JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biology

Snabb testning av antimikrobiell mottaglighet genom stimulerad Raman-spridningsavbildning av deuteriuminkorporering i en enda bakterie

Published: February 14, 2022
doi:
10.3791/62398
, ,
1Department of Electrical and Computer Engineering,Boston University, 2Boston University Photonics Center,Boston University, 3Department of Biomedical Sciences and Pathobiology, Virginia-Maryland College of Veterinary Medicine,Virginia Polytechnic Institute and State University, 4Department of Biomedical Engineering,Boston University, 5Department of Chemistry,Boston University

Summary

Detta protokoll presenterar snabb testning av antimikrobiell mottaglighet (AST) inom 2,5 timmar genom encellsstimulerad Raman-spridningsavbildning av D2O-metabolism. Denna metod gäller bakterier i urin- eller helblodsmiljön, vilket är transformativt för snabb encellig fenotypisk AST i kliniken.

Abstract

För att bromsa och förhindra spridningen av infektioner som är resistenta mot antimikrobiella medel är det absolut nödvändigt med snabb testning av antimikrobiell mottaglighet (AST) för att kvantitativt fastställa de antimikrobiella effekterna på patogener. Det tar vanligtvis dagar att slutföra AST med konventionella metoder baserade på den långvariga kulturen, och de fungerar inte direkt för kliniska prover. Här rapporterar vi en snabb AST-metod som möjliggörs genom stimulerad Raman-spridning (SRS) avbildning av deuteriumoxid (D2O) metabolisk inkorporering. Metabolisk inkorporering avD2Oi biomassa och den metaboliska aktivitetshämningen vid exponering för antibiotika på nivån för enskilda bakterier övervakas genom SRS-avbildning. Encellsmetabolismens inaktiveringskoncentration (SC-MIC) av bakterier vid exponering för antibiotika kan erhållas efter totalt 2,5 timmars provberedning och detektion. Dessutom är denna snabba AST-metod direkt tillämplig på bakterieprover i komplexa biologiska miljöer, såsom urin eller helblod. SRS metabolisk avbildning av deuteriuminkorporering är transformativ för snabb encellig fenotypisk AST i kliniken.

Introduction

Antimikrobiell resistens är ett växande globalt hot mot effektiv behandling av infektionssjukdomar1. Det förutspås att antimikrobiell resistens kommer att orsaka ytterligare 10 miljoner dödsfall per år och en global BNP-förlust på 100 biljoner dollar fram till 2050 om inga åtgärder vidtas för att bekämpa antibiotikaresistenta bakterier 1,2. Detta betonar det akuta behovet av snabba och innovativa diagnostiska metoder för antibiotikakänslighetstestning (AST) av smittsamma bakterier för att bromsa uppkomsten av antibiotikaresistenta bakterier och minska den relaterade dödligheten3. För att säkerställa bästa möjliga kliniska resultat är det viktigt att införa effektiv behandling inom 24 timmar. Den nuvarande guldstandardmetoden, som diskdiffusion eller buljongutspädningsmetod, kräver emellertid vanligtvis minst 24 timmar för preinkubationsförfarandet för kliniska prover och ytterligare 16-24 timmar för att erhålla resultaten av minimal hämmande koncentration (MIC). Sammantaget är dessa metoder för tidskrävande för att vägleda ett omedelbart beslut för behandling av infektionssjukdomar i kliniken, vilket leder till uppkomst och spridning av antimikrobiell resistens4.

Genotypiska AST-metoder, såsom polymeraskedjereaktion (PCR)-baserade tekniker5, har utvecklats för snabb detektion. Sådana tekniker mäter de specifika resistensgenetiska sekvenserna för att ge snabba AST-resultat. De förlitar sig inte på tidskrävande cellodling; emellertid testas endast specifika kända genetiska sekvenser med resistens. Därför är dess tillämpning begränsad till olika bakteriearter eller olika resistensmekanismer. De kan inte heller ge MIC-resultat för terapibeslut 6,7. Dessutom är nya fenotypiska metoder för snabb AST under utveckling för att övervinna dessa begränsningar8, inklusive mikrofluidiska anordningar 9,10,11,12,13, optiska enheter 14,15,16, fenotypisk AST som kvantifierar nukleinsyrorna kopia nummer 17,18 och Raman-spektroskopiska metoder 19, 20,21,22,23,24. Dessa metoder minskar tiden för att vägleda AST-resultat, men de flesta av dem är endast tillämpliga på bakterieisolat, inte direkt på kliniska prover, och kräver fortfarande långvarig preinkubation.

I detta arbete presenterar vi en metod för snabb bestämning av mottagligheten hos bakterier i urin och helblod via övervakning av den cellulära metaboliska aktiviteten genom SRS-avbildning. Vatten (H2O) deltar i de allra flesta väsentliga biomolekylära syntesprocesser i levande celler. Som en isotopologue av vatten, genom enzymkatalyserad H/D-utbytesreaktion mellan den redoxaktiva väteatomen i NADPH och D-atomeni D2O, kan deuterium införlivas i biomassa inuti en cell25,26. En deutererad fettsyrasyntesreaktion medieras av deuterium märkt NADPH. D2O-inkorporeringen i reaktioner av aminosyror (AA) resulterar i deutererad proteinproduktion26 (figur 1). På detta sätt kan de nyligen syntetiserade C-D-bindningsinnehållande biomolekylerna i enskilda mikrobiella celler användas som en allmän metabolisk aktivitetsmarkör som ska detekteras. För att läsa ut de novo-syntetiserade C-D-bindningar används Raman-spektroskopi, ett mångsidigt analysverktyg som ger specifik och kvantitativ kemisk information om biomolekyler, i stor utsträckning för att bestämma antimikrobiell mottaglighet och avsevärt minska testtiden till några timmar27,28,29,30 . På grund av den inneboende låga effektiviteten hos Raman-spridningsprocessen är emellertid den spontana Raman-spektroskopin av låg detektionskänslighet. Därför är det utmanande att få bildresultat i realtid med spontan Raman-spektroskopi. Koherent Ramanspridning (CRS), inklusive koherent anti-Stokes Raman-spridning (CARS) och stimulerad Raman-spridning (SRS), har nått hög detektionskänslighet på grund av det koherenta ljusfältet för att generera storleksordningar större än spontan Raman-spektroskopi, vilket ger höghastighets, specifik och kvantitativ kemisk avbildning på encellsnivå 31,32,33,34,35 ,36,37,38,39.

Här, baserat på vårt senaste arbete40, presenterar vi ett protokoll för snabb bestämning av den metaboliska aktiviteten och antimikrobiell mottaglighet genom femtosekund SRS C-D-avbildning av D2O-införlivande av bakterier i det normala mediet, urinen och helblodsmiljön på encellsnivå. Femtosekund SRS-avbildning underlättar övervakning av inaktiveringskoncentration av encellsmetabolism (SC-MIC) mot antibiotika på singelbakterienivå inom 2,5 timmar. SC-MIC-resultaten valideras med standard MIC-test via buljongmikrodilution. Vår metod är tillämplig för att bestämma antimikrobiell mottaglighet för bakterier urinvägsinfektion (UTI) och blodomloppsinfektion (BSI) patogener med en mycket reducerad analystid jämfört med den konventionella metoden, vilket öppnar möjligheten för snabb fenotypisk AST i kliniken på encellsnivå.

Protocol

Användningen av humana blodprover är i enlighet med riktlinjerna från IRB vid Boston University och National Institutes of Health (NIH). Specifikt är exemplen från en bank och är helt avidentifierade. Dessa exemplar anses inte vara mänskliga ämnen av Institutional Review Board (IRB) kontor vid Boston University. 1. Beredning av stamlösning av bakterier och antibiotika Bered antibiotika (gentamicinsulfat eller amoxicillin) stamlösning i en koncentration av 1 mg/ml upplöst i…

Representative Results

Inkubationstidens effekt på deuteriuminkorporering mäts med spontan Raman-mikroskopi vid C-D (2070 till 2250 cm-1) och C-H (2 800 till 3 100 cm-1) (figur 4a). De encelliga Raman-spektra med tidsfördröjning av P. aeruginosa odlade i 70O-innehållandemedium visar ökande CD/CH-intensitet över inkubationstiden från 0 till 180 min. (Figur 4b) Den ökande C-D-överflödet i enskilda mikrobiella celler avslöjara…

Discussion

Snabb AST kan erhållas genom att bedöma svaret på bakteriell metabolisk aktivitet på antibiotikabehandling med hjälp av encells SRS-metabolisk avbildning inom 2,5 timmar från provet till SC-MIC-resultat. Svaret på bakteriell metabolisk aktivitet och antimikrobiell mottaglighet kan detekteras genom att övervaka den metaboliska införlivandetav D2Oför biomolekylsyntes med användning av SRS-avbildning av C-D-bindningar. Eftersom vatten används allestädes närvarande i levande celler, ger SRS metabolis…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Detta arbete stöddes av NIH R01AI141439 till J.-X.C och M.S, och R35GM136223 till J.-X.C.

Materials

Acousto-optic modulation Gooch&Housego R15180-1.06-LTD Modulating stokes laser beam
Amoxicillin Sigma Aldrich A8523-5G
Bandpass filter Chroma HQ825/150m Block the stokes laser beam before the photodiode
Calcium chloride Sigma Aldrich C1016-100G Cation adjustment
Cation-adjusted Mueller-Hinton Broth Fisher Scientific B12322 Antimicrobial susceptibility testing of microorganisms by broth dilution methods
Centrifuge Thermo Scientific 75002542
Cover Glasses VWR 16004-318
Culture tube with snap cap Fisher brand 149569B
Daptomycin Acros A0386346
Deuterium oxide 151882 Organic solvent to dissolve antibiotics
Deuterium oxide-d6 Sigma Aldrich 156914 Organic solvent as a standard to calibrate SRS imaging system
Escherichia coli BW 25113 The Coli Genetic Stock Center 7636
Eppendorf polypropylene microcentrifuge tubes 1.5 mL Fisher brand 05-408-129
Gentamicin sulfate Sigma Aldrich G4918
Hydrophilic Polyvinylidene Fluoride filters Millipore-Sigma SLSV025NB pore size 5 µm
ImageJ software NIH Version: 2.0.0-rc-69/1.52t Image processing and analysis
Incubating orbital shaker set at 37 °C VWR 97009-890
Inoculation loop Sigma BR452201-1000EA
InSight DeepSee femtosecond pulsed laser Spectra-Physics Model: insight X3 Tunable laser source and fixed laser source at 1045 nm for SRS imaging
Lock-in amplifier Zurich Instrument HF2LI Demodulate the SRS signals
Oil condenser Olympus U-AAC NA 1.4
Pseudomonas aeruginosa ATCC 47085 (PAO1) American Type Culture Collection ATCC 47085
Photodiode Hamamatsu S3994-01 Detector
Polypropylene conical tube 15 mL Falcon 14-959-53A
Polypropylene filters Thermo Scientific 726-2520 pore size 0.2 µm
Sterile petri dishes Corning 07-202-031
Syringe 10 mL Fisher brand 14955459
UV/Vis Spectrophotometer Beckman Coulter Model: DU 530 Measuring optical density at wavelength of 600 nm
Vortex mixer VWR 97043-562
Water objective Olympus UPLANAPO/IR 60×, NA 1.2
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. O’Neill, J. Tackling drug-resistant infections globally: final report and recommendations. The review on Antimicrobial Resistance. , (2016).
  2. Sugden, R., Kelly, R., Davies, S. Combatting antimicrobial resistance globally. Nature Microbiology. 1 (10), 16187 (2016).
  3. Kumar, A., et al. Duration of hypotension before initiation of effective antimicrobial therapy is the critical determinant of survival in human septic shock. Critical Care Medicine. 34 (6), 1589-1596 (2006).
  4. Reller, L. B., Weinstein, M., Jorgensen, J. H., Ferraro, M. J. Antimicrobial susceptibility testing: a review of general principles and contemporary practices. Clinical Infectious Diseases. 49 (11), 1749-1755 (2009).
  5. Frickmann, H., Masanta, W. O., Zautner, A. E. Emerging rapid resistance testing methods for clinical microbiology laboratories and their potential impact on patient management. BioMed Research International. 2014, 375681 (2014).
  6. Avesar, J., et al. Rapid phenotypic antimicrobial susceptibility testing using nanoliter arrays. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (29), 5787-5795 (2017).
  7. Schoepp, N. G., et al. Digital quantification of DNA replication and chromosome segregation enables determination of antimicrobial susceptibility after only 15 minutes of antibiotic exposure. Angewandte Chemie International Edition. 55 (33), 9557-9561 (2016).
  8. van Belkum, A., et al. Innovative and rapid antimicrobial susceptibility testing systems. Nature Reviews Microbiology. 18 (5), 299-311 (2020).
  9. Hou, Z., An, Y., Hjort, K., Sandegren, L., Wu, Z. Time lapse investigation of antibiotic susceptibility using a microfluidic linear gradient 3D culture device. Lab on a Chip. 14 (17), 3409-3418 (2014).
  10. Choi, J., et al. Rapid antibiotic susceptibility testing by tracking single cell growth in a microfluidic agarose channel system. Lab on a Chip. 13 (2), 280-287 (2013).
  11. Lu, Y., et al. Single cell antimicrobial susceptibility testing by confined microchannels and electrokinetic loading. Analytical Chemistry. 85 (8), 3971-3976 (2013).
  12. Kim, S. C., Cestellosblanco, S., Inoue, K., Zare, R. N. Miniaturized antimicrobial susceptibility test by combining concentration gradient generation and rapid cell culturing. Antibiotics. 4 (4), 455-466 (2015).
  13. Choi, J., et al. A rapid antimicrobial susceptibility test based on single-cell morphological analysis. Science Translational Medicine. 6 (267), (2014).
  14. Baltekin, &. #. 2. 1. 4. ;., Boucharin, A., Tano, E., Andersson, D. I., Elf, J. Antibiotic susceptibility testing in less than 30 min using direct single-cell imaging. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (34), 9170-9175 (2017).
  15. Fredborg, M., et al. Real-time optical antimicrobial susceptibility testing. Journal of Clinical Microbiology. 51 (7), 2047-2053 (2013).
  16. Choi, J., et al. A rapid antimicrobial susceptibility test based on single-cell morphological analysis. Science Translational Medicine. 6 (267), (2014).
  17. Barczak, A. K., Hung, D. T. RNA signatures allow rapid identification of pathogens and antibiotic susceptibilities. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (16), 6217-6222 (2012).
  18. Schoepp, N. G., et al. Rapid pathogen-specific phenotypic antibiotic susceptibility testing using digital LAMP quantification in clinical samples. Science Translational Medicine. 9 (410), (2017).
  19. Novelli-Rousseau, A., et al. Culture-free antibiotic-susceptibility determination from single-bacterium Raman spectra. Scientific Reports. 8 (1), 1-12 (2018).
  20. Schröder, U. -. C., et al. Detection of vancomycin resistances in enterococci within 3 1/2 hours. Scientific Reports. 5, 8217 (2015).
  21. Liu, C. -. Y., et al. Rapid bacterial antibiotic susceptibility test based on simple surface-enhanced Raman spectroscopic biomarkers. Scientific Reports. 6 (1), 1-15 (2016).
  22. Chang, K. -. W., et al. Antibiotic susceptibility test with surface-enhanced raman scattering in a microfluidic system. Analytical Chemistry. 91 (17), 10988-10995 (2019).
  23. Galvan, D. D., Yu, Q. surface-enhanced raman scattering for rapid detection and characterization of antibiotic-resistant bacteria. Advanced Healthcare Materials. 7 (13), 1701335 (2018).
  24. Kirchhoff, J., et al. Simple ciprofloxacin resistance test and determination of minimal inhibitory concentration within 2 h using raman spectroscopy. Analytical Chemistry. 90 (3), 1811-1818 (2018).
  25. Zhang, Z., Chen, L., Liu, L., Su, X., Rabinowitz, J. D. Chemical basis for deuterium labeling of fat and NADPH. Journal of the American Chemical Society. 139 (41), 14368-14371 (2017).
  26. Shi, L., et al. Optical imaging of metabolic dynamics in animals. Nature Communications. 9 (1), 2995 (2018).
  27. Berry, D., et al. Tracking heavy water (D2O) incorporation for identifying and sorting active microbial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (2), 194-203 (2015).
  28. Tao, Y., et al. Metabolic-activity-based assessment of antimicrobial effects by D2O-labeled single-cell raman microspectroscopy. Analytical Chemistry. 89 (7), 4108-4115 (2017).
  29. Yang, K., et al. Rapid antibiotic susceptibility testing of pathogenic bacteria using heavy water-labeled single-cell raman spectroscopy in clinical samples. Analytical Chemistry. 91 (9), 6296-6303 (2019).
  30. Song, Y., et al. Raman-Deuterium Isotope Probing for in-situ identification of antimicrobial resistant bacteria in Thames River. Scientific reports. 7 (1), 16648 (2017).
  31. Freudiger, C. W., et al. Label-free biomedical imaging with high sensitivity by stimulated Raman scattering microscopy. Science. 322 (5909), 1857-1861 (2008).
  32. Cheng, J. -. X., Xie, X. S. Vibrational spectroscopic imaging of living systems: An emerging platform for biology and medicine. Science. 350 (6264), (2015).
  33. Zhang, C., Zhang, D., Cheng, J. -. X. Coherent Raman scattering microscopy in biology and medicine. Annual Review of Biomedical Engineering. 17, 415-445 (2015).
  34. Yue, S., Cheng, J. -. X. Deciphering single cell metabolism by coherent Raman scattering microscopy. Current Opinion in Chemical Biology. 33, 46-57 (2016).
  35. Hu, F., Shi, L., Min, W. Biological imaging of chemical bonds by stimulated Raman scattering microscopy. Nature Methods. 16 (9), 830-842 (2019).
  36. Ji, M., et al. Rapid, Label-free detection of brain tumors with stimulated Raman scattering microscopy. Science Translational Medicine. 5 (201), (2013).
  37. He, R., Liu, Z., Xu, Y., Huang, W., Ma, H., Ji, M. Stimulated Raman scattering microscopy and spectroscopy with a rapid scanning optical delay line. Optics Letters. 42 (4), 659-662 (2017).
  38. Suzuki, Y., et al. Label-free chemical imaging flow cytometry by high-speed multicolor stimulated Raman scattering. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (32), 15842-15848 (2019).
  39. Camp, C. H., et al. High-Speed Coherent Raman Fingerprint Imaging of Biological Tissues. Nature Photonics. 8, 627-634 (2014).
  40. Zhang, M., et al. Rapid determination of antimicrobial susceptibility by stimulated raman scattering imaging of D2O metabolic incorporation in a single bacterium. Advanced Science. 7 (19), 2001452 (2020).
  41. Michael, I., et al. A fidget spinner for the point-of-care diagnosis of urinary tract infection. Nature Biomedical Engineering. 4 (6), 591-600 (2020).
  42. Bhattacharyya, R. P., et al. Simultaneous detection of genotype and phenotype enables rapid and accurate antibiotic susceptibility determination. Nature Medicine. 25 (12), 1858-1864 (2019).
  43. Stupar, P., et al. Nanomechanical sensor applied to blood culture pellets: a fast approach to determine the antibiotic susceptibility against agents of bloodstream infections. Clinical Microbiology and Infection. 23 (6), 400-405 (2017).
  44. Barber, A. E., Norton, J. P., Spivak, A. M., Mulvey, M. A. Urinary Tract Infections: Current and Emerging Management Strategies. Clinical Infectious Diseases. 57 (5), 719-724 (2013).
  45. Cohen, J., et al. Sepsis: a roadmap for future research. The Lancet Infectious Diseases. 15 (5), 581-614 (2015).
  46. Choi, J., et al. rapid antimicrobial susceptibility test from positive blood cultures based on microscopic imaging analysis. Scientific Reports. 7 (1), 1148 (2017).
  47. Gherardi, G., et al. Comparative evaluation of the Vitek-2 Compact and Phoenix systems for rapid identification and antibiotic susceptibility testing directly from blood cultures of Gram-negative and Gram-positive isolates. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 72 (1), 20-31 (2012).
  48. Machen, A., Drake, T., Wang, Y. F. Same day identification and full panel antimicrobial susceptibility testing of bacteria from positive blood culture bottles made possible by a combined lysis-filtration method with MALDI-TOF VITEK mass spectrometry and the VITEK2 system. Plos One. 9, 87870 (2014).
  49. Simon, L., et al. Direct identification of 80 percent of bacteria from blood culture bottles by matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry using a 10-minute extraction protocol. Journal of Clinical Microbiology. 57 (2), 01278 (2019).
  50. Leekha, S., Terrell, C. L., Edson, R. S. General principles of antimicrobial therapy. Mayo Clinic Proceedings. 86 (2), 156-167 (2011).
  51. Johnson, L., et al. Emergence of fluoroquinolone resistance in outpatient urinary Escherichia coli isolates. The American Journal of Medicine. 121 (10), 876-884 (2008).
  52. Van Belkum, A., et al. Developmental roadmap for antimicrobial susceptibility testing systems. Nature Reviews Microbiology. 17 (1), 51-62 (2019).
  53. Dubourg, G., Lamy, B., Ruimy, R. Rapid phenotypic methods to improve the diagnosis of bacterial bloodstream infections: meeting the challenge to reduce the time to result. Clinical Microbiology and Infection. 24 (9), 935-943 (2018).

Tags

Keywords: Rapid Antimicrobial Susceptibility TestingStimulated Raman ScatteringDeuterium IncorporationSingle BacteriumBacterial ConcentrationOptical DensityColony Forming UnitsAntibioticMHB MediumSerial DilutionPositive ControlNegative ControlIncubationHomogenization
check_url/62398?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Zhang, M., Seleem, M. N., Cheng, J. Rapid Antimicrobial Susceptibility Testing by Stimulated Raman Scattering Imaging of Deuterium Incorporation in a Single Bacterium. J. Vis. Exp. (180), e62398, doi:10.3791/62398 (2022).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image