एकल जीवाणु में ड्यूटेरियम निगमन के उत्तेजित रमन स्कैटरिंग इमेजिंग द्वारा रैपिड एंटीमाइक्रोबियल संवेदनशीलता परीक्षण
Summary
यहप्रोटोकॉल डी 2ओ चयापचय के एकल-कोशिका-उत्तेजित रमन प्रकीर्णन इमेजिंग द्वारा 2.5 घंटे के भीतर तेजी से रोगाणुरोधी संवेदनशीलता परीक्षण (एएसटी) परख प्रस्तुत करता है। यह विधि मूत्र या पूरे रक्त वातावरण में बैक्टीरिया पर लागू होती है, जो क्लिनिक में तेजी से एकल-कोशिका फेनोटाइपिक एएसटी के लिए परिवर्तनकारी है।
Abstract
रोगाणुरोधी प्रतिरोधी संक्रमणों के प्रसार को धीमा करने और रोकने के लिए, तेजी से रोगाणुरोधी संवेदनशीलता परीक्षण (एएसटी) रोगजनकों पर रोगाणुरोधी प्रभावों को मात्रात्मक रूप से निर्धारित करने की तत्काल आवश्यकता है। आमतौर पर लंबे समय की संस्कृति के आधार पर पारंपरिक तरीकों से एएसटी को पूरा करने में दिन लगते हैं, और वे नैदानिक नमूनों के लिए सीधे काम नहीं करते हैं। यहां, हम ड्यूटेरियम ऑक्साइड (डी2ओ) चयापचय निगमन के उत्तेजित रमन स्कैटरिंग (एसआरएस) इमेजिंग द्वारा सक्षम एक तेजी से एएसटी विधि की रिपोर्ट करते हैं। बायोमास में डी2ओ का चयापचय समावेश और एकल जीवाणु स्तर पर एंटीबायोटिक दवाओं के संपर्क में आने पर चयापचय गतिविधि अवरोध एसआरएस इमेजिंग द्वारा निगरानी की जाती है। एंटीबायोटिक दवाओं के संपर्क में आने पर बैक्टीरिया की एकल-कोशिका चयापचय निष्क्रियता एकाग्रता (एससी-एमआईसी) नमूना तैयार करने और पता लगाने के कुल 2.5 घंटे के बाद प्राप्त की जा सकती है। इसके अलावा, यह तेजी से एएसटी विधि सीधे जटिल जैविक वातावरण में बैक्टीरिया के नमूनों पर लागू होती है, जैसे कि मूत्र या पूरे रक्त। ड्यूटेरियम निगमन की एसआरएस चयापचय इमेजिंग क्लिनिक में तेजी से एकल-सेल फेनोटाइपिक एएसटी के लिए परिवर्तनकारी है।
Introduction
रोगाणुरोधी प्रतिरोध (एएमआर) संक्रामक रोगके प्रभावी उपचार के लिए एक बढ़ता वैश्विक खतरा है। यह अनुमान लगाया गया है कि एएमआर प्रति वर्ष अतिरिक्त 10 मिलियन मौतों और 2050 तक $ 100 ट्रिलियन वैश्विक जीडीपी नुकसान का कारण बनेगा यदि एंटीबायोटिक प्रतिरोधी बैक्टीरिया कामुकाबला करने के लिए कोई कार्रवाई नहीं की जाती है। यह एंटीबायोटिक प्रतिरोधी बैक्टीरिया के उद्भव को धीमा करने और संबंधित मृत्यु दर को कम करने के लिए संक्रामक बैक्टीरिया के एंटीबायोटिक संवेदनशीलता परीक्षण (एएसटी) के लिए तेजी से और अभिनव नैदानिक तरीकों की तत्काल आवश्यकता पर जोरदेता है। सर्वोत्तम संभव नैदानिक परिणाम सुनिश्चित करने के लिए, 24 घंटे के भीतर प्रभावी चिकित्सा शुरू करना महत्वपूर्ण है। हालांकि, डिस्क प्रसार या शोरबा कमजोर पड़ने की विधि की तरह वर्तमान स्वर्ण मानक विधि को आमतौर पर नैदानिक नमूनों के लिए प्रीइन्क्यूबेशन प्रक्रिया के लिए कम से कम 24 घंटे और न्यूनतम निरोधात्मक एकाग्रता (एमआईसी) परिणाम प्राप्त करने के लिए अतिरिक्त 16-24 घंटे की आवश्यकता होती है। कुल मिलाकर, ये विधियां क्लिनिक में संक्रामक रोग उपचार के लिए तत्काल निर्णय का मार्गदर्शन करने के लिए बहुत समय लेने वाली हैं, जिससे रोगाणुरोधी प्रतिरोध 4 का उद्भव और प्रसार होताहै।
जीनोटाइपिक एएसटी विधियां, जैसे पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) आधारित तकनीक5, तेजी से पता लगाने के लिए विकसित की गई हैं। ऐसी तकनीकें तेजी से एएसटी परिणाम प्रदान करने के लिए विशिष्ट प्रतिरोध आनुवंशिक अनुक्रमों को मापती हैं। वे समय लेने वाली सेल संस्कृति पर भरोसा नहीं करते हैं; हालांकि, प्रतिरोध के साथ केवल विशिष्ट ज्ञात आनुवंशिक अनुक्रमों का परीक्षण किया जाता है। इसलिए, इसका आवेदन विभिन्न जीवाणु प्रजातियों या प्रतिरोध के विभिन्न तंत्रों तक सीमित है। इसके अलावा, वे चिकित्सा निर्णय 6,7 के लिए एमआईसी परिणाम प्रदान नहीं कर सकते हैं। इसके अलावा, इन सीमाओं को दूर करने के लिए रैपिड एएसटी के लिए नए फेनोटाइपिक तरीकेविकसित किए जा रहे हैं, जिसमें माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस 9,10,11,12,13, ऑप्टिकल डिवाइस 14,15,16, फेनोटाइपिक एएसटी न्यूक्लिक एसिड कॉपी नंबर 17,18 और रमन स्पेक्ट्रोस्कोपिक विधियों 19 की मात्रा निर्धारित करनाशामिल है। 20,21,22,23,24. ये विधियां एएसटी परिणामों को निर्देशित करने के लिए समय को कम करती हैं, हालांकि, उनमें से अधिकांश केवल बैक्टीरियल आइसोलेट्स पर लागू होती हैं, सीधे नैदानिक नमूनों पर नहीं, और अभी भी लंबे समय तक प्रीइन्क्यूबेशन की आवश्यकता होती है।
इस काम में, हम एसआरएस इमेजिंग द्वारा सेलुलर चयापचय गतिविधि की निगरानी के माध्यम से मूत्र और पूरे रक्त में बैक्टीरिया की संवेदनशीलता के तेजी से निर्धारण के लिए एक विधि प्रस्तुत करते हैं। पानी (एच2ओ) जीवित कोशिकाओं में आवश्यक बायोमोलेक्यूलर संश्लेषण प्रक्रियाओं के विशाल बहुमत में भाग लेता है। पानी के आइसोटोपोलोग के रूप में, एनएडीपीएच में रेडॉक्स-सक्रिय हाइड्रोजन परमाणु और डी 2 ओ में डी परमाणु के बीच एंजाइम-उत्प्रेरित एच / डी विनिमय प्रतिक्रिया के माध्यम से, ड्यूटेरियम को सेल25,26 के अंदर बायोमास में शामिल किया जा सकता है। एनएडीपीएच लेबल वाले ड्यूटेरियम द्वारा एक ड्यूटेरेटेड फैटी एसिड संश्लेषण प्रतिक्रिया की मध्यस्थता की जाती है। एमिनो एसिड (एए) की प्रतिक्रियाओं में डी2ओ को शामिल करने से ड्यूरेटेड प्रोटीन उत्पादनहोता है 26 (चित्रा 1)। इस तरह, एकल माइक्रोबियल कोशिकाओं में नए संश्लेषित सी-डी बॉन्ड युक्त बायोमोलेक्यूल्स को एक सामान्य चयापचय गतिविधि मार्कर के रूप में नियोजित किया जा सकता है। नए संश्लेषित सी-डी बॉन्ड को पढ़ने के लिए, रमन स्पेक्ट्रोस्कोपी, बायोमोलेक्यूल्स की विशिष्ट और मात्रात्मक रासायनिक जानकारी प्रदान करने वाला एक बहुमुखी विश्लेषणात्मक उपकरण, व्यापक रूप से रोगाणुरोधी संवेदनशीलता निर्धारित करने और परीक्षण के समय को कुछ घंटोंतक कम करने के लिए उपयोग किया जाता है। . हालांकि, रमन प्रकीर्णन प्रक्रिया की अंतर्निहित कम दक्षता के कारण, सहज रमन स्पेक्ट्रोस्कोपी कम पहचान संवेदनशीलता का है। इसलिए, सहज रमन स्पेक्ट्रोस्कोपी का उपयोग करके वास्तविक समय छवि परिणाम प्राप्त करना चुनौतीपूर्ण है। सुसंगत एंटी-स्टोक्स रमन स्कैटरिंग (CARS) और उत्तेजित रमन स्कैटरिंग (SRS) सहित सुसंगत रमन प्रकीर्णन (CRS), सहज रमन स्पेक्ट्रोस्कोपी की तुलना में बड़े परिमाण के आदेश उत्पन्न करने के लिए सुसंगत प्रकाश क्षेत्र के कारण उच्च पहचान संवेदनशीलता तक पहुंच गया है, जिससे एकल कोशिका स्तर31,32,33,34,35 पर उच्च गति, विशिष्ट और मात्रात्मक रासायनिक इमेजिंग प्रदान की जाती है। , 36,37,38,39.
यहां, हमारे सबसे हालिया काम40 के आधार पर, हम एकल-कोशिका स्तर पर सामान्य माध्यम, मूत्र और पूरे रक्त वातावरण में बैक्टीरिया के डी2ओ समावेश के फेम्टोसेकंड एसआरएस सी-डी इमेजिंग द्वारा चयापचय गतिविधि और रोगाणुरोधी संवेदनशीलता के तेजी से निर्धारण के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। फेम्टोसेकंड एसआरएस इमेजिंग 2.5 घंटे के भीतर एकल जीवाणु स्तर पर एंटीबायोटिक दवाओं के खिलाफ एकल कोशिका चयापचय निष्क्रियता एकाग्रता (एससी-एमआईसी) की निगरानी की सुविधा प्रदान करता है। एससी-एमआईसी परिणाम शोरबा माइक्रोडायल्यूशन के माध्यम से मानक एमआईसी परीक्षण द्वारा मान्य हैं। हमारी विधि पारंपरिक विधि की तुलना में बहुत कम परख समय के साथ बैक्टीरिया मूत्र पथ के संक्रमण (यूटीआई) और रक्तप्रवाह संक्रमण (बीएसआई) रोगजनकों की रोगाणुरोधी संवेदनशीलता का निर्धारण करने के लिए लागू है, जो एकल-कोशिका स्तर पर क्लिनिक में तेजी से फेनोटाइपिक एएसटी के लिए अवसर खोलता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
नमूने से एससी-एमआईसी परिणामों के लिए 2.5 घंटे के भीतर एकल-सेल एसआरएस चयापचय इमेजिंग का उपयोग करके एंटीबायोटिक उपचार के लिए जीवाणु चयापचय गतिविधि की प्रतिक्रिया का आकलन करके रैपिड एएसटी प्राप्त किया जा ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को एनआईएच आर01एआई141439 से जे-एक्ससी और एमएस और आर35जीएम136223 से जे-एक्ससी द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| Acousto-optic modulation | Gooch&Housego | R15180-1.06-LTD | Modulating stokes laser beam |
| Amoxicillin | Sigma Aldrich | A8523-5G | |
| Bandpass filter | Chroma | HQ825/150m | Block the stokes laser beam before the photodiode |
| Calcium chloride | Sigma Aldrich | C1016-100G | Cation adjustment |
| Cation-adjusted Mueller-Hinton Broth | Fisher Scientific | B12322 | Antimicrobial susceptibility testing of microorganisms by broth dilution methods |
| Centrifuge | Thermo Scientific | 75002542 | |
| Cover Glasses | VWR | 16004-318 | |
| Culture tube with snap cap | Fisher brand | 149569B | |
| Daptomycin | Acros | A0386346 | |
| Deuterium oxide | 151882 | Organic solvent to dissolve antibiotics | |
| Deuterium oxide-d6 | Sigma Aldrich | 156914 | Organic solvent as a standard to calibrate SRS imaging system |
| Escherichia coli BW 25113 | The Coli Genetic Stock Center | 7636 | |
| Eppendorf polypropylene microcentrifuge tubes 1.5 mL | Fisher brand | 05-408-129 | |
| Gentamicin sulfate | Sigma Aldrich | G4918 | |
| Hydrophilic Polyvinylidene Fluoride filters | Millipore-Sigma | SLSV025NB | pore size 5 µm |
| ImageJ software | NIH | Version: 2.0.0-rc-69/1.52t | Image processing and analysis |
| Incubating orbital shaker set at 37 °C | VWR | 97009-890 | |
| Inoculation loop | Sigma | BR452201-1000EA | |
| InSight DeepSee femtosecond pulsed laser | Spectra-Physics | Model: insight X3 | Tunable laser source and fixed laser source at 1045 nm for SRS imaging |
| Lock-in amplifier | Zurich Instrument | HF2LI | Demodulate the SRS signals |
| Oil condenser | Olympus | U-AAC | NA 1.4 |
| Pseudomonas aeruginosa ATCC 47085 (PAO1) | American Type Culture Collection | ATCC 47085 | |
| Photodiode | Hamamatsu | S3994-01 | Detector |
| Polypropylene conical tube 15 mL | Falcon | 14-959-53A | |
| Polypropylene filters | Thermo Scientific | 726-2520 | pore size 0.2 µm |
| Sterile petri dishes | Corning | 07-202-031 | |
| Syringe 10 mL | Fisher brand | 14955459 | |
| UV/Vis Spectrophotometer | Beckman Coulter | Model: DU 530 | Measuring optical density at wavelength of 600 nm |
| Vortex mixer | VWR | 97043-562 | |
| Water objective | Olympus | UPLANAPO/IR | 60×, NA 1.2 |
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