Ein massenspektrometrie-basierter Proteomik-Ansatz für die globale und hochzuverlässige Protein-R-Methylierungsanalyse
Summary
Die Protein-Arginin (R)-Methylierung ist eine weit verbreitete posttranslationale Modifikation, die mehrere biologische Signalwege reguliert. Die Massenspektrometrie ist die beste Technologie, um das R-Methylproteom global zu profilieren, wenn es mit biochemischen Ansätzen zur modifizierten Peptidanreicherung gekoppelt ist. Der Arbeitsablauf für die hochzuverlässige Identifizierung der globalen R-Methylierung in menschlichen Zellen wird hier beschrieben.
Abstract
Die Protein-Arginin (R)-Methylierung ist eine weit verbreitete posttranslationale Proteinmodifikation (PTM), die an der Regulation mehrerer zellulärer Signalwege beteiligt ist, einschließlich RNA-Verarbeitung, Signaltransduktion, DNA-Schadensreaktion, miRNA-Biogenese und Translation.
In den letzten Jahren hat sich dank biochemischer und analytischer Entwicklungen die Massenspektrometrie (MS)-basierte Proteomik als die effektivste Strategie zur Charakterisierung des zellulären Methylproteoms mit Single-Site-Auflösung herausgestellt. Die Identifizierung und Profilierung der In-vivo-Protein-R-Methylierung durch MS bleibt jedoch schwierig und fehleranfällig, hauptsächlich aufgrund der substöchiometrischen Natur dieser Modifikation und des Vorhandenseins verschiedener Aminosäuresubstitutionen und der chemischen Methylesterung von sauren Resten, die isobar zur Methylierung sind. Daher sind Anreicherungsmethoden zur Verbesserung der Identifizierung von R-Methylpeptiden und orthogonale Validierungsstrategien zur Reduzierung der False Discovery Rates (FDR) in Methylproteomik-Studien erforderlich.
Hier wird ein Protokoll beschrieben, das speziell für die Identifizierung und Quantifizierung von R-Methylpeptiden mit hoher Zuverlässigkeit von R-Methylpeptiden aus zellulären Proben entwickelt wurde, das metabolische Markierung von Zellen mit schwerem isotopenkodiertem Methionin (hmSILAC) und dualer Protease In-Solution Aufschluss von Ganzzellextrakt koppelt, gefolgt von Offline-High-pH Reversed Phase (HpH-RP) Chromatographie-Fraktionierung und Affinitätsanreicherung von R-Methyl-Peptiden unter Verwendung von Anti-Pan-R-Methyl-Antikörpern. Bei der hochauflösenden MS-Analyse werden die Rohdaten zunächst mit dem MaxQuant-Softwarepaket verarbeitet und die Ergebnisse dann von hmSEEKER analysiert, einer Software für die eingehende Suche nach MS-Peakpaaren, die leichten und schweren Methylpeptiden in den MaxQuant-Ausgabedateien entsprechen.
Introduction
Die Arginin (R)-Methylierung ist eine posttranslationale Modifikation (PTM), die etwa 1% des Säugetierproteoms1 verziert. Protein-Arginin-Methyltransferasen (PRMTs) sind die Enzyme, die die R-Methylierungsreaktion durch die Ablagerung einer oder zweier Methylgruppen an die Stickstoffatome (N) der Guanidino-Gruppe der Seitenkette von R symmetrisch oder asymmetrisch katalysieren. Bei Säugetieren können PRMTs in drei Klassen eingeteilt werden – Typ I, Typ II und Typ III – abhängig von ihrer Fähigkeit, sowohl Monomethylierung (MMA) als auch asymmetrische Dimethylierung (ADMA), MMA und symmetrische Dimethylierung (SDMA) oder nur MMA bzw. 2,3 abzuscheiden. PRMTs zielen hauptsächlich auf R-Reste ab, die sich in glycin- und argininreichen Regionen befinden, die als GAR-Motive bekannt sind, aber einige PRMTs, wie PRMT5 und CARM1, können Prolin-Glycin-Methionin-reiche (PGM) -Motive methylieren4. Die R-Methylierung hat sich als Proteinmodulator mehrerer biologischer Prozesse wie RNA-Spleißen5, DNA-Reparatur6, miRNA-Biogenese7 und Translation2 erwiesen und fördert die Erforschung dieses PTM.
Die Massenspektrometrie (MS) gilt als die effektivste Technologie zur systematischen Untersuchung der globalen R-Methylierung mit Protein-, Peptid- und Ortsauflösung. Dieses PTM erfordert jedoch einige besondere Vorsichtsmaßnahmen für seine hochzuverlässige Identifizierung durch MS. Erstens ist die R-Methylierung substöchiometrisch, wobei die unmodifizierte Form der Peptide viel häufiger ist als die modifizierten, so dass Massenspektrometer, die im DDA-Modus (Data Dependent Acquisition) arbeiten, hochintensive unmodifizierte Peptide häufiger fragmentieren als ihre methylierten Gegenstücke mit geringerer Intensität8. Darüber hinaus leiden die meisten MS-basierten Workflows für die Identifizierung von R-methylierten Stellen unter Einschränkungen auf der Ebene der bioinformatischen Analyse. Tatsächlich ist die rechnergestützte Identifizierung von Methylpeptiden anfällig für hohe False Discovery Rates (FDR), da dieses PTM isobar zu verschiedenen Aminosäuresubstitutionen (z. B. Glycin in Alanin) und chemischen Modifikationen wie der Methylesterung von Aspartat und Glutamat9 ist. Daher wurden Methoden, die auf der Isotopenmarkierung von Methylgruppen basieren, wie z.B. die Heavy Methyl Stable Isotope Labeling with Amino Acids in Cell culture (hmSILAC), als orthogonale Strategien zur sicheren MS-Identifizierung von in vivo Methylierungen implementiert, wodurch die Rate falsch positiver Annotationen signifikant reduziert wird10.
Vor kurzem wurden verschiedene proteomweite Protokolle zur Untersuchung von R-methylierten Proteinen optimiert. Die Entwicklung von Antikörper-basierten Strategien zur Immunaffinitätsanreicherung von R-Methyl-Peptiden hat zur Annotation von mehreren hundert R-methylierten Stellen in menschlichen Zellen geführt11,12. Darüber hinaus berichteten viele Studien 3,13, dass die Kopplung der Antikörper-basierten Anreicherung mit Peptidtrenntechniken wie der HpH-RP-Chromatographie-Fraktionierung die Gesamtzahl der identifizierten Methylpeptide erhöhen kann.
Dieser Artikel beschreibt eine experimentelle Strategie zur systematischen und hochsicheren Identifizierung von R-methylierten Stellen in menschlichen Zellen, basierend auf verschiedenen biochemischen und analytischen Schritten: Proteinextraktion aus hmSILAC-markierten Zellen, paralleler doppelzymatischer Aufschluss mit Trypsin- und LysargiNase-Proteasen, gefolgt von HpH-RP-chromatographischer Fraktionierung von verdauten Peptiden, gekoppelt mit Antikörper-basierter Immunaffinitätsanreicherung von MMA-, SDMA-, und ADMA-haltige Peptide. Alle affinitätsangereicherten Peptide werden dann mittels hochauflösender Flüssigkeitschromatographie (LC)-MS/MS im DDA-Modus analysiert, und die MS-Rohdaten werden vom MaxQuant-Algorithmus zur Identifizierung von R-Methylpeptiden verarbeitet. Schließlich werden die MaxQuant-Ausgabeergebnisse mit hmSEEKER verarbeitet, einem selbst entwickelten Bioinformatik-Tool zur Suche nach Paaren schwerer und leichter Methylpeptide. Kurz gesagt, hmSEEKER liest und filtert Methylpeptididentifikationen aus der msms-Datei, gleicht dann jedes Methylpeptid seinem entsprechenden MS1-Peak in der allPeptides-Datei zu und durchsucht schließlich den Peak des schweren/leichten Peptid-Gegenstücks. Für jedes mutmaßliche Schwerlicht-Paar werden die Parameter Log2 H/L-Verhältnis (LogRatio), Retention Time Difference (dRT) und Mass Error (ME) berechnet, und Dubletten, die sich innerhalb benutzerdefinierter Cut-Offs befinden, werden als True Positives gekennzeichnet. Der Arbeitsablauf des biochemischen Protokolls ist in Abbildung 1 beschrieben.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die hochzuverlässige Identifizierung der In-vivo-Protein -/Peptidmethylierung durch globale MS-basierte Proteomik ist aufgrund des Risikos einer hohen FDR eine Herausforderung, da während der Probenvorbereitung mehrere Aminosäuresubstitutionen und Methylesterungen auftreten, die isobar zur Methylierung sind und falsche Zuordnungen verursachen können, wenn keine orthogonalen MS-Validierungsstrategien vorhanden sind. Die substöchiometrische Natur dieses PTM erschwert die Aufgabe der globalen Methylproteomik w…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
MM und EM sind Doktoranden an der European School of Molecular Medicine (SEMM). EM erhält ein 3-jähriges FIRC-AIRC-Stipendium (Projektcode: 22506). Globale Analysen von R-Methylproteomen in der TB-Gruppe werden durch den AIRC IG Grant (Project Code: 21834) unterstützt.
Materials
| Ammonium Bicarbonate (AMBIC) | Sigma-Aldrich | 09830 | |
| Ammonium Persulfate (APS) | Sigma-Aldrich | 497363 | |
| C18 Sep-Pak columns vacc 6cc (1g) | Waters | WAT036905 | |
| Colloidal Coomassie staining Instant | Sigma-Aldrich | ISB1L-1L | |
| cOmplete Mini, EDTA-free | Roche-Sigma Aldrich | 11836170001 | Protease Inhibitor |
| Dialyzed Fetal Bovine Serum (FBS) | GIBCO ThermoFisher | 26400-044 | |
| DL-Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | 3483-12-3 | |
| DMEM Medium | GIBCO ThermoFisher | requested | with stabile glutamine and without methionine |
| EASY-nano LC 1200 chromatography system | ThermoFisher | ||
| EASY-Spray HPLC Columns | ThermoFisher | ES907 | |
| Glycerolo | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| HeLa cells | ATCC | ATCC CCL-2 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Iodoacetamide (IAA) | Sigma-Aldrich | 144-48-9 | |
| Jupiter C12-RP column | Phenomenex | 00G-4396-E0 | |
| L-Methionine | Sigma-Aldrich | M5308 | Light (L) Methionine |
| L-Methionine-(methyl-13C,d3) | Sigma-Aldrich | 299154 | Heavy (H) Methionine |
| LysargiNase | Merck Millipore | EMS0008 | |
| Microtip Cell Disruptor Sonifier 250 | Branson | ||
| N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| Penicillin-Streptomycin | GIBCO ThermoFisher | 15140122 | |
| PhosSTOP | Roche-Sigma Aldrich | 4906837001 | Phosphatase Inhibitor |
| Pierce C18 Tips | ThermoFisher | 87782 | |
| Pierce 0.1% Formic Acid (v/v) in Acetonitrile, LC-MS Grade | ThermoFisher | 85175 | LC-MS Solvent B |
| Pierce 0.1% Formic Acid (v/v) in Water, LC-MS Grade | ThermoFisher | 85170 | LC-MS Solvent A |
| Pierce Acetonitrile (ACN), LC-MS Grade | ThermoFisher | 51101 | |
| Pierce Water, LC-MS Grade | ThermoFisher | 51140 | |
| Polyacrylamide | Sigma-Aldrich | 92560 | |
| Precision Plus Protein All Blue Prestained Protein Standards | Bio-Rad | 1610373 | |
| PTMScan antibodies α-ADMA | Cell Signaling Technology | 13474 | |
| PTMScan antibodies α-MMA | Cell Signaling Technology | 12235 | |
| PTMScan antibodies α-SDMA | Cell Signaling Technology | 13563 | |
| Q Exactive HF Hybrid Quadrupole-Orbitrap Mass Spectrometer | ThermoFisher | ||
| Sequencing Grade Modified Trypsin | Promega | V5113 | |
| Trifluoroacetic acid | Sigma-Aldrich | T6508 | |
| Ultimate 3000 HPLC | Dionex | ||
| Urea | Sigma-Aldrich | U5378 | |
| Vacuum Concentrator 5301 | Eppendorf | Speed vac |
References
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