글로벌 및 신뢰도가 높은 단백질 R-메틸화 분석을 위한 질량분석법 기반 단백질체학 접근법
Summary
단백질 아르기닌 (R)- 메틸화는 여러 생물학적 경로를 조절하는 광범위한 번역 후 변형입니다. 질량분석법은 변형된 펩타이드 농축을 위한 생화학적 접근법과 결합될 때 R-메틸-프로테옴을 전 세계적으로 프로파일링하는 최고의 기술입니다. 인간 세포에서 글로벌 R-메틸화의 높은 신뢰도 식별을 위해 설계된 워크플로우가 여기에 설명되어 있습니다.
Abstract
단백질 아르기닌(R)-메틸화는 RNA 처리, 신호 전달, DNA 손상 반응, miRNA 생물 발생 및 번역을 포함한 여러 세포 경로의 조절에 관여하는 광범위한 단백질 번역 후 변형(PTM)입니다.
최근 몇 년 동안 생화학 및 분석 개발 덕분에 질량분석법(MS) 기반 단백질체학이 단일 부위 분해능으로 세포 메틸-단백질체를 특성화하는 가장 효과적인 전략으로 부상했습니다. 그러나 MS에 의한 생체 내 단백질 R- 메틸화를 식별하고 프로파일 링하는 것은 주로 이러한 변형의 화학 양 론적 특성과 다양한 아미노산 치환의 존재 및 메틸화에 등압 인 산성 잔기의 화학적 메틸 에스테르 화로 인해 여전히 까다롭고 오류가 발생하기 쉽습니다. 따라서 R-메틸-펩타이드의 식별을 향상시키기 위한 농축 방법과 메틸-단백질체학 연구에서 거짓 발견률(FDR)을 줄이기 위한 직교 검증 전략이 필요합니다.
여기에서는 세포의 대사 표지와 중위원소 암호화 메티오닌(hmSILAC) 및 전체 세포 추출물의 이중 프로테아제 용액 내 분해를 결합한 후 안티-pan-R-메틸 항체를 사용한 R-메틸-펩타이드의 오프라인 고pH 역상(HpH-RP) 크로마토그래피 분획 및 R-메틸 펩타이드의 친화성 농축을 결합한 후 세포 샘플에서 신뢰도가 높은 R-메틸 펩타이드 식별 및 정량을 위해 특별히 설계된 프로토콜에 대해 설명합니다. 고분해능 MS 분석 시 원시 데이터는 먼저 MaxQuant 소프트웨어 패키지로 처리된 다음 MaxQuant 출력 파일 내에서 가볍고 무거운 메틸-펩타이드에 해당하는 MS 피크 쌍의 심층 검색을 위해 설계된 소프트웨어인 hmSEEKER에 의해 분석됩니다.
Introduction
아르기닌 (R)-메틸화는 포유류 프로테옴 1의 약1%를 장식하는 번역 후 변형(PTM)입니다. 단백질 아르기닌 메틸 트랜스퍼 라제 (PRMT)는 R의 측쇄의 구아니디노 그룹의 질소 (N) 원자에 하나 또는 두 개의 메틸기를 대칭 또는 비대칭 방식으로 증착하여 R- 메틸화 반응을 촉매하는 효소입니다. 포유류에서 PRMT는 모노메틸화(MMA) 및 비대칭 디메틸화(ADMA), MMA 및 대칭 디메틸화(SDMA) 또는 MMA만 각각 2,3. PRMT는 주로 GAR 모티프로 알려진 글리신 및 아르기닌이 풍부한 영역 내에 위치한 R 잔기를 표적으로 하지만 PRMT5 및 CARM1과 같은 일부 PRMT는 프롤린-글리신-메티오닌이 풍부한(PGM) 모티프를 메틸화할 수있습니다4. R-메틸화는 RNA 스플라이싱5, DNA 복구6, miRNA 생물발생7 및 번역2와 같은 여러 생물학적 과정의 단백질 조절제로 등장하여 이 PTM에 대한 연구를 촉진했습니다.
질량분석법(MS)은 단백질, 펩타이드 및 부위 분해능에서 글로벌 R-메틸화를 체계적으로 연구하는 가장 효과적인 기술로 인정받고 있습니다. 그러나 이 PTM은 MS에 의한 높은 신뢰도 식별을 위해 몇 가지 특별한 예방 조치가 필요합니다. 첫째, R- 메틸화는 화학 양 론적이며, 변형되지 않은 형태의 펩타이드는 변형 된 것보다 훨씬 풍부하므로 데이터 종속 수집 (DDA) 모드에서 작동하는 질량 분석기는 고강도 변형되지 않은 펩타이드를 저강도 메틸화 대응 물보다 더 자주 단편화합니다8. 또한 R-메틸화 부위 식별을 위한 대부분의 MS 기반 워크플로우는 생물정보학적 분석 수준에서 한계가 있습니다. 실제로, 메틸 펩타이드의 전산 식별은 높은 거짓 발견률 (FDR)을 갖기 쉽는데,이 PTM은 다양한 아미노산 치환 (예 : 글리신을 알라닌으로) 및 화학적 변형 (예 : 아스 파르 테이트 및 글루타메이트9)의 메틸 에스테르 화에 등압하기 때문입니다. 따라서 세포 배양에서 아미노산을 사용한 중질 메틸 안정 동위원소 표지(hmSILAC)와 같은 메틸기의 동위원소 표지를 기반으로 하는 방법은 생체 내 메틸화의 신뢰할 수 있는 MS 식별을 위한 직교 전략으로 구현되어 위양성 주석의 비율을 크게 줄였습니다10.
최근에는 R-메틸화 단백질을 연구하기 위한 다양한 프로테옴 전체 프로토콜이 최적화되었습니다. R-메틸-펩티드의 면역-친화성 농축을 위한 항체-기반 전략의 개발은인간 세포에서 수백개의 R-메틸화 부위의 주석을 달게 하였다11,12. 또한 많은 연구 3,13에서 항체 기반 농축을 HpH-RP 크로마토그래피 분획과 같은 펩타이드 분리 기술과 결합하면 식별된 메틸 펩타이드의 전체 수를 늘릴 수 있다고 보고했습니다.
이 논문은 hmSILAC 표지 세포에서 단백질 추출, 트립신 및 리사르기나제 프로테아제를 사용한 병렬 이중 효소 분해, MMA-, SDMA-, 및 ADMA-함유 펩티드를 포함한다. 그런 다음 모든 친화도가 풍부한 펩타이드는 DDA 모드에서 고분해능 액체 크로마토그래피(LC)-MS/MS로 분석되고 원시 MS 데이터는 R-메틸 펩타이드 식별을 위해 MaxQuant 알고리즘으로 처리됩니다. 마지막으로, MaxQuant 출력 결과는 무겁고 가벼운 메틸 펩타이드 쌍을 검색하기 위해 자체 개발 한 생물 정보학 도구 인 hmSEEKER로 처리됩니다. 간단히 말해서, hmSEEKER는 msms 파일에서 메틸-펩타이드 식별을 읽고 필터링한 다음 각 메틸-펩타이드를 allPeptides 파일의 해당 MS1 피크와 일치시키고, 마지막으로 중/경량 펩타이드 대응물의 피크를 검색합니다. 각 추정 헤비라이트 쌍에 대해 Log2 H/L 비율(LogRatio), 머무름 시간 차이(dRT) 및 질량 오차(ME) 매개변수가 계산되고 사용자 정의 컷오프 내에 있는 이중선은 참양성으로 레이블이 지정됩니다. 생화학 프로토콜의 워크 플로우는 그림 1에 설명되어 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
글로벌 MS 기반 단백질체학에 의한 생체 내 단백질/펩타이드 메틸화의 높은 신뢰도 식별은 높은 FDR의 위험으로 인해 어려운 일이며, 시료 준비 중에 메틸화에 등압성인 여러 아미노산 치환 및 메틸 에스테르화가 발생하고 직교 MS 검증 전략이 없는 경우 잘못된 할당을 유발할 수 있습니다. 이 PTM의 화학량론적 특성은 글로벌 메틸-단백질체학의 작업을 더욱 복잡하게 만들지만, 변형된 펩타이…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
MM과 EM은 유럽 분자 의학 학교 (SEMM)의 박사 과정 학생입니다. EM은 3 년 FIRC-AIRC 보조금 (프로젝트 코드 : 22506)의 수혜자입니다. TB 그룹의 R- 메틸 단백질체에 대한 글로벌 분석은 AIRC IG 보조금 (프로젝트 코드 : 21834)에 의해 지원됩니다.
Materials
| Ammonium Bicarbonate (AMBIC) | Sigma-Aldrich | 09830 | |
| Ammonium Persulfate (APS) | Sigma-Aldrich | 497363 | |
| C18 Sep-Pak columns vacc 6cc (1g) | Waters | WAT036905 | |
| Colloidal Coomassie staining Instant | Sigma-Aldrich | ISB1L-1L | |
| cOmplete Mini, EDTA-free | Roche-Sigma Aldrich | 11836170001 | Protease Inhibitor |
| Dialyzed Fetal Bovine Serum (FBS) | GIBCO ThermoFisher | 26400-044 | |
| DL-Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | 3483-12-3 | |
| DMEM Medium | GIBCO ThermoFisher | requested | with stabile glutamine and without methionine |
| EASY-nano LC 1200 chromatography system | ThermoFisher | ||
| EASY-Spray HPLC Columns | ThermoFisher | ES907 | |
| Glycerolo | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| HeLa cells | ATCC | ATCC CCL-2 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Iodoacetamide (IAA) | Sigma-Aldrich | 144-48-9 | |
| Jupiter C12-RP column | Phenomenex | 00G-4396-E0 | |
| L-Methionine | Sigma-Aldrich | M5308 | Light (L) Methionine |
| L-Methionine-(methyl-13C,d3) | Sigma-Aldrich | 299154 | Heavy (H) Methionine |
| LysargiNase | Merck Millipore | EMS0008 | |
| Microtip Cell Disruptor Sonifier 250 | Branson | ||
| N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| Penicillin-Streptomycin | GIBCO ThermoFisher | 15140122 | |
| PhosSTOP | Roche-Sigma Aldrich | 4906837001 | Phosphatase Inhibitor |
| Pierce C18 Tips | ThermoFisher | 87782 | |
| Pierce 0.1% Formic Acid (v/v) in Acetonitrile, LC-MS Grade | ThermoFisher | 85175 | LC-MS Solvent B |
| Pierce 0.1% Formic Acid (v/v) in Water, LC-MS Grade | ThermoFisher | 85170 | LC-MS Solvent A |
| Pierce Acetonitrile (ACN), LC-MS Grade | ThermoFisher | 51101 | |
| Pierce Water, LC-MS Grade | ThermoFisher | 51140 | |
| Polyacrylamide | Sigma-Aldrich | 92560 | |
| Precision Plus Protein All Blue Prestained Protein Standards | Bio-Rad | 1610373 | |
| PTMScan antibodies α-ADMA | Cell Signaling Technology | 13474 | |
| PTMScan antibodies α-MMA | Cell Signaling Technology | 12235 | |
| PTMScan antibodies α-SDMA | Cell Signaling Technology | 13563 | |
| Q Exactive HF Hybrid Quadrupole-Orbitrap Mass Spectrometer | ThermoFisher | ||
| Sequencing Grade Modified Trypsin | Promega | V5113 | |
| Trifluoroacetic acid | Sigma-Aldrich | T6508 | |
| Ultimate 3000 HPLC | Dionex | ||
| Urea | Sigma-Aldrich | U5378 | |
| Vacuum Concentrator 5301 | Eppendorf | Speed vac |
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