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Immunology and Infection

Antivirale Hochdurchsatz-Assays zum Screening auf Inhibitoren der Zika-Virusreplikation

Published: October 30, 2021 doi: 10.3791/62422
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1São Carlos Institute of Physics, University of Sao Paulo

Summary

In dieser Arbeit beschreiben wir die Protokolle, die in replikonbasierten und viralen enzymbasierten Assays verwendet werden, um in einem Hochdurchsatz-Screening-Format nach Inhibitoren der Zika-Virusreplikation zu suchen.

Abstract

Die Entdeckung antiviraler Medikamente erfordert die Entwicklung zuverlässiger biochemischer und zellulärer Assays, die in Hochdurchsatz-Screening-Formaten (HTS) durchgeführt werden können. Es wird angenommen, dass sich die nichtstrukturellen Flavivirusproteine (NS) kotranslational auf den endoplasmatischen Retikulummembranen (ER) zusammensetzen und den Replikationskomplex (RC) bilden. Die NS3 und NS5 sind die am besten untersuchten Enzyme der RC und stellen aufgrund ihrer entscheidenden Rolle bei der Replikation des viralen Genoms die Hauptziele für die Arzneimittelentwicklung dar. Die NS3-Proteasedomäne, die NS2B als Cofaktor benötigt, ist für die Spaltung des unreifen viralen Polyproteins in die reifen NS-Proteine verantwortlich, während die NS5 RdRp-Domäne für die RNA-Replikation verantwortlich ist. Hierin beschreiben wir detailliert die Protokolle, die in replicon-basierten Screenings und enzymatischen Assays verwendet werden, um große Verbindungsbibliotheken auf Inhibitoren der Zika-Virus-Replikation (ZIKV) zu testen. Replicons sind selbstreplizierende subgenomische Systeme, die in Säugetierzellen exprimiert werden, in denen die viralen Strukturgene durch ein Reportergen ersetzt werden. Die hemmenden Wirkungen von Verbindungen auf die virale RNA-Replikation können leicht bewertet werden, indem die Verringerung der Reporterproteinaktivität gemessen wird. Die replicon-basierten Screenings wurden mit einer BHK-21 ZIKV Replicon Zelllinie durchgeführt, die Renilla Luciferase als Reportergen exprimierte. Um die spezifischen Ziele der identifizierten Verbindungen zu charakterisieren, haben wir in-vitro-fluoreszenzbasierte Assays für rekombinant exprimierte NS3-Protease und NS5 RdRp etabliert. Die proteolytische Aktivität der viralen Protease wurde unter Verwendung des fluorogenen Peptidsubstrats Bz-nKRR-AMC gemessen, während die NS5 RdRp-Dehnungsaktivität direkt durch die Erhöhung des fluoreszierenden Signals von SYBR Green I während der RNA-Elongation unter Verwendung der synthetischen biotinylierten selbstansaugenden Vorlage 3′UTR-U30 (5'-Biotin-U30-ACUGGAGAUCGAUCUCCAGU-3') nachgewiesen wurde.

Introduction

Das Zika-Virus (ZIKV) ist ein neu auftretendes arthropodenübertragenes Virus, das zur Gattung Flavivirusgehört, zu der das eng verwandte Dengue-Virus (DENV), das Japanische Enzephalitis-Virus (JEV) und das Gelbfiebervirus (YFV) gehören, die eine ständige Bedrohung für die öffentliche Gesundheit darstellen1. Der ZIKV-Ausbruch 2015-16 in Amerika erhielt weltweite Aufmerksamkeit nach seinem Auftreten in Brasilien aufgrund der Assoziation mit schweren neurologischen Störungen, wie angeborener ZIKV-assoziierter Mikrozephalie bei Neugeborenen2,3 und Guillain-Barré-Syndrom bei Erwachsenen4. Obwohl die Zahl der Infektionsfälle in den nächsten zwei Jahren zurückging, wurden autochthone durch Mücken übertragene Übertragungen von ZIKV im Jahr 2019 in 87 Ländern und Gebieten nachgewiesen, was das Potenzial des Virus belegt, als Epidemie wieder aufzutauchen5. Bis heute gibt es keine zugelassenen Impfstoffe oder wirksamen Medikamente gegen ZIKV-Infektionen.

Die Entdeckung antiviraler Medikamente erfordert die Entwicklung zuverlässiger zellulärer und biochemischer Assays, die in Hochdurchsatz-Screening-Formaten (HTS) durchgeführt werden können. Replicon-basierte Screenings und virale enzymbasierte Assays sind zwei wertvolle Strategien, um niedermolekulare Verbindungen auf Inhibitoren von ZIKV1zu testen. Es wird angenommen, dass sich die nichtstrukturellen Flavivirusproteine (NS) kotranslational auf den endoplasmatischen Retikulummembranen (ER) zusammensetzen und den Replikationskomplex (RC)bilden 6. Die NS3 und NS5 sind die am besten untersuchten Enzyme der RC und stellen aufgrund ihrer entscheidenden Rolle bei der Replikation des viralen Genoms die Hauptziele für die Arzneimittelentwicklung dar. Die NS3-Proteasedomäne, die NS2B als Cofaktor benötigt, ist für die Spaltung des unreifen viralen Polyproteins in die reifen NS-Proteine verantwortlich, während die NS5 RdRp-Domäne für die RNA-Replikation verantwortlich ist6.

Replicons sind selbstreplizierende subgenomische Systeme, die in Säugetierzellen exprimiert werden, in denen die viralen Strukturgene durch ein Reportergen ersetzt werden. Die hemmenden Wirkungen von Verbindungen auf die virale RNA-Replikation können leicht bewertet werden, indem die Verringerung der Reporterproteinaktivität gemessen wird7. Hierin beschreiben wir die Protokolle, die für screening-Inhibitoren der ZIKV-Replikation in einem 96-Well-Plattenformat verwendet werden. Die Replicon-basierten Assays wurden mit einer BHK-21 ZIKV Rluc Replicon Zelllinie durchgeführt, die wir kürzlich entwickelt haben8. Um die spezifischen Targets der identifizierten Verbindungen zu charakterisieren, haben wir in vitro fluoreszenzbasierte Assays für rekombinant exprimierte NS3-Protease unter Verwendung des fluorogenen Peptidsubstrats Bz-nKRR-AMC etabliert, während wir für NS5 RdRp die Dehnung der synthetischen biotinylierten selbstansaugenden Schablone 3′UTR-U30 (5'-Biotin-U30-ACUGGAGAUCGAUCUCCAGU-3') mit dem interkalierenden Farbstoff SYBR Green I gemessen haben.

Die ZIKV-Protease (45-96 Rückstände des NS2B-Cofaktors, die mit den Rückständen 1-177 der NS3-Proteasedomäne durch einen glycinreichen Linker[G4SG4])verbunden sind, wurde wie für YFV9beschrieben erhalten, während die Polymerase (276-898 Rückstände der RdRp-Domäne) geklont und exprimiert wurde, wie in10beschrieben. Beide Enzymsequenzen wurden von GenBank ALU33341.1 abgeleitet. Als primäre antivirale Screenings werden Verbindungen bei 10 μM getestet und diejenigen, die Aktivitäten ≥ 80% zeigen, werden dann dosisabhängig bewertet, was zu den Effektiv-/Hemmungs- (EC50 oder IC50)und den zytotoxischen (CC50)Konzentrationen führt. Im Rahmen repräsentativer Ergebnisse werden die EC50- und CC50-Werte von NITD008, einem bekannten Flavivirusinhibitor11,aus replicon-basierten Screenings gezeigt. Für die enzymatischen Assays werden die IC50-Werte von zwei Verbindungen aus der MMV/DNDi Pandemic Response Box, einer Bibliothek aus 400 Molekülen mit antibakteriellen, antimykotischen und antiviralen Aktivitäten, gezeigt. Die in dieser Arbeit beschriebenen Protokolle könnten modifiziert werden, um nach Inhibitoren anderer verwandter Flaviviren zu suchen.

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Protocol

1. Luciferase-Aktivitätstest

HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass alle Verfahren mit Zellkultur in zertifizierten Biosicherheitshauben durchgeführt werden (siehe Materialtabelle).

  1. Bereiten Sie Wachstumsmedien vor, die aus Dulbeccos Modified Eagle's Medium (DMEM) bestehen, ergänzt mit 10% FBS und 500 μg/ml G418.
  2. Bereiten Sie eine 10 mM Stammlösung aus getesteten Verbindungen in 100% DMSO vor und verdünnen Sie sie dann auf 1 mM in 100% DMSO.
  3. Kultur ZIKV Rluc Replikonzellen in Wachstumsmedien in einem 75 cm2 Kulturkolben bei 37 °C in einem CO2-befeuchteten Inkubator (siehe Materialtabelle),bis sie eine 70-90%ige Konfluenz erreichen.
  4. Verwerfen Sie das Medium. 5 ml Trypsin-EDTA für 5 bis 10 min in den Kolben geben und dann die Zellen bei 125 x g für 5 min zentrifugieren.
  5. Verwerfen Sie den Überstand, resuspendieren Sie die Zellen in 5 mL DMEM 10% FBS und zählen Sie 10 μL resuspendierte Zellen an einem Hämozytometer.
  6. Stellen Sie die Zellen auf 2 x 104 Zellen/Vertiefung in DMEM 10% FBS ein und säen Sie 100 μL Zellen pro Vertiefung in einer 96-Well-Zellkulturplatte (siehe Materialtabelle).
  7. Inkubieren Sie die Platte für 16 h bei 37 °C in einem CO2-befeuchteten Inkubator (siehe Materialtabelle).
  8. Als nächstes entsorgen Sie das Medium mit einer Mehrkanal-Mikropipette und fügen Sie der Platte 100 μL / Well DMEM 2% FBS hinzu.
  9. Fügen Sie 1 μL der Verbindungen pro Vertiefung hinzu, um eine Endkonzentration von 10 μM 1% DMSO im Assay-Medium zu erhalten. Fügen Sie in der ersten Spalte nur 1% DMSO als Keine Inhibitionskontrolle und NITD008 in der letzten Spalte als Positivkontrolle (100% Inhibition) hinzu.
  10. Inkubieren Sie die Platte für 48 h bei 37 °C in einem CO2-befeuchteten Inkubator (siehe Materialtabelle).
  11. Tauen Sie das Renilla Luciferase Assay System Kit bei Raumtemperatur auf, bereiten Sie eine 1x Renilla Luciferase Lysis Buffer Arbeitslösung und ein geeignetes Volumen Reagenz Renilla Luciferase (Assay Puffer + Substrat; 100 μL pro Vertiefung) gemäß den Anweisungen des Herstellers vor.
  12. Verwerfen Sie den Überstand aus den Zellen mit einer Mehrkanal-Mikropipette und fügen Sie 25 μL 1x Renilla luciferase Lysis Buffer pro Vertiefung hinzu.
  13. Inkubieren Sie die Platte bei Raumtemperatur für 15 min und übertragen Sie dann 20 μL Zelllysate mit einer Mehrkanal-Mikropipette auf eine weiße, undurchsichtige 96-Well-Platte (siehe Materialtabelle),die 100 μL/Well Renilla luciferase Assay Reagenz enthält.
  14. Lesen Sie die Lumineszenzsignale in einem Luminometer oder in jedem Gerät, das die Möglichkeit hat, Lumineszenz zu lesen (siehe Materialtabelle).
  15. Berechnen Sie für jede Platte den Z-Faktorwert 12wie folgt: Z′ = 1 - ((3SD der Probe + 3SD der Kontrolle)/│Mittelwert der Probe - Mittelwert der Kontrolle│); SD - Standardabweichung. Ein Z-Faktor zwischen 0,5 und 1,0 bedeutet einen assay von guter Qualität 12.
  16. Um die EC50-Werte von Verbindungen zu bestimmen, gehen Sie wie in den Schritten 1.3 bis 1.8 beschrieben vor und fügen Sie dann die serienmäßig verdünnten Verbindungen zusammen mit den negativen (1% DMSO) und positiven (NITD008 bei 10 μM) Kontrollen zu den Zellen hinzu. Führen Sie den Assay zweimal in Duplikaten durch.
  17. Zeichnen Sie die Durchschnittswerte der Inhibitionsraten pro Verbindungskonzentration auf und verwenden Sie eine Graphanalysesoftware, um eine sigmoidale Anpassung durchzuführen und die EC50-Werte zu erhalten.

2. Zellproliferationsbasierter MTT-Assay

  1. Gehen Sie wie in Punkt 1 Schritte 1.1 bis 1.8 beschrieben vor.
  2. Fügen Sie die Verbindungen zunächst bei 10 μM und die Kontrolle 1% DMSO zu den Zellen hinzu.
  3. Eine 5 mg/ml MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid)-Lösung in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS - 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mMNa2HPO4,1,8 mMKH2PO4;pH 7,4) und Wirbel bis zur vollständigen Lösung von MTT wird hergestellt.
  4. Fügen Sie die MTT-Lösung den Zellen bei einem Zehntel des Bohrvolumens (10 μL/Well) hinzu.
  5. Inkubieren Sie die Platte bei 37 °C in einem CO2-befeuchteten Inkubator (siehe Materialtabelle)für 3-4 h.
  6. Verwerfen Sie den Überstand mit einer Mehrkanal-Mikropipette und fügen Sie jeder Vertiefung 100 μL DMSO (100%) hinzu.
  7. Solubilisieren Sie die Formazankristalle durch Pipettieren auf und ab und lesen Sie dann die Absorption bei 570 nm in einem Spektralphotometer ab (siehe Materialtabelle).
  8. Um die CC50-Werte von Verbindungen zu bestimmen, gehen Sie wie in Punkt 1 Schritte 1.1 bis 1.8 beschrieben vor und fügen Sie dann die verbindungen seriell verdünnten Verbindungen zu den Zellen hinzu, zusammen mit der negativen (1% DMSO) Kontrolle. Führen Sie den Assay zweimal in Duplikaten durch.
  9. Zeichnen Sie die Durchschnittswerte der Inhibitionsraten pro Verbindungskonzentration auf und verwenden Sie eine Graphanalysesoftware, um eine sigmoidale Anpassung durchzuführen und die CC50-Werte zu erhalten.

3. NS2B-NS3 Protease-Aktivitätstest

  1. Tauen Sie ein Protein-Aliquot auf Eis auf.
  2. Stellen Sie den Plattenleser (siehe Materialtabelle)auf 37°C ein.
  3. Bereiten Sie die entsprechende Menge proteinverdünnt auf 80 nM (5 μL/Well) vor. Die endgültige Proteinkonzentration beträgt 4 nM.
  4. Die entsprechende Menge Bz-nKRR-AMC-Substrat auf Eis auftauen (300 μM Stammlösung verdünnt in Assay-Puffer, 10 μL/Well).
  5. In einer weißen Platte mit 96 Wellen (siehe Materialtabelle)werden 84 μL Assay-Puffer (20 mM Tris pH 8,5, 5% Glycerin und 0,01% Triton X-100) in jede Vertiefung abgegeben.
  6. Um die positive Kontrollreaktion zu machen, werden in jede Vertiefung der letzten Säule 1 μL Aprotinin abgegeben, um eine Endkonzentration von 1 μM zu erreichen (Stammlösung 100 μM in Wasser verdünnt)
  7. Um die negative Kontrollreaktion zu machen, geben Sie an die erste Säule 1 μL DMSO (Endkonzentration 1%).
  8. Um das Compound-Screening durchzuführen, dosieren Sie 1 μL jeder Verbindung, um eine Endkonzentration von 10 μM (1 mM Stammkonzentration) zu erreichen, ohne Positiv- und Negativkontrollbohrungen.
  9. Dosieren Sie 5 μL der Proteaselösung.
  10. Die Platte 30 Minuten lang bei 4 °C inkubieren.
  11. Um die Reaktion zu starten, dosieren Sie 10 μL Bz-nKRR-AMC-Stammlösung (Endkonzentration von 30 μM).
  12. Stellen Sie die Anregungswellenlänge auf 380 nm und die Emission auf 460 nm ein und lesen Sie die Fluoreszenz alle 1 minute in einem Mikroplattenleser für 30 min ab (siehe Materialtabelle). Führen Sie das gesamte Experiment bei 37 °C durch.
  13. Berechnen Sie die Mittelwerte der Fluoreszenz für positive und negative Kontrollreaktionen. Setzen Sie den Mittelwert der Fluoreszenz für negative Kontrollreaktionen auf 100% der Proteaseaktivität ab, abzüglich des Mittelwerts der Positivkontrolle, und berechnen Sie die Aktivitätsprozentsätze für jede Verbindung.
  14. Berechnen Sie für jede Platte den Z-Faktor-Wert, wie in Schritt 1.15 beschrieben.
  15. Fahren Sie mit der IC50-Bestimmung für Verbindungen fort, die eine Hemmrate von mehr als 80% aufwiesen.
  16. Führen Sie den Assay in Triplikaten wie in den Schritten 3.1-3.13 beschrieben unter Verwendung einer seriellen Verdünnung der Verbindung durch.
  17. Zeichnen Sie die Durchschnittswerte der Inhibitionsraten pro Verbindungskonzentration auf und verwenden Sie eine Graphanalysesoftware, um eine sigmoidale Anpassung durchzuführen und die IC50-Werte zu erhalten.

4. NS5 RdRp Elongationstest

HINWEIS: Alle materialien, die in diesem Assay verwendet werden, sind RNase-, DNase- und Pyrogenase-frei zertifiziert.

  1. Bereiten Sie sowohl den Assay-Puffer (50 mM Tris pH 7,0, 2,5 mM MnCl2,0,01% Triton X-100) als auch die 200 mM ATP-Stammlösung mit 0,1% Diethylpyrocarbonat (DEPC) behandeltem Wasser vor.
  2. Ein 5 μL Aliquot von 200 μM 3′UTR-U30 (5'-Biotin-U 30-ACUGGAGAUCGAUCUCCAGU-3') in PCR-behandeltem Wasser anglühen, indem Sie es 5 Minuten bei 55 °C in einem Thermocycler inkubieren.
  3. Tauen Sie die Standardlösung von NS5 RdRp, 200 mM ATP und x10.000 SYBR Green I auf Eis auf.
  4. Verdünnen Sie das Protein auf eine Endkonzentration von 250 nM in 3 ml Assay-Puffer.
  5. Bereiten Sie die Substratlösung vor, indem Sie die Stammlösungen von ATP, 3'UTR-U30 und SYBR Green I in 3 ml Assaypuffer auf eine Endkonzentration von 1 mM, 300 nM bzw. 1X verdünnen.
  6. In einer 96-Well-PCR-Platte (siehe Materialtabelle)werden 24,5 μL verdünntes Protein in den Spalten 1 bis 11 jeder Zeile hinzugefügt. Fügen Sie das gleiche Volumen an Assay-Puffer in die verbleibenden Bohrungen hinzu.
  7. Für die Kontrolle und Die Blindreaktion fügen Sie 0,5 μL DMSO in den Spalten 1 und 12 hinzu. 0,5 μL in DMSO verdünnte Verbindung zu einer Endkonzentration von 10 μM 1mM Stammlösung hinzufügen).
  8. Verschließen Sie die Platte mit einer Dichtfolie und inkubieren Sie sie bei Raumtemperatur für 15 Minuten.
  9. Starten Sie die Reaktion, indem Sie 25 μL Substratlösung hinzufügen und die Platte erneut versiegeln.
  10. Inkubieren Sie bei 30 °C in einem Echtzeit-PCR-System (siehe Materialtabelle)und überwachen Sie die Fluoreszenz für 1 Stunde, wobei die Fluoreszenz alle 30 s mit dem FAM-Filter gemessen wird (Emission: 494 nm / Anregung: 521 nm).
  11. Berechnen Sie für jede Platte den Z-Faktor-Wert, wie in Schritt 1.15 beschrieben.
  12. Fahren Sie mit der IC50-Bestimmung für Verbindungen fort, die eine Hemmrate von mehr als 80% aufwiesen, wie in Schritt 3.15 beschrieben.
  13. Zeichnen Sie die Durchschnittswerte der Inhibitionsraten pro Verbindungskonzentration auf und verwenden Sie eine Graphanalysesoftware, um eine sigmoidale Anpassung durchzuführen und die IC50-Werte zu erhalten.

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Representative Results

Alle hierin beschriebenen Protokolle wurden in 96-Well-Platten festgelegt und ermöglichen die Bewertung von 80 Verbindungen pro Platte in einem primären Screening einer einzigen Konzentration, einschließlich der Negativ- und Positivkontrollen an der ersten bzw. letzten Spalte der Platte. Die replicon-basierten Screenings sind in Abbildung 1dargestellt, die das RNA-Konstrukt enthält, das zur Gewinnung der BHK-21-RepZIKV_IRES-Neo-Zelllinie entwickelt wurde (Abbildung 1A), die schematische Darstellung der Assays (Abbildung 1B) und die Dosis-Wirkungs-Kurven von NITD008 (EC50 von 0,28 μM, CC50 > 10 μM) (Abbildung 1C). DieEC-50- undCC-50-Werte der getroffenen Verbindungen werden als die Konzentrationen bestimmt, die erforderlich sind, um 50% der Rluc-Aktivität zu hemmen und eine Zytotoxizität von 50% zu verursachen. In Bezug auf den Luciferase-Assay wird DMSO 1% als no-inhibitor-Kontrolle (0% Hemmung) und NITD008 als Positivkontrolle (100% Hemmung) verwendet, wie zuvor beschrieben8.

Die NS2B-NS3-Proteaseaktivität wird durch Fluoreszenzüberwachung von AMC gemessen, die aufgrund der proteolytischen Aktivität der Protease freigesetzt wird (Abbildung 2A). Aprotinin, ein Protein, das als Trypsin-Inhibitor wirkt und bereits als Inhibitor der Flavivirus-Proteasen13,14,15beschrieben ist, wurde in diesem Assay als experimentelle Positivkontrolle verwendet (IC50 von 0,13 ± 0,02 μM, Daten nicht gezeigt). Abbildung 2B zeigt eine Dosis-Wirkungs-Inhibitionskurve eines Moleküls, das auf die Proteaseaktivität abzielt, die Verbindung MMV1634402 (IC50 von 0,36 ± 0,08 μM). Die Dehnungsaktivität von NS5 RdRp wird in Echtzeit durch die Erhöhung der Fluoreszenzintensität von SYBR Green I gemessen, wenn sie mit der synthetisierten dsRNA interkaliert wird (Abbildung 2C). Die Dosis-Wirkungs-Inhibitionskurve eines Treffermoleküls, das auf ZIKV RdRp abzielt, die Verbindung MMV1782220 (IC50 von 1,9 ± 0,8 μM), ist in Abbildung 2Ddargestellt. Da Nukleosid-Analoginhibitoren wie NITD008 nicht für enzymatische Assays geeignet sind, da Phosphate intrazellulär in dasMolekül 16eingebaut werden müssen, haben wir keine Positivkontrolle für den NS5 RdRp-Elongationsassay verwendet. Clofazimin, ein kommerzielles Antibiotikum, das wir kürzlich als Inhibitor der viralen Polymerase8identifiziert haben, könnte jedoch als experimentelle Kontrolle in nächsten Assays verwendet werden.

Figure 1
Abbildung 1: Replicon-basierte Screenings. A)Schematische Darstellung des ZIKV-Replicon-Konstrukts, das eine Rluc-Sequenz am 5'-UTR-Terminus und ein Neo-Gen am 3'-UTR-Terminus enthält, das wir entwickelt haben, um die BHK-21-RepZIKV-IRES_Neo Zelllinie 8zu erhalten. B)Schematische Darstellung des Luciferase-Aktivitätstests und des auf Zellproliferation basierenden MTT-Assays, die zum Screening auf Inhibitoren der ZIKV-Replikation durchgeführt wurden. C) Die Dosis-Wirkungs-Kurven (EC50 und CC50) von NITD008. Der Assay wurde in Duplikaten durchgeführt. Fehlerbalken stellen Standardabweichungen dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 2
Abbildung 2: Virale enzymbasierte Assays. A) Schematische Darstellung des NS2B-NS3-Protease-Aktivitätsassays. B)Die Dosis-Wirkungs-Hemmkurve (IC50)der Verbindung MMV1634402. C)Schematische Darstellung des NS5 RdRp RNA Polymerase Aktivität Assays. D) Die Dosis-Wirkungs-Hemmkurve (IC50)der Verbindung MMV1782220. Die Assays wurden in Triplikaten durchgeführt. Fehlerbalken stellen Standardabweichungen dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Discussion

Die hier beschriebenen Protokolle könnten leicht für Screenings in einem 384- oder 1536-Well-Format angepasst werden. Für biochemische und/oder zellbasierte Screenings, die im HTS-Format durchgeführt werden, wird der Z'-Faktorwert, ein statistischer Parameter, für jede Platte berechnet, um die Empfindlichkeit, Reproduzierbarkeit und Genauigkeit dieser Assays sicherzustellen12. Für replicon-basierte Screenings wird ein Z'-Faktorwert von 0,5 oder mehr erwartet, während für die NS3- und NS5-Aktivitätstests ein Wert von 0,7 oder mehr erwartet wird. Für das replikonbasierte HTS haben wir die BHK-21-RepZIKV_IRES-Neo-Zellen entwickelt, eine stabile Zelllinie, die ein replikatives ZIKV-Replicon beherbergt, das eine Renilla luciferase(Rluc)-Sequenz in der 5'-UTR-Region und ein Neomycinphosphotransferase-Gen (Neo) enthält, das von einer internen ribosomalen Eintrittsstelle (IRES) am 3'UTR angetrieben wird. Wir behielten 38 Rückstände von Kapsid und 30 Rückstände von Umhüllungsgenen, die für die korrekte Einleitung der RNA-Translation erforderlich sind, um vergleichbare Replikationsniveaus und Arzneimittelempfindlichkeit zwischen Zellpassagenaufrechtzuerhalten 8. Aufgrund des Mangels an strukturellen Genen produzieren Replikone keine Nachkommenvirionen, wodurch das Risiko einer im Labor erworbenen Virusinfektion eliminiert wird17.

Die antiviralen Assays mit den ZIKV-Replicon-Zellen bestehen aus der Luciferase-Aktivität und den parallel durchgeführten zellproliferationsbasierten MTT-Assays (Cytotoxicity). Dies ist notwendig, um falsch-positive Treffer auszuschließen, die Moleküle umfassen, die direkt die Proteinexpression und/oder -aktivität des Melders stören, und solche, die die Zellgesundheit beeinträchtigen7. Replicon-Systeme ermöglichen die Entdeckung von Molekülen, die die RNA-Replikation hemmen, aber nicht diejenigen, die für den Viruseintritt und die Virionen-Assemblierung / -Freisetzung erforderlich sind. Alternativ können Replikone verpackt werden, um Virusreplicon-Partikel (VRPs) zu produzieren, indem die Strukturproteine in trans17bereitgestellt werden. Die resultierenden single-round infectious particles (SRIPs) sind infektiös, aber das Nachkommenvirus kann sich nicht vermehren, da dem Paketgenom strukturelle Gene fehlen. Daher könnten VRPs verwendet werden, um auf Inhibitoren des Viruseintritts / der Replikation zu testen, indem die Konzentrationen des Reporterproteins7gemessen werden.

Zusätzlich zu den replicon-basierten Screenings haben wir hier auch die Protokolle beschrieben, die in viralen enzymbasierten Assays für die rekombinante NS3-Protease und NS5 RdRp verwendet werden. Die proteolytische Aktivität der viralen Protease wurde mit dem fluorogenen Peptidsubstrat Bz-nKRR-AMC gemessen, das die ZIKV-Proteaseerkennungs- und Spaltungssequenz in Verbindung mit dem fluoreszierenden Tag 7-Amin-4-methylcumarin (AMC) enthält. Durch die Proteaseaktivität wird das fluoreszierende Tag freigesetzt und die Reaktionsgeschwindigkeit direkt durch Überwachung der Fluoreszenz ineinem Spektralphotometer 18,19gemessen. Dieser Assay ist sehr sinnvoll, relativ billig, schnell und geeignet für das Screening großer Verbindungsbibliotheken20,21. Der große Nachteil ist das mögliche Abschrecken zwischen getesteten Verbindungen und dem Fluorophor, das zu falsch-positiven Treffern führen kann. Dieses Problem könnte jedoch durch eine zusätzliche Fluoreszenzmessung in Gegenwart von AMC behoben werden. Auch Verbindungen, die eine Emission oder Absorption in der gleichen Wellenlänge des Fluorophors aufweisen, können mit dieser Methode nicht bewertet werden18,20.

In Bezug auf den NS5 RdRp wird seine Dehnungsaktivität direkt durch die Erhöhung des fluoreszierenden Signals von SYBR Green I während der Dehnung einer selbstansaugenden 3'UTR-U30-Vorlage erkannt. Das Protokoll wurde aus Assays mit interkalierenden Farbstoffen wie Pico Green und SYTO 9 adaptiert, die häufig zur Bewertung von Verbindungen für verschiedene virale Polymerasen22,23 ,24,25,26verwendet wurden . Obwohl wir im Assay eine selbstansaugende biotinylierte Vorlage27 verwendet haben, können auch andere Vorlagen, wie z.B. poliU,25verwendet werden. Der Hauptnachteil dieser Methode ist die hohe Anzahl falsch-positiver Treffer, die mit dem Farbstoff interagieren, entweder durch Interferenz mit der Fluoreszenz oder durch Verringerung der dsRNA-Interkalation28. Daher müssen Hit-Verbindungen mit Gegenassays wie biophysikalischen Methoden oder durch Vergleich der SYBR™ Green I-Fluoreszenz in dsRNA mit und ohne die Verbindung29validiert werden. Dennoch sind die einfache Implementierung, die direkte Messung und die Erschwinglichkeit Schlüsselpunkte für den Einsatz fluoreszenzbasierter Methoden als HTS-Plattformen im Vergleich zu radiomarkierten oder gekoppelten Assays, die in mittleren/großen Kampagnen schwer zu implementieren sind27,30,31.

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Disclosures

Autoren erklären keinen Interessenkonflikt.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde unterstützt durch Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP), CEPID Grant 2013/07600-3 an GO, Grant 2018/05130-3 an RSF und 2016/19712-9 an ASG und Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (Grant 88887.516153/2020-00) an ASG. Wir danken der Medicine for Malaria Ventures (MMV, www.mmv.org) und der Drugs for Neglected Diseases Initiative (DNDi, www.dndi.org) für ihre Unterstützung, das Design der Pandemic Response Box und die Lieferung der Wirkstoffe.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
5'-biotin-U30- ACUGGAGAUCGAUCUCCAGU -3' Dharmacon - 100 ng
96-well cell culture plates KASVI K12-096
96-well PCR Microplate KASVI K4-9610
96-well White Flat Bottom Polystyrene High Bind Microplate Corning 3922
AMC (7-amine-4-methylcoumarin) SIGMA-Aldrich 257370 100 mg
Aprotinin from bovine lung SIGMA-Aldrich A1153 10 mg
ATP JenaBioscience NU-1010-1G 1 g
Bz-nKRR-AMC International Peptides - 5 mg
Class II Biohazard Safety Cabinet ESCO
Diethyl pyrocarbonate SIGMA-Aldrich D5758 25 mL
DMSO (Dimethyl sulfoxide) SIGMA-Aldrich 472301 1 L
Dulbecco’s Modified Eagle Medium GIBCO 3760091
Fetal Bovine Serum GIBCO 12657-029 500 mL
G418 SIGMA-Aldrich A1720 Disulfate salt
Glycerol SIGMA-Aldrich G5516 1 L
HERACELL VIOS 160i CO2 incubator Thermo Scientific
MnCl2 tetrahydrate SIGMA-Aldrich 203734 25 g
MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide) Invitrogen M6494
NITD008 ≥98% (HPLC) Sigma-Aldrich SML2409 5 mg
qPCR system Mx3000P Agilent
Renilla luciferase Assay System PROMEGA E2810
SpectraMax Gemini EM Fluorescence Reader Molecular Devices
SpectraMax i3 Multi-Mode Detection Platform Molecular Devices
SpectraMax Plus 384 Absorbance Microplate Reader Molecular Devices
SYBR Green I Invitrogen S7563 500 µl
Triton X-100 SIGMA-Aldrich X100 500 mL
Trizma base SIGMA-Aldrich T1503 1 kg
Trypsin-EDTA Solution 1X SIGMA-Aldrich 59417-C 100 mL

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Immunologie und Infektion Ausgabe 176
Antivirale Hochdurchsatz-Assays zum Screening auf Inhibitoren der Zika-Virusreplikation
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Fernandes, R. S., Noske, G. D., Gawriljuk, V. O., de Oliveira, K. I. Z., Godoy, A. S., Mesquita, N. C. M. R., Oliva, G. High-throughput Antiviral Assays to Screen for Inhibitors of Zika Virus Replication. J. Vis. Exp. (176), e62422, doi:10.3791/62422 (2021).

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