JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biology

Tek Bir Bakteride Döteryum Birleşmesinin Uyarılmış Raman Saçılma Görüntülemesi ile Hızlı Antimikrobiyal Duyarlılık Testi

Published: February 14, 2022
doi:
10.3791/62398
, ,
1Department of Electrical and Computer Engineering,Boston University, 2Boston University Photonics Center,Boston University, 3Department of Biomedical Sciences and Pathobiology, Virginia-Maryland College of Veterinary Medicine,Virginia Polytechnic Institute and State University, 4Department of Biomedical Engineering,Boston University, 5Department of Chemistry,Boston University

Summary

Bu protokol, D 2O metabolizmasının tek hücreli uyarılmış Raman saçılma görüntülemesi ile 2.5 saat içinde hızlı antimikrobiyal duyarlılık testi (AST) testi sunar. Bu yöntem, klinikte hızlı tek hücreli fenotipik AST için dönüştürücü olan idrar veya tam kan ortamındaki bakteriler için geçerlidir.

Abstract

Antimikrobiyal dirençli enfeksiyonların yayılmasını yavaşlatmak ve önlemek için, patojenler üzerindeki antimikrobiyal etkileri nicel olarak belirlemek için hızlı antimikrobiyal duyarlılık testine (AST) acil ihtiyaç duyulmaktadır. AST’nin uzun süreli kültüre dayanan geleneksel yöntemlerle tamamlanması genellikle günler alır ve doğrudan klinik örnekler için çalışmazlar. Burada, döteryum oksit (D2O) metabolik katılımının uyarılmış Raman saçılması (SRS) görüntülemesi ile sağlanan hızlı bir AST yöntemi sunulmuştur. D2O’nun biyokütleye metabolik katılımı ve tek bakteri düzeyinde antibiyotiklere maruz kalındığında metabolik aktivite inhibisyonu SRS görüntüleme ile izlenir. Antibiyotiklere maruz kaldıktan sonra bakterilerin tek hücreli metabolizma inaktivasyon konsantrasyonu (SC-MIC), toplam 2.5 saatlik numune hazırlama ve tespitinden sonra elde edilebilir. Ayrıca, bu hızlı AST yöntemi, idrar veya tam kan gibi karmaşık biyolojik ortamlardaki bakteri örneklerine doğrudan uygulanabilir. Döteryum katılımının SRS metabolik görüntülemesi, klinikte hızlı tek hücreli fenotipik AST için dönüştürücüdür.

Introduction

Antimikrobiyal direnç (AMR), bulaşıcı hastalığın etkili tedavisi için büyüyen küresel bir tehdittir1. AMR’nin, antibiyotiğe dirençli bakterilerle mücadele için herhangi bir eylemde bulunulmaması durumunda 2050 yılına kadar yılda 10 milyon ölüme ve 100 trilyon dolarlık küresel GSYİH kaybına neden olacağı tahmin edilmektedir 1,2. Bu, antibiyotiğe dirençli bakterilerin ortaya çıkışını yavaşlatmak ve ilgili ölüm oranını azaltmak için enfeksiyöz bakterilerin antibiyotik duyarlılık testi (AST) için hızlı ve yenilikçi tanı yöntemlerine olan acil ihtiyacı vurgulamaktadır3. Mümkün olan en iyi klinik sonucu sağlamak için, 24 saat içinde etkili tedavinin uygulanması çok önemlidir. Bununla birlikte, disk difüzyonu veya et suyu seyreltme yöntemi gibi mevcut altın standart yöntem, klinik numuneler için ön inkübasyon prosedürü için genellikle en az 24 saat ve minimum inhibitör konsantrasyon (MIC) sonuçlarını elde etmek için ek 16-24 saat gerektirir. Genel olarak, bu yöntemler klinikte bulaşıcı hastalık tedavisi için acil bir karara rehberlik etmek için çok zaman alıcıdır ve bu da antimikrobiyal direncin ortaya çıkmasına ve yayılmasına yol açar4.

Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) tabanlı teknikler5 gibi genotipik AST yöntemleri, hızlı tespit için geliştirilmiştir. Bu tür teknikler, hızlı AST sonuçları sağlamak için spesifik direnç genetik dizilerini ölçer. Zaman alıcı hücre kültürüne güvenmezler; Bununla birlikte, sadece direnci olan bilinen spesifik genetik diziler test edilir. Bu nedenle, uygulaması çeşitli bakteri türleri veya farklı direnç mekanizmaları ile sınırlıdır. Ayrıca, tedavi kararları için MIC sonuçları veremezler 6,7. Ayrıca, bu sınırlamaların üstesinden gelmek için yeni fenotipik yöntemler geliştirilmektedir8, mikroakışkan cihazlar 9,10,11,12,13, optik cihazlar14,15,16, nükleik asitlerin kopya numarası 17,18’i ölçen fenotipik AST ve Raman spektroskopik yöntemler 19, 20,21,22,23,24. Bu yöntemler AST sonuçlarını yönlendirmek için gereken süreyi kısaltır, ancak çoğu doğrudan klinik numunelere değil, yalnızca bakteriyel izolatlara uygulanabilir ve yine de uzun süreli ön inkübasyon gerektirir.

Bu çalışmada, SRS görüntüleme ile hücresel metabolik aktivitenin izlenmesi yoluyla idrar ve tam kandaki bakterilerin duyarlılığının hızlı bir şekilde belirlenmesi için bir yöntem sunuyoruz. Su (H2O), canlı hücrelerdeki temel biyomoleküler sentez süreçlerinin büyük çoğunluğunda yer alır. Bir su izotopologu olarak, NADPH’deki redoks-aktif hidrojen atomu ile D2O’daki D atomu arasındaki enzim katalizörlü H / D değişim reaksiyonu yoluyla, döteryum bir hücre25,26 içindeki biyokütleye dahil edilebilir. Deuterated yağ asidi sentez reaksiyonu, NADPH etiketli döteryum tarafından aracılık edilir. D2O’nun amino asitlerin (AA’lar) reaksiyonlarına dahil edilmesi, deuterated protein üretimi26 ile sonuçlanır (Şekil 1). Bu şekilde, tek mikrobiyal hücrelerde yeni sentezlenen C-D bağı içeren biyomoleküller, tespit edilecek genel bir metabolik aktivite belirteci olarak kullanılabilir. De novo sentezlenmiş C-D bağlarını okumak için, biyomoleküllerin spesifik ve kantitatif kimyasal bilgilerini sağlayan çok yönlü bir analitik araç olan Raman spektroskopisi, antimikrobiyal duyarlılığı belirlemek ve test süresini birkaç saate düşürmek için yaygın olarak kullanılmaktadır27,28,29,30 . Bununla birlikte, Raman saçılma işleminin doğal düşük verimliliği nedeniyle, spontan Raman spektroskopisi düşük algılama hassasiyetine sahiptir. Bu nedenle, spontan Raman spektroskopisi kullanarak gerçek zamanlı görüntü sonuçları elde etmek zordur. Tutarlı anti-Stokes Raman saçılması (CARS) ve uyarılmış Raman saçılması (SRS) dahil olmak üzere tutarlı Raman saçılması (CRS), spontan Raman spektroskopisininkinden daha büyük büyüklük sıraları üretmek için tutarlı ışık alanı nedeniyle yüksek algılama hassasiyetine ulaşmıştır, böylece tek hücre seviyesinde yüksek hızlı, spesifik ve kantitatif kimyasal görüntüleme 31,32,33,34,35 ,36,37,38,39.

Burada, en son çalışmamız40’a dayanarak, bakterilerin normal ortamda, idrarda ve tam kan ortamında tek hücre düzeyinde dahil edilmesinin femtosaniye SRS C-D görüntülemesi ilemetabolik aktivitenin ve antimikrobiyal duyarlılığın hızlı bir şekilde belirlenmesi için bir protokol sunuyoruz. Femtosaniye SRS görüntüleme, 2.5 saat içinde tek bakteri seviyesinde antibiyotiklere karşı tek hücre metabolizması inaktivasyon konsantrasyonunun (SC-MIC) izlenmesini kolaylaştırır. SC-MIC sonuçları, et suyu mikrodilüsyonu yoluyla standart MIC testi ile doğrulanır. Yöntemimiz, bakteri üriner sistem enfeksiyonu (İYE) ve kan dolaşımı enfeksiyonu (BSI) patojenlerinin antimikrobiyal duyarlılığını, geleneksel yönteme göre çok daha kısa bir tahlil süresi ile belirlemek için uygulanabilir olup, klinikte tek hücre düzeyinde hızlı fenotipik AST için fırsat yaratmaktadır.

Protocol

İnsan kan örneklerinin kullanımı, Boston Üniversitesi IRB ve Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) yönergelerine uygundur. Spesifik olarak, örnekler bir bankadan alınmıştır ve tamamen tanımlanmamıştır. Bu örnekler, Boston Üniversitesi’ndeki kurumsal inceleme kurulu (IRB) ofisi tarafından insan denekler olarak kabul edilmez. 1. Bakteri ve antibiyotik stok çözeltisinin hazırlanması Antibiyotik (gentamisin sülfat veya amoksisilin) stok çözeltisini, sterile1x fosfat…

Representative Results

Kuluçka süresinin döteryum infüzyonu üzerindeki etkisi, C-D (2070 ila 2250 cm-1) ve C-H (2.800 ila 3.100 cm-1) bölgesindeki spontan Raman mikrospektroskopisi ile ölçülür (Şekil 4a). % 70 D2O içeren orta maddede kültürlenen P. aeruginosa’nın hızlandırılmış tek hücreli Raman spektrumu, kuluçka süresi boyunca CD / CH yoğunluğunu 0’dan 180 dakikaya çıkardığını göstermektedir. (Şekil 4b) Tek m…

Discussion

Hızlı AST, tek hücreli SRS metabolik görüntüleme kullanılarak antibiyotik tedavisine bakteriyel metabolik aktivitenin yanıtının numuneden SC-MIC sonuçlarına 2,5 saat içinde değerlendirilmesiyle elde edilebilir. Bakteriyel metabolik aktivitenin ve antimikrobiyal duyarlılığın yanıtı, C-D bağlarının SRS görüntülemesi kullanılarak biyomolekül sentezi için D2O’nun metabolik katılımının izlenmesiyle tespit edilebilir. Su, canlı hücrelerde her yerde kullanıldığından, SRS metabol…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu çalışma J.-X.C ve M.S.’ye NIH R01AI141439 ve J.-X.C.’ye R35GM136223 tarafından desteklenmiştir.

Materials

Acousto-optic modulation Gooch&Housego R15180-1.06-LTD Modulating stokes laser beam
Amoxicillin Sigma Aldrich A8523-5G
Bandpass filter Chroma HQ825/150m Block the stokes laser beam before the photodiode
Calcium chloride Sigma Aldrich C1016-100G Cation adjustment
Cation-adjusted Mueller-Hinton Broth Fisher Scientific B12322 Antimicrobial susceptibility testing of microorganisms by broth dilution methods
Centrifuge Thermo Scientific 75002542
Cover Glasses VWR 16004-318
Culture tube with snap cap Fisher brand 149569B
Daptomycin Acros A0386346
Deuterium oxide 151882 Organic solvent to dissolve antibiotics
Deuterium oxide-d6 Sigma Aldrich 156914 Organic solvent as a standard to calibrate SRS imaging system
Escherichia coli BW 25113 The Coli Genetic Stock Center 7636
Eppendorf polypropylene microcentrifuge tubes 1.5 mL Fisher brand 05-408-129
Gentamicin sulfate Sigma Aldrich G4918
Hydrophilic Polyvinylidene Fluoride filters Millipore-Sigma SLSV025NB pore size 5 µm
ImageJ software NIH Version: 2.0.0-rc-69/1.52t Image processing and analysis
Incubating orbital shaker set at 37 °C VWR 97009-890
Inoculation loop Sigma BR452201-1000EA
InSight DeepSee femtosecond pulsed laser Spectra-Physics Model: insight X3 Tunable laser source and fixed laser source at 1045 nm for SRS imaging
Lock-in amplifier Zurich Instrument HF2LI Demodulate the SRS signals
Oil condenser Olympus U-AAC NA 1.4
Pseudomonas aeruginosa ATCC 47085 (PAO1) American Type Culture Collection ATCC 47085
Photodiode Hamamatsu S3994-01 Detector
Polypropylene conical tube 15 mL Falcon 14-959-53A
Polypropylene filters Thermo Scientific 726-2520 pore size 0.2 µm
Sterile petri dishes Corning 07-202-031
Syringe 10 mL Fisher brand 14955459
UV/Vis Spectrophotometer Beckman Coulter Model: DU 530 Measuring optical density at wavelength of 600 nm
Vortex mixer VWR 97043-562
Water objective Olympus UPLANAPO/IR 60×, NA 1.2
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. O’Neill, J. Tackling drug-resistant infections globally: final report and recommendations. The review on Antimicrobial Resistance. , (2016).
  2. Sugden, R., Kelly, R., Davies, S. Combatting antimicrobial resistance globally. Nature Microbiology. 1 (10), 16187 (2016).
  3. Kumar, A., et al. Duration of hypotension before initiation of effective antimicrobial therapy is the critical determinant of survival in human septic shock. Critical Care Medicine. 34 (6), 1589-1596 (2006).
  4. Reller, L. B., Weinstein, M., Jorgensen, J. H., Ferraro, M. J. Antimicrobial susceptibility testing: a review of general principles and contemporary practices. Clinical Infectious Diseases. 49 (11), 1749-1755 (2009).
  5. Frickmann, H., Masanta, W. O., Zautner, A. E. Emerging rapid resistance testing methods for clinical microbiology laboratories and their potential impact on patient management. BioMed Research International. 2014, 375681 (2014).
  6. Avesar, J., et al. Rapid phenotypic antimicrobial susceptibility testing using nanoliter arrays. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (29), 5787-5795 (2017).
  7. Schoepp, N. G., et al. Digital quantification of DNA replication and chromosome segregation enables determination of antimicrobial susceptibility after only 15 minutes of antibiotic exposure. Angewandte Chemie International Edition. 55 (33), 9557-9561 (2016).
  8. van Belkum, A., et al. Innovative and rapid antimicrobial susceptibility testing systems. Nature Reviews Microbiology. 18 (5), 299-311 (2020).
  9. Hou, Z., An, Y., Hjort, K., Sandegren, L., Wu, Z. Time lapse investigation of antibiotic susceptibility using a microfluidic linear gradient 3D culture device. Lab on a Chip. 14 (17), 3409-3418 (2014).
  10. Choi, J., et al. Rapid antibiotic susceptibility testing by tracking single cell growth in a microfluidic agarose channel system. Lab on a Chip. 13 (2), 280-287 (2013).
  11. Lu, Y., et al. Single cell antimicrobial susceptibility testing by confined microchannels and electrokinetic loading. Analytical Chemistry. 85 (8), 3971-3976 (2013).
  12. Kim, S. C., Cestellosblanco, S., Inoue, K., Zare, R. N. Miniaturized antimicrobial susceptibility test by combining concentration gradient generation and rapid cell culturing. Antibiotics. 4 (4), 455-466 (2015).
  13. Choi, J., et al. A rapid antimicrobial susceptibility test based on single-cell morphological analysis. Science Translational Medicine. 6 (267), (2014).
  14. Baltekin, &. #. 2. 1. 4. ;., Boucharin, A., Tano, E., Andersson, D. I., Elf, J. Antibiotic susceptibility testing in less than 30 min using direct single-cell imaging. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (34), 9170-9175 (2017).
  15. Fredborg, M., et al. Real-time optical antimicrobial susceptibility testing. Journal of Clinical Microbiology. 51 (7), 2047-2053 (2013).
  16. Choi, J., et al. A rapid antimicrobial susceptibility test based on single-cell morphological analysis. Science Translational Medicine. 6 (267), (2014).
  17. Barczak, A. K., Hung, D. T. RNA signatures allow rapid identification of pathogens and antibiotic susceptibilities. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (16), 6217-6222 (2012).
  18. Schoepp, N. G., et al. Rapid pathogen-specific phenotypic antibiotic susceptibility testing using digital LAMP quantification in clinical samples. Science Translational Medicine. 9 (410), (2017).
  19. Novelli-Rousseau, A., et al. Culture-free antibiotic-susceptibility determination from single-bacterium Raman spectra. Scientific Reports. 8 (1), 1-12 (2018).
  20. Schröder, U. -. C., et al. Detection of vancomycin resistances in enterococci within 3 1/2 hours. Scientific Reports. 5, 8217 (2015).
  21. Liu, C. -. Y., et al. Rapid bacterial antibiotic susceptibility test based on simple surface-enhanced Raman spectroscopic biomarkers. Scientific Reports. 6 (1), 1-15 (2016).
  22. Chang, K. -. W., et al. Antibiotic susceptibility test with surface-enhanced raman scattering in a microfluidic system. Analytical Chemistry. 91 (17), 10988-10995 (2019).
  23. Galvan, D. D., Yu, Q. surface-enhanced raman scattering for rapid detection and characterization of antibiotic-resistant bacteria. Advanced Healthcare Materials. 7 (13), 1701335 (2018).
  24. Kirchhoff, J., et al. Simple ciprofloxacin resistance test and determination of minimal inhibitory concentration within 2 h using raman spectroscopy. Analytical Chemistry. 90 (3), 1811-1818 (2018).
  25. Zhang, Z., Chen, L., Liu, L., Su, X., Rabinowitz, J. D. Chemical basis for deuterium labeling of fat and NADPH. Journal of the American Chemical Society. 139 (41), 14368-14371 (2017).
  26. Shi, L., et al. Optical imaging of metabolic dynamics in animals. Nature Communications. 9 (1), 2995 (2018).
  27. Berry, D., et al. Tracking heavy water (D2O) incorporation for identifying and sorting active microbial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (2), 194-203 (2015).
  28. Tao, Y., et al. Metabolic-activity-based assessment of antimicrobial effects by D2O-labeled single-cell raman microspectroscopy. Analytical Chemistry. 89 (7), 4108-4115 (2017).
  29. Yang, K., et al. Rapid antibiotic susceptibility testing of pathogenic bacteria using heavy water-labeled single-cell raman spectroscopy in clinical samples. Analytical Chemistry. 91 (9), 6296-6303 (2019).
  30. Song, Y., et al. Raman-Deuterium Isotope Probing for in-situ identification of antimicrobial resistant bacteria in Thames River. Scientific reports. 7 (1), 16648 (2017).
  31. Freudiger, C. W., et al. Label-free biomedical imaging with high sensitivity by stimulated Raman scattering microscopy. Science. 322 (5909), 1857-1861 (2008).
  32. Cheng, J. -. X., Xie, X. S. Vibrational spectroscopic imaging of living systems: An emerging platform for biology and medicine. Science. 350 (6264), (2015).
  33. Zhang, C., Zhang, D., Cheng, J. -. X. Coherent Raman scattering microscopy in biology and medicine. Annual Review of Biomedical Engineering. 17, 415-445 (2015).
  34. Yue, S., Cheng, J. -. X. Deciphering single cell metabolism by coherent Raman scattering microscopy. Current Opinion in Chemical Biology. 33, 46-57 (2016).
  35. Hu, F., Shi, L., Min, W. Biological imaging of chemical bonds by stimulated Raman scattering microscopy. Nature Methods. 16 (9), 830-842 (2019).
  36. Ji, M., et al. Rapid, Label-free detection of brain tumors with stimulated Raman scattering microscopy. Science Translational Medicine. 5 (201), (2013).
  37. He, R., Liu, Z., Xu, Y., Huang, W., Ma, H., Ji, M. Stimulated Raman scattering microscopy and spectroscopy with a rapid scanning optical delay line. Optics Letters. 42 (4), 659-662 (2017).
  38. Suzuki, Y., et al. Label-free chemical imaging flow cytometry by high-speed multicolor stimulated Raman scattering. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (32), 15842-15848 (2019).
  39. Camp, C. H., et al. High-Speed Coherent Raman Fingerprint Imaging of Biological Tissues. Nature Photonics. 8, 627-634 (2014).
  40. Zhang, M., et al. Rapid determination of antimicrobial susceptibility by stimulated raman scattering imaging of D2O metabolic incorporation in a single bacterium. Advanced Science. 7 (19), 2001452 (2020).
  41. Michael, I., et al. A fidget spinner for the point-of-care diagnosis of urinary tract infection. Nature Biomedical Engineering. 4 (6), 591-600 (2020).
  42. Bhattacharyya, R. P., et al. Simultaneous detection of genotype and phenotype enables rapid and accurate antibiotic susceptibility determination. Nature Medicine. 25 (12), 1858-1864 (2019).
  43. Stupar, P., et al. Nanomechanical sensor applied to blood culture pellets: a fast approach to determine the antibiotic susceptibility against agents of bloodstream infections. Clinical Microbiology and Infection. 23 (6), 400-405 (2017).
  44. Barber, A. E., Norton, J. P., Spivak, A. M., Mulvey, M. A. Urinary Tract Infections: Current and Emerging Management Strategies. Clinical Infectious Diseases. 57 (5), 719-724 (2013).
  45. Cohen, J., et al. Sepsis: a roadmap for future research. The Lancet Infectious Diseases. 15 (5), 581-614 (2015).
  46. Choi, J., et al. rapid antimicrobial susceptibility test from positive blood cultures based on microscopic imaging analysis. Scientific Reports. 7 (1), 1148 (2017).
  47. Gherardi, G., et al. Comparative evaluation of the Vitek-2 Compact and Phoenix systems for rapid identification and antibiotic susceptibility testing directly from blood cultures of Gram-negative and Gram-positive isolates. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 72 (1), 20-31 (2012).
  48. Machen, A., Drake, T., Wang, Y. F. Same day identification and full panel antimicrobial susceptibility testing of bacteria from positive blood culture bottles made possible by a combined lysis-filtration method with MALDI-TOF VITEK mass spectrometry and the VITEK2 system. Plos One. 9, 87870 (2014).
  49. Simon, L., et al. Direct identification of 80 percent of bacteria from blood culture bottles by matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry using a 10-minute extraction protocol. Journal of Clinical Microbiology. 57 (2), 01278 (2019).
  50. Leekha, S., Terrell, C. L., Edson, R. S. General principles of antimicrobial therapy. Mayo Clinic Proceedings. 86 (2), 156-167 (2011).
  51. Johnson, L., et al. Emergence of fluoroquinolone resistance in outpatient urinary Escherichia coli isolates. The American Journal of Medicine. 121 (10), 876-884 (2008).
  52. Van Belkum, A., et al. Developmental roadmap for antimicrobial susceptibility testing systems. Nature Reviews Microbiology. 17 (1), 51-62 (2019).
  53. Dubourg, G., Lamy, B., Ruimy, R. Rapid phenotypic methods to improve the diagnosis of bacterial bloodstream infections: meeting the challenge to reduce the time to result. Clinical Microbiology and Infection. 24 (9), 935-943 (2018).

Tags

Keywords: Rapid Antimicrobial Susceptibility TestingStimulated Raman ScatteringDeuterium IncorporationSingle BacteriumBacterial ConcentrationOptical DensityColony Forming UnitsAntibioticMHB MediumSerial DilutionPositive ControlNegative ControlIncubationHomogenization
check_url/62398?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Zhang, M., Seleem, M. N., Cheng, J. Rapid Antimicrobial Susceptibility Testing by Stimulated Raman Scattering Imaging of Deuterium Incorporation in a Single Bacterium. J. Vis. Exp. (180), e62398, doi:10.3791/62398 (2022).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image