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Biology

通过受激拉曼散射成像对氘掺入单个细菌进行快速抗菌药敏试验

Published: February 14, 2022 doi: 10.3791/62398
Automatic Translation
1,2, 3, 1,2,4,5
1Department of Electrical and Computer Engineering, Boston University, 2Boston University Photonics Center, Boston University, 3Department of Biomedical Sciences and Pathobiology, Virginia-Maryland College of Veterinary Medicine, Virginia Polytechnic Institute and State University, 4Department of Biomedical Engineering, Boston University, 5Department of Chemistry, Boston University

Summary

该协议通过D 2 O代谢的单细胞刺激拉曼散射成像在2.5小时内提供快速抗菌药敏试验（AST）测定。该方法适用于尿液或全血环境中的细菌，对于临床上的快速单细胞表型AST具有变革性。

Abstract

为了减缓和防止抗微生物药物耐药性感染的传播，迫切需要快速抗菌药敏试验（AST）来定量确定对病原体的抗菌作用。通过基于长期培养的常规方法完成 AST 通常需要数天时间，并且它们不直接适用于临床样本。在这里，我们报告了一种通过氧化氘（D2O）代谢掺入的受激拉曼散射（SRS）成像实现的快速AST方法。通过SRS成像监测D2O在生物质中的代谢掺入和暴露于单个细菌水平的抗生素时的代谢活性抑制。暴露于抗生素时细菌的单细胞代谢失活浓度（SC-MIC）可以在总共2.5小时的样品制备和检测后获得。此外，这种快速AST方法直接适用于复杂生物环境中的细菌样品，例如尿液或全血。氘掺入的SRS代谢成像对于临床中的快速单细胞表型AST具有变革性意义。

Introduction

抗微生物药物耐药性（AMR）是有效治疗传染病的一个日益严重的全球威胁1。据预测，如果不采取行动对抗抗生素耐药细菌，到2050年，抗微生物药物耐药性每年将造成1000万人死亡，全球GDP损失100万亿美元1，2。这强调了对感染性细菌抗生素敏感性检测（AST）的快速和创新诊断方法的迫切需要，以减缓抗生素耐药细菌的出现并降低相关死亡率3。为了确保最佳的临床结果，在24小时内引入有效的治疗至关重要。然而，目前的金标准方法，如盘式扩散法或肉汤稀释法，通常需要至少24小时用于临床样品的预孵育程序，另外需要16-24小时才能获得最小抑制浓度（MIC）结果。总体而言，这些方法过于耗时，无法指导临床上传染病治疗的立即决策，从而导致抗菌素耐药性的出现和传播4。

基因型AST方法，例如基于聚合酶链反应（PCR）的技术5，已被开发用于快速检测。这些技术测量特定的抗性基因序列，以提供快速的AST结果。它们不依赖于耗时的细胞培养;然而，只测试具有耐药性的特定已知基因序列。因此，其应用仅限于各种细菌种类或不同的抗性机制。此外，他们无法为治疗决策提供MIC结果6，7。此外，正在开发用于快速AST的新型表型方法以克服这些限制8，包括微流控器件9，10，11，12，13，光学器件14，15，16，量化核酸拷贝数的表型AST17，18和拉曼光谱方法19，20，21，22，23，24.这些方法减少了指导AST结果的时间，然而，它们中的大多数仅适用于细菌分离株，不直接适用于临床标本，并且仍然需要长时间的预孵育。

在这项工作中，我们提出了一种通过SRS成像监测细胞代谢活性来快速确定尿液和全血中细菌敏感性的方法。水（H2O）参与了活细胞中绝大多数基本的生物分子合成过程。作为水的同位素，通过NADPH中的氧化还原活性氢原子和D2O中的D原子之间的酶催化H / D交换反应，氘可以掺入电池内的生物质中25，26。氘代脂肪酸合成反应由氘标记的NADPH介导。D2O掺入氨基酸（AA）的反应中导致氘代蛋白产生26（图1）。通过这种方式，在单个微生物细胞中新合成的含C-D键的生物分子可以作为一般的代谢活性标志物进行检测。为了读出从头合成的C-D键，拉曼光谱是一种多功能分析工具，可提供生物分子的特异性和定量化学信息，广泛用于确定抗菌药敏性，并将测试时间显着缩短至几个小时27，28，29，30.然而，由于拉曼散射过程固有的低效率，自发拉曼光谱的检测灵敏度较低。因此，使用自发拉曼光谱获得实时图像结果具有挑战性。相干拉曼散射（CRS），包括相干反斯托克斯拉曼散射（CARS）和受激拉曼散射（SRS），由于相干光场产生的光场比自发拉曼光谱大几个数量级，因此达到了很高的检测灵敏度，从而在单细胞水平上呈现高速、特异性和定量的化学成像31，32，33，34，35，36，37，38，39.

在这里，基于我们最近的工作40，我们提出了一种协议，用于通过飞秒SRS C-D成像快速确定代谢活性和抗菌敏感性，在单细胞水平上正常培养基，尿液和全血环境中的细菌掺入D2O。飞秒SRS成像有助于在2.5小时内监测单细胞代谢失活浓度（SC-MIC）在单个细菌水平上对抗抗生素。SC-MIC结果通过肉汤微量稀释的标准MIC测试进行验证。我们的方法适用于确定细菌尿路感染（UTI）和血流感染（BSI）病原体的抗菌敏感性，与传统方法相比，测定时间大大缩短，这为临床上单细胞水平的快速表型AST提供了机会。

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Protocol

人类血液标本的使用符合波士顿大学IRB和美国国立卫生研究院（NIH）的指导方针。具体来说，标本来自银行，并且完全去识别化。波士顿大学机构审查委员会（IRB）办公室不认为这些标本是人类受试者。

1.细菌和抗生素储备溶液的制备

  1. 制备浓度为 1 mg/mL 的抗生素（硫酸庆大霉素或阿莫西林）储备溶液，溶解在 1.5 mL 微管中的无菌 1x 磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 或二甲基亚砜 （DMSO） 溶剂中。将硫酸庆大霉素溶解在无菌PBS溶液中，将阿莫西林溶解在无菌DMSO溶剂中。此后，按照建议将抗生素溶液储存在2-8°C。
  2. 要制备含有阳离子调节的穆勒-辛顿肉汤 （MHB） 培养基的 D 2 O，请将 220 mg MHB 肉汤基料加入 10 mL D 2 O 中，制成 100% 含 D2O 的培养基。通过使用200nm孔径的过滤器过滤对溶液进行灭菌。
    注意：在后续步骤中，始终使用此协议来制备和灭菌培养基溶液。
  3. 为了制备用于SRS成像的细菌样品，将2mL不含氘的正常MHB培养基加入无菌圆底培养管中，然后在37°C下预热。
  4. 使用无菌环从胰蛋白酶大豆琼脂平板上的新鲜培养物中选择一个细菌（大肠杆菌 BW 25113 或 铜绿假单胞 菌 ATCC 47085）菌落。然后将其悬浮在预热的培养基中并轻轻涡旋以制备细菌悬浮液。
  5. 将细菌在37°C的摇床中以每分钟200转（rpm）的速度孵育，直到达到对数阶段。

2. 在抗生素存在下进行D2O掺入处理（图2a）

  1. 通过使用波长为600nm的光度计测量光密度（OD）来检查细菌浓度。
  2. 使用不含氘的正常MHB培养基稀释细菌溶液，以达到8 x 105 CFU/mL的最终细胞浓度。轻轻涡旋以混合细菌细胞。
  3. 在七个 1.5 mL 微管中制备 300 μL 等分试样的细菌溶液，在一个 1.5 mL 微管中制备 600 μL 等分试样的细菌溶液。
  4. 将 4.8 μL 抗生素（庆大霉素或阿莫西林）储备溶液 （1 mg/mL） 加入含有 600 μL 细菌溶液的微管中，使最终抗生素浓度达到 8 μg/mL。
  5. 从 8 μg/mL 含抗生素的细菌溶液中取出 300 μL 溶液，并加入另外 300 μL 细菌溶液中，制成含有两倍稀释的抗生素 - （4 μg/mL） 细菌溶液。
  6. 重复测试抗生素庆大霉素或阿莫西林的两倍连续稀释，直到达到最低浓度（0.25μg/ mL）的微管，并从管中丢弃300μL。庆大霉素和阿莫西林的系列浓度范围为 0.25 μg/mL - 8 μg/mL。
    1. 留下一根没有抗生素的管子作为空白对照。这将是在没有抗生素治疗但使用 D2O 处理的情况下检查细菌代谢活性的阳性对照。
    2. 留下一根没有抗生素的试管，也没有D2O用于阴性对照。
  7. 将细菌等分试样与含有MHB培养基的某些抗生素（庆大霉素或阿莫西林）孵育1小时。
  8. 在孵育期间，用100%D 2 O含有培养基制备抗生素的连续稀释液，其浓度梯度与步骤2.6中制备的抗生素相同。庆大霉素和阿莫西林的系列浓度范围为 0.25 μg/mL - 8 μg/mL。
  9. 抗生素处理 1 小时后，分别将 700 μL 连续稀释的抗生素和 100% D 2 O 含 MHB 培养基加入到 300 μL 相同抗生素浓度的抗生素预处理细菌中（在步骤2.6中制备）。
    1. 例如，将 700 μL 100% D2O 含 MHB 培养基（含有 8 μg/mL 抗生素）添加到 300 μL 8 μg/mL 抗生素预处理细菌中。以同样的方式，转移到下一个浓度的相应管中，并通过上下移液几次进行均质化。
    2. 将 700 μL 不含抗生素的 100% D 2 O 含 MHB 培养基加入 300 μL 无抗生素细菌（在步骤 2.6.1 中制备）中作为空白对照。
    3. 在37°C下以200rpm在孵育振荡器中再孵育30分钟。
      注意：在此步骤中，测试介质中D2O的最终浓度为70%。
  10. 首先将1mL抗生素和D2O处理的细菌样品在4°C下以6200× g 离心5分钟，然后用纯净水洗涤两次。最后，将样品固定在10%福尔马林溶液中，并将其储存在4°C。

3.尿液环境中细菌的制备（图2b）

  1. 要在对数阶段制备 大肠杆菌 BW 25113，请按照1.4和1.5中的步骤操作。
  2. 通过使用波长为600nm的光度计测量OD来检查细菌浓度。
  3. 为了模拟临床UTI样品14，18，41，将大肠杆菌溶液加标到10 mL去识别尿液中，以达到106 CFU/mL的最终细胞浓度。
  4. 使用 5 μm 过滤器过滤加 标的大肠杆菌 尿液，然后将 300 μL 等分试样中的细菌溶液分成七个 1.5 mL 微管，将 600 μL 等分试样的细菌溶液分成一个 1.5 mL 微管。
  5. 在抗生素存在下进行D 2 O掺入处理和样品收集，如前面步骤2.4至2.10中所述。

4.血液环境中细菌的制备（图2c）

  1. 要在对数阶段制备 铜绿假单胞 菌ATCC 47085，请按照1.4和1.5中的步骤操作。
  2. 为了模拟临床血流感染样品42，43，在1 mL去识别的人血液中加标铜绿假单胞菌以达到107 CFU/mL的浓度。
  3. 加入 9 mL 无菌纯净水以裂解血液。
  4. 使用5μm过滤器过滤铜 绿假单胞菌 加标的血液。然后在4°C下以6200× g 离心5分钟，将细菌收获至1mL体积。 将 9 mL 预热的正常 MHB 加入细菌溶液中并轻轻涡旋。细菌的最终浓度为 106 CFU/mL
  5. 将 300 μL 等分试样中的 铜绿假单胞菌 加标血液溶液分成七个 1.5 mL 微管，将 600 μL 等分试样的细菌溶液分成一个 1.5 mL 微管。
  6. 在抗生素存在下进行D 2 O掺入处理和样品收集，如前面步骤2.4至2.10中所述。

5. 单个细菌中 D2O 代谢掺入的 SRS 成像

  1. 用纯净水洗涤1mL固定细菌溶液，然后在4°C下以6200× g 离心5分钟。 除去上清液。将细菌溶液富集至约 20 μL。
  2. 将细菌溶液沉积在聚-L-赖氨酸涂层盖玻片上。夹层并密封样品以进行SRS成像。
  3. 使用SRS显微镜以2168cm-1的C-D 振动频率对细菌进行成像。
    1. 使用计算机上的控制软件输入泵浦波长并将其调整为 852 nm。
    2. 使用功率计测量激光功率。通过调整激光输出前面的半波板，将样品处泵浦激光器的功率设置为 ~8 mW，将样品处斯托克斯激光的功率设置为 ~40 mW。
      注意：在SRS显微镜中，具有80 MHz重复率的可调飞秒激光器提供泵浦（680至1300 nm）和斯托克斯（1045 nm）激发激光器。
  4. 通过调整反射镜的螺钉，在空间上对齐泵浦和斯托克斯光束，并将两个光束引导到配备2D振镜系统的正置显微镜中进行激光扫描。
    1. 使用60倍水浸物镜将泵浦和斯托克斯激光器聚焦在样品上。
    2. 使用油冷凝器从样品中沿正向收集信号。
    3. 使用带通滤光片滤除斯托克斯激光器，然后再将其引导到光电二极管中。
    4. 通过锁相放大器提取受激拉曼信号，并通过光电二极管检测信号。
  5. 在软件的控制面板中将每个SRS图像设置为包含200 x 200像素和30 μs的像素停留时间。一幅图像的总采集时间为~1.2秒。将 步长 设置为 150 nm，因此图像尺寸约为 30 x 30 μm2。为每个样本至少成像三个视图字段。

6. 图像处理和数据分析（图3）

  1. 要获得平均 C-D 信号强度，请使用 ImageJ 软件打开并处理 SRS 图像。
  2. 首先，通过单击图像将SRS图像转换为具有反转颜色的8位类型图像 |类型 |8 位，然后 编辑| ImageJ 软件中的反转按钮。
  3. 然后，通过单击“处理|”过滤具有高斯模糊的图像 过滤器|高斯 模糊按钮并将 西格玛（半径） 设置为 1。
  4. 使用图像阈值调整来选择细菌区域。点击 图片|调整|阈值， 以确保所选细菌大小与原始SRS图像中的细菌大小匹配。通过调整尺寸阈值来确定颗粒来消除小颗粒。单击 应用。
  5. 应用 分析|颗粒分析 按钮用于标记和确定细菌区域。
  6. 通过单击ROI管理器中的“全部显示”按钮到原始未处理的SRS图像，标记相同的细菌区域，通过单击ROI管理器中的“测量”按钮来确定每个数据点的平均强度。
  7. 在原始SRS图像中圈出背景区域并测量背景的平均强度。通过扣除背景信号强度获得每种细菌的平均C-D强度。

7. 通过SC-MIC定量抗菌药敏性

注意：根据不同浓度的药物暴露时细菌的代谢活性和代谢抑制条件的SRS C-D强度的统计分析，确定SC-MIC的临界值0.60确定SC-MIC。抗生素敏感组和抗生素耐药组的C-D强度呈正态分布。

  1. 绘制接收器工作特性（ROC）曲线，并评估0.60处的截止阈值。基于该临界值，可以定义SC-MIC作为抗生素疗效的指标，以确定代谢无活性和代谢活性组。
  2. 为了定量分析SRS成像数据，绘制用连续稀释的抗生素浓度处理的每个细菌组的C-D信号强度直方图。彩色数据点代表不同的单个细菌。
  3. 将抗生素治疗组的C-D强度标准化为未进行抗生素治疗的对照组的平均强度。通过使用0.60的临界值量化C-D区域的SRS信号强度与不同浓度的抗生素，确定不同细菌和抗生素组合的SC-MIC结果。
  4. 验证SC-MIC读数并将其与使用常规肉汤微量稀释测定法测定的MIC进行比较。
  5. 根据临床和实验室标准协会（CLSI），基于每种测试细菌菌株的SRS代谢成像结果的敏感性类别被解释为“敏感”，“耐药”或“中间”。

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Representative Results

孵育时间对氘掺入的影响是通过C-D（2070至2250 cm-1）和C-H（2，800至3，100 cm-1）区域的自发拉曼显微光谱法测量的（图4a）。在含有70%D 2 O的培养基中培养的铜绿假单胞菌的延时单细胞拉曼光谱显示CD/CH强度在孵育时间从0分钟增加到180分钟（图4b）单个微生物细胞中C-D丰度的增加表明D2O被掺入细胞内的氘代生物分子中。

D2O标记高于50%在23小时孵育期间显着影响细菌代谢27。在25小时孵育期间，当D2O标记浓度高于70%时，我们观察到细菌生长抑制（图S1）。我们通过金标准肉汤稀释进行了MIC，并在两种铜绿假单胞菌菌株（铜绿假单胞菌ATCC 47085和铜绿假单胞菌1133）中获得了SC-MIC结果（表S1）。我们目前的结果表明，70%的D2O不会影响我们的方法在铜绿假单胞菌中的性能。我们的SC-MIC方法与传统的基于培养的方法的类别一致性是100%的，适用于所有测试的铜绿假单胞菌和抗生素组合，如表S1所示。我们将这种良好的一致性归因于在SC-MIC测定的30分钟孵育期内铜绿假单胞菌70%D2O的最小毒性。

按照该方案，将铜绿假单胞菌与连续稀释的庆大霉素孵育1小时，然后将70%D2O再孵育30分钟。 在~2168cm-1（图5a）下进行SRS代谢成像。抗生素治疗后的C-D强度除以对照组的平均值，对照组未进行抗生素治疗。定量统计分析（图5b）显示，铜绿假单胞菌的C-D信号在2 μg/mL或更高的庆大霉素浓度下明显低于没有庆大霉素处理（0 μg/mL）的C-D信号。使用0.60的临界阈值，铜绿假单胞菌在2μg/ mL和更高浓度的庆大霉素下被代谢抑制。虚线显示了图5b中定义的截止值0.60。通过这种方式，确定铜绿假单胞菌在正常MHB培养基中对庆大霉素的SC-MIC为2 μg/mL。经验证，该SC-MIC值与肉汤微量稀释法测定的MIC（4μg/mL）相差一倍（图5c）。综上所述，通过我们的技术测定的SC-MIC可以量化抗菌药敏性。

为了探索通过SRS成像快速AST氘代谢掺入在临床应用中的潜力，特别是对于最普遍的UTI感染，我们使用大肠杆菌测试了细菌加标的尿液样本，大肠杆菌是引起UTI感染的最常见病原体44。为了模拟相关细菌浓度的临床UTI样品，将大肠杆菌添加到去识别尿液中，最终浓度为106 CFU/mL。样品纯化后，将尿液样品与阿莫西林和D2O一起孵育。SRS图像中的干净背景表明样品制备方案适用于快速AST测量（图5d）。测定大肠杆菌加标尿液样品对阿莫西林的SC-MIC为4μg/mL（图5e），其敏感性读数与常规肉汤稀释法对正常MHB培养基中的纯大肠杆菌的MIC（8μg/mL）具有相同的敏感性读数（图5f）。这些结果共同表明，通过SRS成像快速AST氘代谢掺入对UTI感染性病原体的临床诊断具有巨大潜力。

与UTI感染相比，BSI病原体的快速AST对于细菌代谢活动的原位研究更具挑战性，因为许多血细胞存在于血液中。为了研究通过SRS成像快速AST对临床BSI样品的D2O代谢掺入的适用性，检测了在去识别的人血液中加标的铜绿假单胞菌。如图5g所示，SRS图像在2168 cm-1处的C-D强度以细菌信号为主。由于红细胞不具有吸收D2O进行进一步生物合成的代谢活性，因此C-D信号起源于活细菌的代谢氘掺入。碎片或红细胞物种的交叉相位调制或光热信号对微弱的背景信号做出了贡献，而不影响SC-MIC的定量分析。血液中铜绿假单胞菌的SC-MIC结果为2μg/ mL（图5h），这与正常生长培养基中铜绿假单胞菌的常规标准MIC结果非常吻合（图5i）。综上所述，这些结果表明，氘代谢掺入的SRS代谢成像可以成为确定BIS感染中细菌SC-MIC的快速AST方法。

Figure 1
图 1：D2O 掺入氘代脂质和蛋白质25，26 的方案。 氘可以通过NADPH中的氧化还原活性氢原子和D2O中的D原子之间的酶催化H / D交换反应掺入细胞内的生物质中。D2O掺入氨基酸的反应中会导致氘代蛋白的产生。该数字已从参考文献40修改而来。 请点击此处查看此图的大图。

Figure 2
图2：通过氘掺入的SRS代谢成像进行快速AST的工作流程。 （a）在MHB培养基中存在抗生素的情况下进行D2O掺入治疗，以及以下SRS成像程序。（b） 尿液环境中细菌的制备。（c） 在血液环境中制备细菌。该数字已从参考文献40修改而来。 请点击此处查看此图的大图。

Figure 3
图3.自动图像处理和数据解释。 （a） 原始 SRS 图像。（b）强度阈值调整后的图像以确定细菌细胞的面积。（c） 在颗粒分析步骤之后选择的数据点。（d） 在原始图像中选择相应的数据点。（e） 原始图像中相应数据点的结果。（f） 减去背景后数据点平均强度的统计结果。比例尺：10 μm。该数字已从参考文献40修改而来。 请点击此处查看此图的大图。

Figure 4
图4.孵育时间对氘掺入细菌的影响。（a） 通过自发拉曼显微光谱法（从20个光谱取平均值）在C-D（2070至2250厘米-1）和C-H（2，800至3，100厘米-1）区域进行延时测量。（b） （a） （a） 中细菌在 D2O 孵育时间内的 CD/CH 强度比图的直方图。每个彩色点代表单个细菌的测量值。误差线表示平均值 （SEM） 的标准误差。请点击此处查看此图的大图。

Figure 5
图5.SC-MIC使用SRS成像测定D2O在正常培养基，尿液和血液环境中对抗生素的细菌代谢掺入。（a） C-D 振动 （2168 cm-1） 下的 SRS 成像和铜绿假单胞菌在 D2O 存在下的相应透射图像，并在正常 MHB 培养基中添加连续稀释的庆大霉素。（b） （a）中铜绿假单胞菌SRS C-D强度的定量分析。直方图中的彩色数据点代表不同的单个细菌。虚线表示截止值为 0.60。（c） 通过肉汤微量稀释法比较SC-MIC读数与MIC的比较，以及根据CLSI对铜绿假单胞菌的敏感性类别。（d） C-D 振动 （2168 cm-1） 下的 SRS 成像以及与连续稀释的阿莫西林在 D2O 中孵育后尿液中大肠杆菌的相应传输图像。（e） （d）中SRS C-D强度的定量分析。（f） 正常MHB和尿液中大肠杆菌SC-MIC读数和易感性类别的比较。（g） C-D 振动 （2168 cm-1） 下的 SRS 成像和铜绿假单胞菌在 D2O 中与连续稀释的庆大霉素孵育后血液中的相应透射图像。（h） （g）中SRS C-D强度的定量分析。（i）正常MHB和血液中铜绿假单胞菌的SC-MIC读数和易感性类别的比较。S：敏感。每组 N ≥ 10 个单元格数。误差条代表 SEM。 比例尺：10 μm。该数字已从参考文献40修改而来。请点击此处查看此图的大图。

问题 可能的原因 溶液
成像视野中的细菌细胞数量很少或没有 溶液中的细菌密度太低 离心时间更长，以进一步富集细菌
SRS成像过程中细菌细胞的光损伤 使用的激光功率过高 将激光功率调低到适当的值
无法检测到 SRS 信号 泵和斯托克斯梁的空间和时间重叠未优化 使用标准样品氘代二甲基亚砜对准泵和斯托克斯光束

表 1：故障排除表。

图 S1：对在具有不同 D 2 O 浓度的月桂-贝尔塔尼 （LB） 培养基中培养的铜绿假单胞菌的 D2O毒性测试。误差线表示标准偏差值（测量次数 = 5）。请按此下载此图。

表 S1.银绿假单胞菌正常MHB中SC-MICs和MICs在 抗生素治疗后的比较。S：敏感;R：耐;I：中级。请按此下载此表格。

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Discussion

快速AST可以通过在样品到SC-MIC结果的2.5小时内使用单细胞SRS代谢成像评估细菌代谢活动对抗生素治疗的反应来获得。通过使用C-D键的SRS成像监测用于生物分子合成的D2O的代谢掺入，可以检测细菌代谢活性和抗菌敏感性的反应。由于水在活细胞中无处不在，SRS代谢成像为快速AST提供了一种通用方法。快速AST方法适用于检测复杂生物环境中的细菌，例如尿液或全血在单个细菌水平上。SC-MIC可以在尿液和血液中细菌培养1.5小时后确定，这被认为是将UTI和BSI诊断范式从耗时的培养依赖性程序转变为非培养非依赖性 原位 方法的变革性方法。因此，与传统的肉汤微量稀释方法相比，这意味着诊断时间大大缩短，这为临床转化铺平了道路，允许及时识别适当的抗菌剂以进行精确治疗。

此处描述的抗生素治疗方案遵循CLSI的指南，其中建议的MHB培养基通常可用于培养各种微生物。一个关键参数是，用于抗菌药敏试验的细菌细胞数保持在CLSI中建议的约5 x 105 CFU/mL。这对于获得准确和可重复的结果至关重要。在抗生素治疗实验中，细菌浓度设定为8 x 105 CFU/mL。较高的细菌浓度会导致MIC结果增加。一旦调整细菌悬浮液，必须在30分钟内使用，以避免细菌细胞浓度的变化。

对于达托霉素等抗生素的药敏试验，建议在培养基中补充50mg / L钙。阳离子调节的MHB培养基含有20-25mg / L的Ca2+。因此，确保培养基进一步补充浓度为30mg / L的额外Ca2+ （溶解在水中并过滤灭菌）。

所提出的方法中的另一个关键步骤是细菌在抗生素暴露和D2O掺入时的孵育时间。由于细菌生命周期的生成时间约为30至60分钟，因此在抗生素暴露一定时间内影响细菌代谢活性非常重要。该测试已评估各种细菌 - 抗生素组合，在0.5小时D2O处理之前抗生素暴露1小时。第一个1小时抗生素治疗步骤对于影响细菌代谢活性至关重要。接下来，将细菌与含D2O和含抗生素的培养基再孵育30分钟。最终抗生素浓度维持在同一水平，最终浓度调节D2O至70%。总体而言，在抗生素预培养1小时和D2O和抗生素掺入0.5小时后，然后通过细菌代谢活性的SRS代谢成像确定SC-MIC结果。这种设计最大限度地减少了D2O抗菌活性对细菌的影响，并且还导致SC-MIC结果的读数与常规方法的MIC相当。

在SC-MIC测量中，我们并行制备40个样品，包括5种不同的抗生素，每种样品同时具有8种浓度。然而，由于有很多手动操作程序，检测五种不同细菌 - 抗生素组合的AST的总测定时间超过2.5小时。在我们的方法中，每个包含~20个单个细菌细胞的SRS图像在~1.0秒内以30μs像素停留时间单次拍摄获得。我们估计，从样品到SC-MIC读数，研究一种细菌菌株的10种抗生素的总AST测定时间将少于2.5小时，这对于进行高通量测量具有巨大的可能性。在未来的工作中，将采用自动化样品制备和成像数据采集方法来进一步提高通量。表 1 中提供了故障排除详细信息。

在传统的基于培养的AST方法中，为了获得细菌分离株以进行进一步测量，有必要将临床标本预孵育数小时。已经开发了用于临床UTI样品的先进AST方法，例如拉曼光谱29，纳升阵列6和数字核酸定量18，以摆脱长时间的预孵育。与UTI感染相比，BSI或败血症更危及生命18，45，临床迫切需要快速AST进行精确诊断。据报道，一种用于测量阳性血培养物中细菌菌落形成的显微成像方法可提供MIC结果46。然而，至少需要6小时才能培养细菌来进行AST测定。此外，商用自动系统47和质谱48，49策略可以提供阳性血培养的AST读数。但是，无法提供临床决策的MIC结果。AST结果和MIC读数对于避免患者过量使用抗生素在临床中引起潜在副作用，减缓和防止抗菌素耐药性感染的传播具有重要意义50，51。与现有的基于自发拉曼显微镜的AST方法相比，由于信号增强的数量级，我们的技术大大减少了数据采集时间（约600倍）。在这项工作中，我们证明了在尿液或全血环境中以临床相关细菌浓度（105~106 CFU/ml）对单个细菌中的氘代谢进行SRS成像的快速AST。如先前的结果所示，在1小时抗生素处理和30分钟D2O和抗生素的混合物孵育成尿液和血液中的细菌后测定MIC结果。我们的方法可以在2.5小时内为每种菌株 - 抗生素组合提供MIC和药敏性分类，因此为临床转化开辟了新的途径。综上所述，无需预培养和细菌分裂，我们的方法在传染病快速和高通量AST领域具有巨大的潜力。

我们的SRS代谢成像SC-MIC方法适用于检测MIC，并在处理临床使用的大量菌株-抗生素组合时提供传染性病原体的敏感性分类。SC-MIC在将D2O掺入尿液和血液中的细菌30分钟后测定，这意味着与预孵育成本为16至24小时的传统肉汤稀释方法相比，诊断时间大大减少。为了提供用于临床决策的病原体鉴定信息，SRS代谢成像技术可以与能够快速鉴定病原体的诊断平台进一步集成，例如基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱49，52，53。结合原位病原体鉴定和快速AST诊断可能具有转化为临床的巨大潜力，从而可以及时识别适当的抗菌剂以进行精确治疗。

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Disclosures

作者没有利益冲突需要披露。

Acknowledgments

这项工作得到了NIH R01AI141439至J.-X.C和M.S.以及R35GM136223至J.-X.C的支持。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acousto-optic modulation Gooch&Housego R15180-1.06-LTD Modulating stokes laser beam
Amoxicillin Sigma Aldrich A8523-5G
Bandpass filter Chroma HQ825/150m Block the stokes laser beam before the photodiode
Calcium chloride Sigma Aldrich C1016-100G Cation adjustment
Cation-adjusted Mueller-Hinton Broth Fisher Scientific B12322 Antimicrobial susceptibility testing of microorganisms by broth dilution methods
Centrifuge Thermo Scientific 75002542
Cover Glasses VWR 16004-318
Culture tube with snap cap Fisher brand 149569B
Daptomycin Acros A0386346
Deuterium oxide 151882 Organic solvent to dissolve antibiotics
Deuterium oxide-d6 Sigma Aldrich 156914 Organic solvent as a standard to calibrate SRS imaging system
Escherichia coli BW 25113 The Coli Genetic Stock Center 7636
Eppendorf polypropylene microcentrifuge tubes 1.5 mL Fisher brand 05-408-129
Gentamicin sulfate Sigma Aldrich G4918
Hydrophilic Polyvinylidene Fluoride filters Millipore-Sigma SLSV025NB pore size 5 µm
ImageJ software NIH Version: 2.0.0-rc-69/1.52t Image processing and analysis
Incubating orbital shaker set at 37 °C VWR 97009-890
Inoculation loop Sigma BR452201-1000EA
InSight DeepSee femtosecond pulsed laser Spectra-Physics Model: insight X3 Tunable laser source and fixed laser source at 1045 nm for SRS imaging
Lock-in amplifier Zurich Instrument HF2LI Demodulate the SRS signals
Oil condenser Olympus U-AAC NA 1.4
Pseudomonas aeruginosa ATCC 47085 (PAO1) American Type Culture Collection ATCC 47085
Photodiode Hamamatsu S3994-01 Detector
Polypropylene conical tube 15 mL Falcon 14-959-53A
Polypropylene filters Thermo Scientific 726-2520 pore size 0.2 µm
Sterile petri dishes Corning 07-202-031
Syringe 10 mL Fisher brand 14955459
UV/Vis Spectrophotometer Beckman Coulter Model: DU 530 Measuring optical density at wavelength of 600 nm
Vortex mixer VWR 97043-562
Water objective Olympus UPLANAPO/IR 60×, NA 1.2

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生物学，第180期，
通过受激拉曼散射成像对氘掺入单个细菌进行快速抗菌药敏试验
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Zhang, M., Seleem, M. N., Cheng, J.… More

Zhang, M., Seleem, M. N., Cheng, J. X. Rapid Antimicrobial Susceptibility Testing by Stimulated Raman Scattering Imaging of Deuterium Incorporation in a Single Bacterium. J. Vis. Exp. (180), e62398, doi:10.3791/62398 (2022).

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