimicrobial susceptibility testing using nanoliter arrays. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (29), 5787-5795 (2017).
  7. Schoepp, N. G., et al. Digital quantification of DNA replication and chromosome segregation enables determination of antimicrobial susceptibility after only 15 minutes of antibiotic exposure. Angewandte Chemie International Edition. 55 (33), 9557-9561 (2016).
  8. van Belkum, A., et al. Innovative and rapid antimicrobial susceptibility testing systems. Nature Reviews Microbiology. 18 (5), 299-311 (2020).
  9. Hou, Z., An, Y., Hjort, K., Sandegren, L., Wu, Z. Time lapse investigation of antibiotic susceptibility using a microfluidic linear gradient 3D culture device. Lab on a Chip. 14 (17), 3409-3418 (2014).
  10. Choi, J., et al. Rapid antibiotic susceptibility testing by tracking single cell growth in a microfluidic agarose channel system. Lab on a Chip. 13 (2), 280-287 (2013).
  11. Lu, Y., et al. Single cell antimicrobial susceptibility testing by confined microchannels and electrokinetic loading. Analytical Chemistry. 85 (8), 3971-3976 (2013).
  12. Kim, S. C., Cestellosblanco, S., Inoue, K., Zare, R. N. Miniaturized antimicrobial susceptibility test by combining concentration gradient generation and rapid cell culturing. Antibiotics. 4 (4), 455-466 (2015).
  13. Choi, J., et al. A rapid antimicrobial susceptibility test based on single-cell morphological analysis. Science Translational Medicine. 6 (267), (2014).
  14. Baltekin, &. #. 2. 1. 4. ;., Boucharin, A., Tano, E., Andersson, D. I., Elf, J. Antibiotic susceptibility testing in less than 30 min using direct single-cell imaging. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (34), 9170-9175 (2017).
  15. Fredborg, M., et al. Real-time optical antimicrobial susceptibility testing. Journal of Clinical Microbiology. 51 (7), 2047-2053 (2013).
  16. Choi, J., et al. A rapid antimicrobial susceptibility test based on single-cell morphological analysis. Science Translational Medicine. 6 (267), (2014).
  17. Barczak, A. K., Hung, D. T. RNA signatures allow rapid identification of pathogens and antibiotic susceptibilities. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (16), 6217-6222 (2012).
  18. Schoepp, N. G., et al. Rapid pathogen-specific phenotypic antibiotic susceptibility testing using digital LAMP quantification in clinical samples. Science Translational Medicine. 9 (410), (2017).
  19. Novelli-Rousseau, A., et al. Culture-free antibiotic-susceptibility determination from single-bacterium Raman spectra. Scientific Reports. 8 (1), 1-12 (2018).
  20. Schröder, U. -. C., et al. Detection of vancomycin resistances in enterococci within 3 1/2 hours. Scientific Reports. 5, 8217 (2015).
  21. Liu, C. -. Y., et al. Rapid bacterial antibiotic susceptibility test based on simple surface-enhanced Raman spectroscopic biomarkers. Scientific Reports. 6 (1), 1-15 (2016).
  22. Chang, K. -. W., et al. Antibiotic susceptibility test with surface-enhanced raman scattering in a microfluidic system. Analytical Chemistry. 91 (17), 10988-10995 (2019).
  23. Galvan, D. D., Yu, Q. surface-enhanced raman scattering for rapid detection and characterization of antibiotic-resistant bacteria. Advanced Healthcare Materials. 7 (13), 1701335 (2018).
  24. Kirchhoff, J., et al. Simple ciprofloxacin resistance test and determination of minimal inhibitory concentration within 2 h using raman spectroscopy. Analytical Chemistry. 90 (3), 1811-1818 (2018).
  25. Zhang, Z., Chen, L., Liu, L., Su, X., Rabinowitz, J. D. Chemical basis for deuterium labeling of fat and NADPH. Journal of the American Chemical Society. 139 (41), 14368-14371 (2017).
  26. Shi, L., et al. Optical imaging of metabolic dynamics in animals. Nature Communications. 9 (1), 2995 (2018).
  27. Berry, D., et al. Tracking heavy water (D2O) incorporation for identifying and sorting active microbial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (2), 194-203 (2015).
  28. Tao, Y., et al. Metabolic-activity-based assessment of antimicrobial effects by D2O-labeled single-cell raman microspectroscopy. Analytical Chemistry. 89 (7), 4108-4115 (2017).
  29. Yang, K., et al. Rapid antibiotic susceptibility testing of pathogenic bacteria using heavy water-labeled single-cell raman spectroscopy in clinical samples. Analytical Chemistry. 91 (9), 6296-6303 (2019).
  30. Song, Y., et al. Raman-Deuterium Isotope Probing for in-situ identification of antimicrobial resistant bacteria in Thames River. Scientific reports. 7 (1), 16648 (2017).
  31. Freudiger, C. W., et al. Label-free biomedical imaging with high sensitivity by stimulated Raman scattering microscopy. Science. 322 (5909), 1857-1861 (2008).
  32. Cheng, J. -. X., Xie, X. S. Vibrational spectroscopic imaging of living systems: An emerging platform for biology and medicine. Science. 350 (6264), (2015).
  33. Zhang, C., Zhang, D., Cheng, J. -. X. Coherent Raman scattering microscopy in biology and medicine. Annual Review of Biomedical Engineering. 17, 415-445 (2015).
  34. Yue, S., Cheng, J. -. X. Deciphering single cell metabolism by coherent Raman scattering microscopy. Current Opinion in Chemical Biology. 33, 46-57 (2016).
  35. Hu, F., Shi, L., Min, W. Biological imaging of chemical bonds by stimulated Raman scattering microscopy. Nature Methods. 16 (9), 830-842 (2019).
  36. Ji, M., et al. Rapid, Label-free detection of brain tumors with stimulated Raman scattering microscopy. Science Translational Medicine. 5 (201), (2013).
  37. He, R., Liu, Z., Xu, Y., Huang, W., Ma, H., Ji, M. Stimulated Raman scattering microscopy and spectroscopy with a rapid scanning optical delay line. Optics Letters. 42 (4), 659-662 (2017).
  38. Suzuki, Y., et al. Label-free chemical imaging flow cytometry by high-speed multicolor stimulated Raman scattering. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (32), 15842-15848 (2019).
  39. Camp, C. H., et al. High-Speed Coherent Raman Fingerprint Imaging of Biological Tissues. Nature Photonics. 8, 627-634 (2014).
  40. Zhang, M., et al. Rapid determination of antimicrobial susceptibility by stimulated raman scattering imaging of D2O metabolic incorporation in a single bacterium. Advanced Science. 7 (19), 2001452 (2020).
  41. Michael, I., et al. A fidget spinner for the point-of-care diagnosis of urinary tract infection. Nature Biomedical Engineering. 4 (6), 591-600 (2020).
  42. Bhattacharyya, R. P., et al. Simultaneous detection of genotype and phenotype enables rapid and accurate antibiotic susceptibility determination. Nature Medicine. 25 (12), 1858-1864 (2019).
  43. Stupar, P., et al. Nanomechanical sensor applied to blood culture pellets: a fast approach to determine the antibiotic susceptibility against agents of bloodstream infections. Clinical Microbiology and Infection. 23 (6), 400-405 (2017).
  44. Barber, A. E., Norton, J. P., Spivak, A. M., Mulvey, M. A. Urinary Tract Infections: Current and Emerging Management Strategies. Clinical Infectious Diseases. 57 (5), 719-724 (2013).
  45. Cohen, J., et al. Sepsis: a roadmap for future research. The Lancet Infectious Diseases. 15 (5), 581-614 (2015).
  46. Choi, J., et al. rapid antimicrobial susceptibility test from positive blood cultures based on microscopic imaging analysis. Scientific Reports. 7 (1), 1148 (2017).
  47. Gherardi, G., et al. Comparative evaluation of the Vitek-2 Compact and Phoenix systems for rapid identification and antibiotic susceptibility testing directly from blood cultures of Gram-negative and Gram-positive isolates. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 72 (1), 20-31 (2012).
  48. Machen, A., Drake, T., Wang, Y. F. Same day identification and full panel antimicrobial susceptibility testing of bacteria from positive blood culture bottles made possible by a combined lysis-filtration method with MALDI-TOF VITEK mass spectrometry and the VITEK2 system. Plos One. 9, 87870 (2014).
  49. Simon, L., et al. Direct identification of 80 percent of bacteria from blood culture bottles by matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry using a 10-minute extraction protocol. Journal of Clinical Microbiology. 57 (2), 01278 (2019).
  50. Leekha, S., Terrell, C. L., Edson, R. S. General principles of antimicrobial therapy. Mayo Clinic Proceedings. 86 (2), 156-167 (2011).
  51. Johnson, L., et al. Emergence of fluoroquinolone resistance in outpatient urinary Escherichia coli isolates. The American Journal of Medicine. 121 (10), 876-884 (2008).
  52. Van Belkum, A., et al. Developmental roadmap for antimicrobial susceptibility testing systems. Nature Reviews Microbiology. 17 (1), 51-62 (2019).
  53. Dubourg, G., Lamy, B., Ruimy, R. Rapid phenotypic methods to improve the diagnosis of bacterial bloodstream infections: meeting the challenge to reduce the time to result. Clinical Microbiology and Infection. 24 (9), 935-943 (2018).

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Keywords: Rapid Antimicrobial Susceptibility TestingStimulated Raman ScatteringDeuterium IncorporationSingle BacteriumBacterial ConcentrationOptical DensityColony Forming UnitsAntibioticMHB MediumSerial DilutionPositive ControlNegative ControlIncubationHomogenization
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Zhang, M., Seleem, M. N., Cheng, J. Rapid Antimicrobial Susceptibility Testing by Stimulated Raman Scattering Imaging of Deuterium Incorporation in a Single Bacterium. J. Vis. Exp. (180), e62398, doi:10.3791/62398 (2022).
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