Uma Abordagem Proteômica Baseada em Espectrometria de Massa para Análise de R-Metilação de Proteínas Global e de Alta Confiança
Summary
A proteína arginina (R)-metilação é uma modificação pós-translacional generalizada que regula múltiplas vias biológicas. A espectrometria de massas é a melhor tecnologia para traçar globalmente o perfil do R-metil-proteoma, quando acoplada a abordagens bioquímicas para enriquecimento peptídico modificado. O fluxo de trabalho projetado para a identificação de alta confiança da R-metilação global em células humanas é descrito aqui.
Abstract
A proteína arginina (R)-metilação é uma modificação pós-traducional (PTM) generalizada de proteínas envolvida na regulação de várias vias celulares, incluindo processamento de RNA, transdução de sinal, resposta a danos no DNA, biogênese de miRNA e tradução.
Nos últimos anos, graças aos desenvolvimentos bioquímicos e analíticos, a proteômica baseada em espectrometria de massa (EM) emergiu como a estratégia mais eficaz para caracterizar o metilproteoma celular com resolução de sítio único. No entanto, a identificação e o perfil da R-metilação da proteína in vivo pela EM continuam a ser desafiantes e propensos a erros, principalmente devido à natureza subestequiométrica desta modificação e à presença de várias substituições de aminoácidos e metil-esterificação química de resíduos ácidos que são isobáricos à metilação. Assim, são necessários métodos de enriquecimento para melhorar a identificação de peptídeos-R-metil e estratégias de validação ortogonal para reduzir as Taxas de Falsa Descoberta (FDR) em estudos de metilproteômica.
Aqui, um protocolo projetado especificamente para identificação e quantificação de peptídeos R-metil de alta confiança a partir de amostras celulares é descrito, que combina marcação metabólica de células com metionina codificada em isótopos pesados (hmSILAC) e digestão em solução de protease dupla de extrato de célula inteira, seguida por fracionamento de cromatografia off-line de fase reversa de pH alto (HpH-RP) e enriquecimento de afinidade de peptídeos R-metil usando anticorpos anti-pan-R-metil. Após a análise de MS de alta resolução, os dados brutos são primeiro processados com o pacote de software MaxQuant e os resultados são então analisados pelo hmSEEKER, um software projetado para a pesquisa aprofundada de pares de pico MS correspondentes ao peptídeo metil leve e pesado dentro dos arquivos de saída MaxQuant.
Introduction
A arginina (R)-metilação é uma modificação pós-translacional (PTM) que decora cerca de 1% do proteomade mamíferos 1. A proteína arginina metiltransferases (PRMTs) são as enzimas que catalisam a reação de R-metilação pela deposição de um ou dois grupos metil aos átomos de nitrogênio (N) do grupo guanidino da cadeia lateral de R de maneira simétrica ou assimétrica. Em mamíferos, os PRMTs podem ser agrupados em três classes – tipo I, tipo II e tipo III – dependendo de sua capacidade de depositar monometilação (MMA) e dimetilação assimétrica (ADMA), MMA e dimetilação simétrica (SDMA) ou apenas MMA, respectivamente 2,3. Os PRMTs visam principalmente resíduos de R localizados em regiões ricas em glicina e arginina, conhecidos como motivos GAR, mas alguns PRMTs, como PRMT5 e CARM1, podem metilar motivos ricos em prolina-glicina-metionina (PGM)4. A R-metilação emergiu como um modulador de proteínas de vários processos biológicos, como o splicing de RNA 5, o reparo de DNA6, a biogênesede miRNA7 e a tradução2, fomentando a pesquisa sobre esse PTM.
A espectrometria de massa (EM) é reconhecida como a tecnologia mais eficaz para estudar sistematicamente a R-metilação global na resolução de proteínas, peptídeos e locais. No entanto, este PTM requer algumas precauções particulares para a sua identificação de alta confiança pela EM. Primeiro, a R-metilação é subestequiométrica, com a forma não modificada dos peptídeos sendo muito mais abundante do que os modificados, de modo que os espectrômetros de massa que operam no modo de Aquisição Dependente de Dados (DDA) fragmentarão peptídeos não modificados de alta intensidade com mais frequência do que suas contrapartes metiladas de baixa intensidade8. Além disso, a maioria dos fluxos de trabalho baseados em EM para identificação de locais R-metilados sofre de limitações no nível de análise bioinformática. De fato, a identificação computacional de metilpeptídeos é propensa a altas Taxas de Falsa Descoberta (FDR), porque esse PTM é isobárico a várias substituições de aminoácidos (por exemplo, glicina em alanina) e modificações químicas, como metilesterificação de aspartato e glutamato9. Assim, métodos baseados na marcação isotópica de grupos metil, como o Heavy Methyl Stable Isotope Labeling with Amino Acids in Cell culture (hmSILAC), têm sido implementados como estratégias ortogonais para a identificação confiante de MS de metilações in vivo , reduzindo significativamente a taxa de anotações falso-positivas10.
Recentemente, vários protocolos de proteoma para estudar proteínas R-metiladas foram otimizados. O desenvolvimento de estratégias baseadas em anticorpos para o enriquecimento por imunoafinidade de peptídeos-R-metil levou à anotação de várias centenas de sítios R-metilados em células humanas11,12. Além disso, muitos estudos 3,13 relataram que o acoplamento do enriquecimento baseado em anticorpos com técnicas de separação peptídica, como o fracionamento por cromatografia HpH-RP, pode aumentar o número total de metilpeptídeos identificados.
Este artigo descreve uma estratégia experimental desenhada para a identificação sistemática e de alta confiança de sítios R-metilados em células humanas, com base em várias etapas bioquímicas e analíticas: extração de proteínas de células marcadas com hmSILAC, digestão enzimática dupla paralela com proteases de tripsina e lisarginase, seguida de fracionamento cromatográfico de peptídeos digeridos por HpH-RP, juntamente com enriquecimento de imuno-afinidade baseado em anticorpos de MMA-, SDMA-, e peptídeos contendo ADMA. Todos os peptídeos enriquecidos com afinidade são então analisados por cromatografia líquida de alta resolução (LC)-MS/MS no modo DDA, e os dados brutos de MS são processados pelo algoritmo MaxQuant para identificação de peptídeos R-metil. Finalmente, os resultados de saída do MaxQuant são processados com o hmSEEKER, uma ferramenta de bioinformática desenvolvida internamente para pesquisar pares de metilpeptídeos pesados e leves. Resumidamente, o hmSEEKER lê e filtra as identificações de metilpeptídeos do arquivo msms, depois combina cada peptídeo de metila com seu pico MS1 correspondente no arquivo allPeptides e, finalmente, procura o pico da contraparte de peptídeo pesado / leve. Para cada suposto par de pesos pesados, os parâmetros Log2 H/L ratio (LogRatio), Retention Time difference (dRT) e Mass Error (ME) são calculados e os doublets localizados dentro de pontos de corte definidos pelo usuário são rotulados como verdadeiros positivos. O fluxo de trabalho do protocolo bioquímico está descrito na Figura 1.
Protocol
Representative Results
Discussion
A identificação de alta confiança da metilação de proteínas/peptídeos in vivo por proteômica global baseada em EM é um desafio, devido ao risco de alta FDR, com várias substituições de aminoácidos e metilesterificação ocorrendo durante o preparo da amostra que são isobáricas à metilação e podem causar atribuições erradas na ausência de estratégias ortogonais de validação da EM. A natureza subestequiométrica desse PTM complica ainda mais a tarefa da metilproteômica global, mas pode ser…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
MM e EM são estudantes de doutoramento da Escola Europeia de Medicina Molecular (SEMM). O EM é o destinatário de uma bolsa FIRC-AIRC de 3 anos (Código do Projeto: 22506). As análises globais de R-metil-proteomas no grupo TB são apoiadas pelo AIRC IG Grant (Código do Projeto: 21834).
Materials
| Ammonium Bicarbonate (AMBIC) | Sigma-Aldrich | 09830 | |
| Ammonium Persulfate (APS) | Sigma-Aldrich | 497363 | |
| C18 Sep-Pak columns vacc 6cc (1g) | Waters | WAT036905 | |
| Colloidal Coomassie staining Instant | Sigma-Aldrich | ISB1L-1L | |
| cOmplete Mini, EDTA-free | Roche-Sigma Aldrich | 11836170001 | Protease Inhibitor |
| Dialyzed Fetal Bovine Serum (FBS) | GIBCO ThermoFisher | 26400-044 | |
| DL-Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | 3483-12-3 | |
| DMEM Medium | GIBCO ThermoFisher | requested | with stabile glutamine and without methionine |
| EASY-nano LC 1200 chromatography system | ThermoFisher | ||
| EASY-Spray HPLC Columns | ThermoFisher | ES907 | |
| Glycerolo | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| HeLa cells | ATCC | ATCC CCL-2 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Iodoacetamide (IAA) | Sigma-Aldrich | 144-48-9 | |
| Jupiter C12-RP column | Phenomenex | 00G-4396-E0 | |
| L-Methionine | Sigma-Aldrich | M5308 | Light (L) Methionine |
| L-Methionine-(methyl-13C,d3) | Sigma-Aldrich | 299154 | Heavy (H) Methionine |
| LysargiNase | Merck Millipore | EMS0008 | |
| Microtip Cell Disruptor Sonifier 250 | Branson | ||
| N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| Penicillin-Streptomycin | GIBCO ThermoFisher | 15140122 | |
| PhosSTOP | Roche-Sigma Aldrich | 4906837001 | Phosphatase Inhibitor |
| Pierce C18 Tips | ThermoFisher | 87782 | |
| Pierce 0.1% Formic Acid (v/v) in Acetonitrile, LC-MS Grade | ThermoFisher | 85175 | LC-MS Solvent B |
| Pierce 0.1% Formic Acid (v/v) in Water, LC-MS Grade | ThermoFisher | 85170 | LC-MS Solvent A |
| Pierce Acetonitrile (ACN), LC-MS Grade | ThermoFisher | 51101 | |
| Pierce Water, LC-MS Grade | ThermoFisher | 51140 | |
| Polyacrylamide | Sigma-Aldrich | 92560 | |
| Precision Plus Protein All Blue Prestained Protein Standards | Bio-Rad | 1610373 | |
| PTMScan antibodies α-ADMA | Cell Signaling Technology | 13474 | |
| PTMScan antibodies α-MMA | Cell Signaling Technology | 12235 | |
| PTMScan antibodies α-SDMA | Cell Signaling Technology | 13563 | |
| Q Exactive HF Hybrid Quadrupole-Orbitrap Mass Spectrometer | ThermoFisher | ||
| Sequencing Grade Modified Trypsin | Promega | V5113 | |
| Trifluoroacetic acid | Sigma-Aldrich | T6508 | |
| Ultimate 3000 HPLC | Dionex | ||
| Urea | Sigma-Aldrich | U5378 | |
| Vacuum Concentrator 5301 | Eppendorf | Speed vac |
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