Este artículo demuestra un enfoque quirúrgico eficiente para establecer la isquemia aguda en ratones con una pequeña incisión. Este enfoque puede ser aplicado por la mayoría de los grupos de investigación sin ninguna actualización de laboratorio.
El propósito de este estudio es introducir y evaluar un enfoque quirúrgico modificado para inducir isquemia aguda en ratones que se puede implementar en la mayoría de los laboratorios de animales. Contrariamente al enfoque convencional para la doble ligadura de la arteria femoral (DLFA), se realizó una incisión más pequeña en la región inguinal derecha para exponer la arteria femoral proximal (FA) para realizar DLFA. Luego, usando una sutura de 7-0, la incisión se arrastró a la región de la rodilla para exponer la FA distal. Se utilizó una resonancia magnética (MRI) en las extremidades posteriores bilaterales para detectar la oclusión de FA después de la cirugía. A los 0, 1, 3, 5 y 7 días después de la cirugía, la recuperación funcional de las extremidades posteriores se evaluó visualmente y se calificó utilizando la escala de Tarlov. La evaluación histológica se realizó después de la eutanasia de los animales 7 días después de DLFA. Los procedimientos se realizaron con éxito en la pierna derecha en diez ratones ApoE-/-, y ningún ratón murió durante la observación posterior. Los tamaños de la incisión en los 10 ratones fueron inferiores a 5 mm (4,2 ± 0,63 mm). Los resultados de la resonancia magnética mostraron que el flujo sanguíneo de FA en el lado isquémico estaba claramente bloqueado. Los resultados de la escala de Tarlov demostraron que la función de la extremidad posterior disminuyó significativamente después del procedimiento y se recuperó lentamente durante los siguientes 7 días. La evaluación histológica mostró una respuesta inflamatoria significativa en el lado isquémico y una densidad microvascular reducida en la extremidad posterior isquémica. En conclusión, este estudio introduce una técnica modificada utilizando una incisión en miniatura para realizar isquemia de las extremidades posteriores (HLI) utilizando DLFA.
Existe una necesidad insatisfecha de modelos animales preclínicos para la investigación en enfermedades vasculares como la enfermedad arterial periférica (EAP). A pesar de los avances avanzados en el diagnóstico y el tratamiento, hubo más de 200 millones de pacientes con EAP en 20181, y su número aumenta constantemente. Aunque se han descrito varios enfoques terapéuticos novedosos2,3,4,5,6,7, la traducción exitosa de estas modalidades terapéuticas en la aplicación clínica sigue siendo una tarea desalentadora. Por lo tanto, se requieren modelos experimentales in vivo confiables y relevantes que simulen la condición de la enfermedad humana para investigar el mecanismo potencial y la eficiencia de estos nuevos enfoques terapéuticos para tratar la EAP6,7.
La hiperlipidemia y la aterosclerosis (EA) son los principales factores de riesgo para el desarrollo de la EAP. Los ratones ApoE-/- (con una dieta alta en grasas) muestran un metabolismo anormal de las grasas e hiperlipidemia y posteriormente desarrollan placas ateroscleróticas que convierten a los ratones en ApoE-/- como la mejor opción para simular la EAP clínicamente relevante. Los modelos animales preclínicos de HLI se generan a través de la doble ligadura de la arteria femoral (DLFA), que es el enfoque más utilizado en laboratorios de todo el mundo8,9,10,11, 12,13, 14,15 para simular isquemia aguda sobre crónica. Sin embargo, este enfoque generalmente requiere una incisión relativamente grande e invasiva. Además, conduce inevitablemente a que los animales (especialmente los ratones) sufran un aumento de la lesión por dolor y la inflamación, lo que también influye en los resultados experimentales posteriores5,6,16,17. Este artículo describe un modelo de HLI agudo sobre crónico en ratones APOE-/- mediante el uso de una incisión muy pequeña.
Este estudio informa un enfoque modificado, simplificado y quirúrgicamente eficiente para establecer un modelo de HLI en ratones ApoE-/- utilizando doble ligadura en las regiones proximal y distal de la FA a través de una incisión de 3-4 mm sin ninguna actualización de laboratorio requerida. La principal característica de este método es el menor tamaño de la incisión en comparación con los estudios previamente informados que describen modelos de HLI deratón 8,<…
The authors have nothing to disclose.
Los autores agradecen a Viktoria Skude, Alexander Schlund y Felix Hörner por el excelente soporte técnico.
10x Phosphate buffer saline | Roth | 9143.1 | Used for haematoxylin and eosin stain and immunohistochemistry stain |
30% H2O2 | Roth | 9681.2 | Used for immunohistochemistry stain |
6-0 absorbable sutures | PROLENE | 8776H | Used for stitching the skin |
6-0 absroable suture | PROLENE | EP8706 | Used in Surgery |
7-0 absorbable sutures | PROLENE | EH8021E | Used for ligating the artery |
7-0 absroable suture | PROLENE | EP8755 | Used in Surgery |
Acetic acid | Roth | 6755.1 | Used for haematoxylin and eosin stain |
Albumin Fraktion V | Roth | 8076.2 | Used for immunohistochemistry stain |
Autoclave | Systec GmbH | Systec VX-150 | Used for the sterilisation of the surgical instruments |
Axio vert A1 microscope | Carl Zeiss | ZEISS Axio Vert.A1 | Used for viewing and taking the pictures from haematoxylin and eosin stain and immunohistochemistry stain |
Bruker BioSpec 94/20 AVIII | Bruker Biospin MRI GmbH | N/A | Scan the femoral artery blockage |
Buprenovet Sine 0,3mg/ml | Bayer AG | 2542 (WDT) | Used in post operative pain-management. Dose – 0.1 mg/kg body weight every 8 hours for 48 h after operation |
CD31 antibody | Abcam | ab28364 | Used for immunohistochemistry stain |
Eosin Y solution 0.5 % in water | Roth | X883.1 | Used for haematoxylin and eosin stain |
Epitope Retrieval Solution pH 6 | Leica Biosystems | 6046945 | Used for immunohistochemistry stain |
Ethanol ≥ 99,5 % | Roth | 5054.1 | Used for haematoxylin and eosin stain and immunohistochemistry stain |
Fentanyl | Cayman Chemical | 437-38-7 | Used for anesthesia |
Fine point forceps | Medixplus | 93-4505S | Used for separating the artery from nerve and vein |
Glass bead sterilisator | Simon Keller | Type 250 | Used for sterilisation of the surgical instruments |
Graefe iris forceps curved | VUBU | VUBU-02-72207 | Used for blunt separation of skin and subcutaneous tissue |
Hair Remover cream, Veet (with aloe vera) | Reckitt Benckiser | 108972 | Remove hair from mice hind limbs |
Heating plate | STÖRK-TRONIC | 7042092 | Keep the satble temperature of mice |
Hematoxylin | Roth | T865.2 | Used for haematoxylin and eosin stain and immunohistochemistry stain |
Leica surgical microscope | Leica | M651 | Enlarge the field of view to facilitate the operation |
Liquid DAB+Substrate Chromogen System | Dako | K3468 | Used for immunohistochemistry stain |
Male ApoE-/- mice | Charles River Laboratories | N/A | Used for establish the Peripheral artery disease mice model |
Medetomidine | Cayman Chemical | 128366-50-7 | Used for anesthesia |
Micro Needle Holder | Black & Black Surgical | B3B-18-8 | Holding the needle |
Micro suture tying forceps | Life Saver Surgical Industries | PS-MSF-145 | Used to assist in knotting during surgery |
Microtome | Biobase | Bk-Mt268m | Used for tissue sectioning |
Midazolam | Ratiopharm | 44856.01.00 | Used for anesthesia |
MR-compatible Small Animal Monitoring and Gating System Model 1025 | SA Instruments | N/a | monitoring vital signs of animal during MRI scan |
Octeniderm farblos | Schülke & Mayr GmbH | 180212 | used for disinfection of the skin |
Ointment for the eyes and nose | Bayer AG | 1578675 | Keep the eyes wet under the anesthesia |
Paraformaldehyde | Roth | 0335.1 | Used for fixation of the tissue |
Pentobarbital | Nembutal | 76-74-4 | Used for anesthesia |
Saline | DeltaSelect | 1299.99.99 | Used for anesthesia |
Spring handle scissors with fine, sharp tips | Black & Black Surgical | B66167 | Used for cutting the artery |
SuperCut Scissors | Black & Black Surgical | B55992 | Used for cutting the skin |
Triton X-100 | Roth | 9002-93-1 | Used for immunohistochemistry stain |
Western diet, 1.25% Cholesterol | ssniff Spezialdiäten GmbH | E15723-34 | Diet for the mice |
Xylene | Roth | 4436.3 | Used for haematoxylin and eosin stain and immunohistochemistry stain |