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Immunology and Infection

지카 바이러스 복제억제제에 대한 화면에 높은 처리량 항 바이러스 적 소사

Published: October 30, 2021 doi: 10.3791/62422
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1São Carlos Institute of Physics, University of Sao Paulo

Summary

이 작품에서, 우리는 높은 처리량 선별 형식으로 Zika 바이러스 복제의 억제제를 선별하기 위하여 보충 기지를 둔 바이러스성 효소 기지를 둔 분석에서 이용된 프로토콜을 기술합니다.

Abstract

항바이러스 약물 발견은 높은 처리량 스크리닝(HTS) 형식으로 수행될 수 있는 신뢰할 수 있는 생화학 및 세포 분석을 개발해야 합니다. 플라비바이러스 비구조적(NS) 단백질은 폐막 성 망막(ER) 멤브레인상에서 공동 적으로 조립하여 복제 복합체(RC)를 형성하는 것으로 생각된다. NS3와 NS5는 RC의 가장 연구된 효소이며 바이러스 성 게놈 복제에 중요한 역할로 인해 약물 개발을위한 주요 목표를 구성합니다. NS3 프로테아제 도메인은 NS2B를 공동 인자로 요구하며, 미성숙 한 바이러스 성 폴리 단백질을 성숙한 NS 단백질로 절단하는 반면 NS5 RdRp 도메인은 RNA 복제를 담당합니다. 본명, 지카 바이러스(ZIKV) 복제억제제에 대한 대형 화합물 라이브러리를 테스트하기 위해 레플리콘 기반 스크리닝 및 효소 분석에 사용되는 프로토콜을 자세히 설명한다. Replicons는 바이러스 구조 유전자가 기자 유전자로 대체되는 포유류 세포에서 발현된 자기 복제 형유증 시스템입니다. 바이러스 RNA 복제에 대한 화합물의 억제 효과는 리포터 단백질 활성의 감소를 측정하여 쉽게 평가할 수 있다. 레플리콘 기반 검진은 레닐라 루시파라제를 리포터 유전자로 발현하는 BHK-21 ZIKV 레플리콘 세포주를 이용하여 수행하였다. 확인된 화합물의 특정 표적을 특성화하기 위해, 당사는 재조합발현 NS3 프로테아제 및 NS5 RdRp를 위한 체외 형광 계 의 애사를 확립했습니다. 바이러스 성 프로테아제의 프로테오리틱 활성은 불소 펩타이드 기질 Bz-nKRR-AMC를 사용하여 측정되었다. NS5 RdRp 신장 활성은 RNA 신장 동안 SYBR Green I의 형광 신호의 증가에 의해 직접 검출되었지만, 합성 바이오티니드 셀프 프라이밍 템플릿 3′UTR-U30(5'-biotin-U30-ACUGGAGAUCCUCUAGU-3')을 이용하여.

Introduction

지카 바이러스(ZIKV)는 플라비바이러스속의 신흥 절지동물 매개 바이러스 로, 밀접하게 관련된 뎅기열 바이러스(DENV), 일본 뇌염 바이러스(JEV) 및 황열병 바이러스(YFV)를 포함하고 있으며, 이는 공중 보건1에지속적인 위협을 가한다. 2015-16 년 미주에서 ZIKV 발발은 신생아2,3 및 길랑 바레 증후군에서 선천성 ZIKV 관련 소두증과 같은 심각한 신경 장애와의 연관성으로 인해 브라질에서 출현 한 후 세계적인 주목을 받았다4. 감염 케이스의 수는 향후 2 년 내내 감소하더라도, ZIKV의 자가 술 모기 매개 전송은 2019년에 87개의 국가 및 영토에서 확인되었습니다, 그러므로, 전염병으로 다시 등장하는 바이러스의 잠재력을 공고히5. 현재까지 ZIKV 감염에 대한 승인된 백신이나 효과적인 약물은 없습니다.

항바이러스 약물 발견은 높은 처리량 스크리닝(HTS) 형식으로 수행될 수 있는 신뢰할 수 있는 세포 및 생화학적 분석을 개발해야 한다. Replicon 기반 스크리닝 및 바이러스 효소 기반 어약은 ZIKV1의억제제에 대한 소분자 화합물을 테스트하는 두 가지 중요한 전략이다. 플라비바이러스 비구조적(NS) 단백질은 폐막성 망막(ER) 멤브레인상에서 공동 적으로 조립하여 복제 복합체(RC)6을형성하는 것으로 생각된다. NS3와 NS5는 RC의 가장 연구된 효소이며 바이러스 성 게놈 복제에 중요한 역할로 인해 약물 개발을위한 주요 목표를 구성합니다. NS3 프로테아제 도메인은 NS2B를 공동 인자로 요구하며, 미성숙 한 바이러스 성 폴리 단백질을 성숙한 NS 단백질로 절단하는 반면 NS5 RdRp 도메인은 RNA 복제6을담당합니다.

Replicons는 바이러스 구조 유전자가 기자 유전자로 대체되는 포유류 세포에서 발현된 자기 복제 형유증 시스템입니다. 바이러스 RNA 복제에 대한 화합물의 억제 효과는 기자 단백질 활성 7의 감소를 측정하여 쉽게 평가할 수있다. 본명, 당사는 ZIKV 복제의 스크리닝 억제제에 사용되는 프로토콜을 96웰 플레이트 형식으로 설명한다. 레플리콘 계의 아세약은 우리가 최근에 개발한 BHK-21 ZIKV Rluc 레플리콘 세포주(8)를 사용하여 수행되었다. 확인된 화합물의 특정 표적을 특성화하기 위해, 당사는 형광 펩타이드 기판을 사용하여 재조합발현 NS3 프로테아제에 대한 체외 형광계 작용제를 확립하고, Bz-nKRR-AMC, 반면 NS5 RdRp우리는 합성 바이오티니드 셀프 프라이밍 템플릿 3′UTR-U30 (5'-biotin-U30-ACUGGAGAUCGAUCUCUAGU-3')의 연신을 측정, 교재 염료 SYBR 그린 I를 사용하여.

ZIKV 프로테아제(45-96 잔류물 NS2B 의 잔류물 1-177NS3 프로테아제 도메인의 글리신 리치 링커[G4SG4])는YFV9에설명된 바와 같이, 100개의 RRp도메인의 폴리머라제(276-898)를 발현하였다. 두 효소 서열은 GenBank ALU33341.1에서 파생되었습니다. 1차 항바이러스 스크리닝으로서, 화합물은 10μM에서 시험되고 그 중 80%≥ 활동을 보여주는 사람들은 투여량 의존식으로 평가되어 효과적이거나 억제(EC50 또는 IC50)및 세포독성(CC50)농도가 발생한다. 대표적인 결과의 맥락에서, EC50 및 CC50 값NITD008, 알려진 플라비바이러스억제제(11)가레플리턴 기반 스크리닝으로부터 나타난다. 효소 적 흡사에 대해, 항균, 항진균 및 항바이러스 활성을 가진 400개의 분자로 구성된 라이브러리인 MMV/DNDi 전염병 반응 상자로부터 2개의 화합물의 IC50 값이 표시됩니다. 이 작업에 설명된 프로토콜은 다른 관련 플라비바이러스의 억제제를 검사하도록 수정될 수 있다.

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Protocol

1. 루시파라제 활동 분석

참고: 세포 배양과 관련된 모든 절차가 인증된 생체 안전 후드에서 수행되는지 확인합니다(재료 표참조).

  1. 10% FBS와 500 μg/mL G418로 보충된 덜벡코의 수정독수리 매체(DMEM)로 구성된 성장 매체를 준비한다.
  2. 100% DMSO에서 테스트된 화합물의 10mM 스톡 솔루션을 준비한 다음 100% DMSO로 1mM로 희석합니다.
  3. 문화권 ZIKV Rluc 레플리콘 세포는 70-90%의 합류에 도달할 때까지 CO 2-가습된 인큐베이터(재료표 참조)에서 37°C에서 75cm2 배양 플라스크에서 성장 배지에서 세포로 분리된다.
  4. 매체를 폐기합니다. 5 mL의 트립신-EDTA를 플라스크에 5~10분 간 추가한 다음 세포를 125 x g에서 5분 동안 원심분리합니다.
  5. 상체를 버리고, DMEM 10% FBS의 5mL에서 세포를 재일시 중단하고 혈류계에서 재중단 된 세포의 10 μL을 계산합니다.
  6. 세포를 DMEM 10% FBS에서 2 x 104 세포/웰로 조정하고 96웰 세포 배양 판에서 잘 셀 100 μL을 시드합니다(재료표 참조).
  7. CO 2-가습 된 인큐베이터에서 37°C에서 16 시간 동안 플레이트를 배양하십시오 (재료 표참조).
  8. 다음으로, 멀티 채널 마이크로 파이프로 매체를 버리고 접시에 DMEM 2 % FBS의 100 μL / 웰을 추가합니다.
  9. 잘 화합물의 1 μL을 추가하여 분석 매체에서 10 μM 1 % DMSO의 최종 농도를 초래합니다. 첫 번째 컬럼에서, 양수 대조군으로서 마지막 열에 억제 제어 및 NITD008로서 1% DMSO만 추가한다(100% 억제).
  10. CO 2-가습 된 인큐베이터에서 37°C에서 48 h의 플레이트를 배양하십시오 (재료 표참조).
  11. 실온에서 레닐라 루시파라제 분석 시스템 키트를 해동하고, 제조업체의 지시에 따라 렌닐라 루시파라제 리시 버퍼 작업 솔루션 1개와 레닐라 루시파라제 시약의 적절한 부피(분석 버퍼 + 기판, 100 μL 당 음)를 준비합니다.
  12. 멀티 채널 마이크로 파이프로 셀에서 상체를 버리고 잘 당 1 x Renilla luciferase 리시스 버퍼의 25 μL을 추가합니다.
  13. 15 분 동안 실온에서 플레이트를 배양 한 다음 다중 채널 마이크로 파이프로 20 μL의 셀 용액을 흰색 불투명 한 96 웰 플레이트 (재료 표참조)로 옮기고 100 μL / 렌닐라 루시파저 분석 분석 시약의 우물을 함유합니다.
  14. 발광계 또는 발광을 읽을 수 있는 장비의 발광 신호를 읽습니다(재료 표참조).
  15. 각 플레이트에 대해 Z-factor 값 12를계산합니다( Z′ = 1 - (샘플 3SD + 제어 3SD)/샘플 평균 - 제어의 평균 SD - 표준 편차. 0.5에서 1.0 사이의 Z 계수는 좋은 품질의 분석 12를의미합니다.
  16. 화합물의 EC50 값을 결정하기 위해, 1.3 에서 1.8 단계에서 설명된 대로 진행한 다음, 세포에 연속적으로 희석된 화합물을 음수(1% DMSO) 및 양성(10 μM에서 NITD008)과 함께 첨가한다. 중복으로 분석을 두 번 수행합니다.
  17. 화합물 농도당 억제 속도의 평균 값을 플롯하고 그래프 분석 소프트웨어를 사용하여 시그로이드 피팅을 수행하고 EC50 값을 얻습니다.

2. 세포 증식 기반 MTT 분석

  1. 항목 1 단계 1.1 ~ 1.8에 설명 된 대로 진행합니다.
  2. 처음에 10 μM에서 화합물을 추가하고 대조군 1% DMSO를 세포에 추가합니다.
  3. 5 mg/mL MTT(3-(4,5-디메틸티아졸-2-yl)-2,5-디페닐 테트라졸륨 브로마이드 용액을 인산염 완충식식염수(PBS - 137m NaCl) 2,7mM KCl, 10mM Na2HPO4,1,8mM KH2PO4;pH 7.4) 및 MTT의 완전한 용해성까지 소용돌이.
  4. MTT 용액을 우물 부피의 10분의 1(10μL/well)으로 셀에 추가합니다.
  5. 3-4h에 대해 CO 2-가습 된 인큐베이터 (재료 표참조)에서 37 °C에서 플레이트를 배양합니다.
  6. 멀티채널 마이크로파이프로 상체를 버리고 각각 의 100 μL(100%)을 각 웰에 추가합니다.
  7. 포르마잔 결정을 위아래로 피펫으로 용해한 다음 분광계에서 570 nm에서 흡광도를 읽습니다(재료 표참조).
  8. 화합물의 CC50 값을 결정하기 위해, 항목 1 단계 1.1 에서 1.8에 설명된 대로 진행한 다음 세포에 직렬로 희석된 화합물을 추가하여 음수(1% DMSO) 제어를 함께 한다. 중복으로 분석을 두 번 수행합니다.
  9. 화합물 농도당 억제 속도의 평균 값을 플롯하고 그래프 분석 소프트웨어를 사용하여 시그로이드 피팅을 수행하고 CC50 값을 얻습니다.

3. NS2B-NS3 프로테아제 활동 분석

  1. 얼음 위에 단백질 알리쿼트를 해동하십시오.
  2. 플레이트 판독기(재료 표참조) 온도를 37°C로 설정합니다.
  3. 80nM(5 μL/웰)으로 희석된 적절한 양의 단백질을 준비한다. 최종 단백질 농도는 4nM입니다.
  4. 얼음에 Bz-nKRR-AMC 기판의 적절한 양을 해동 (300 μM 스톡 용액은 분석 버퍼에 희석, 10 μL / 잘).
  5. 96웰 백색 플레이트(재료표참조)에서 분석 버퍼의 84 μL(20m M Tris pH 8.5, 5% 글리세롤 및 0.01% 트리톤 X-100)을 각 웰에 분배한다.
  6. 양수 제어 반응을 만들기 위해, 마지막 컬럼의 각 우물에 1 μM의 최종 농도를 달성하기 위해 Aprotinin의 1 μL을 분배 (주식 용액 100 μM물에 희석)
  7. 음의 대조반응을 만들기 위해, 첫 번째 컬럼은 DMSO(최종 농도 1%)의 1μL을 분배한다.
  8. 화합물 스크리닝을 수행하기 위해, 양수 및 음극성 대조유를 제외한 10 μM(1mM 재고 농도)의 최종 농도를 달성하기 위해 각 화합물의 1 μL을 분배한다.
  9. 프로테아제용액의 5 μL을 분배합니다.
  10. 플레이트를 4°C에서 30분간 배양합니다.
  11. 반응을 시작하려면 Bz-nKRR-AMC 스톡 용액(최종 농도 30 μM)의 10 μL을 분배합니다.
  12. 발아 파장을 380nm로 설정하고 방출을 460 nm로 설정하고 마이크로 플레이트 판독기에서 1 분마다 30 분 동안 형광을 읽습니다 (재료 표참조). 전체 실험을 37°C에서 수행합니다.
  13. 양수 및 음수 제어 반응에 대한 형광의 평균 값을 계산합니다. 프로테아제 활성의 100%로 설정하여 음극 반응에 대한 형광의 평균 값은 양수 제어의 평균 값을 빼고 각 화합물에 대한 활동 백분율을 계산한다.
  14. 각 플레이트에 대해 1.15 단계에서 설명한 대로 Z-factor 값을 계산합니다.
  15. 80% 이상의 억제율을 보인 화합물에 대한 IC50 결정으로 진행한다.
  16. 화합물의 직렬 희석을 사용하여 3.1-3.13 단계에 설명된 대로 트리클리카테스에서 분석법을 수행한다.
  17. 화합물 농도당 억제 속도의 평균 값을 플롯하고 그래프 분석 소프트웨어를 사용하여 시그로이드 피팅을 수행하고 IC50 값을 얻습니다.

4. NS5 RdRp 연도 분석

참고: 이 분석서에 사용되는 모든 재료는 RNase, DNase 및 파이로게나아제 무료 인증입니다.

  1. 분석 버퍼(50m Tris pH 7.0, 2.5 mM MnCl2,0.01% 트리톤 X-100) 및 200m ATP 스톡 솔루션0.1% 디디힐피로카보네이트(DEPC) 처리수를 모두 준비한다.
  2. 5μM 3′UTR-U 30(5'-비오틴-U 30-ACUGGAGAUCGAUCUAGU-3')의 5μL 알리쿼트(aneala)는 열순환기에서 55°C에서 5분 동안 배양하여 물을 처리하였다.
  3. NS5 RdRp, 200 mM ATP 및 x10.000 SYBR 그린 I의 스톡 솔루션을 얼음 위에 해동하십시오.
  4. 단백질을 분석 완충의 3mL에서 250 nM의 최종 농도로 희석한다.
  5. ATP, 3'UTR-U30 및 SYBR Green I의 스톡 솔루션을 분석 버퍼 3mL에 각각 1mM, 300 nM 및 1X의 최종 농도로 희석하여 기판 솔루션을 준비합니다.
  6. 96웰 PCR 플레이트(재료 표 참조)에서 각 행의1 내지 11열에 희석 단백질 24.5 μL을 추가합니다. 나머지 우물에 동일한 양의 분석 버퍼를 추가합니다.
  7. 제어 및 빈 반응을 위해 열 1과 12에 DMSO0.5 μL을 추가합니다. DMSO에서 희석된 화합물의 0.5 μL을 10 μM 1mM 스톡 용액의 최종 농도에 추가합니다.
  8. 밀봉 필름으로 접시를 밀봉하고 실온에서 15 분 동안 배양하십시오.
  9. 기판 용액의 25 μL을 추가하여 반응을 시작하고 플레이트를 다시 밀봉하십시오.
  10. 실시간 PCR 시스템에서 30°C에서 배양(재료표참조) 및 1시간 동안 형광을 모니터링하여 FAM 필터(방출:494 nm/흥분:521 nm)로 30s마다 형광을 측정한다.
  11. 각 플레이트에 대해 1.15 단계에서 설명한 대로 Z-factor 값을 계산합니다.
  12. 3.15 단계에서 설명한 바와 같이80% 이상의 억제율을 보인 화합물에 대한 IC 50 결정으로 진행한다.
  13. 화합물 농도당 억제 속도의 평균 값을 플롯하고 그래프 분석 소프트웨어를 사용하여 시그로이드 피팅을 수행하고 IC50 값을 얻습니다.

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Representative Results

본 명세서에 기재된 모든 프로토콜은 96웰 플레이트에서 찌르고 플레이트의 첫 번째 및 마지막 열에 배치된 음수 및 양성 제어를 포함하여 단일 농도의 1차 선별판에서 플레이트당 80개의 화합물을 각각 평가할 수 있게 되었다. 레플리콘 계스크리닝은 도 1에서나타내며, 이는 BHK-21-RepZIKV_IRES-neo 세포주(도 1A), 세포 체조 표현(도1B)및 NITD008의 용량 반응 곡선(0.28 μM의 EC50, CC50 > 10 μM)을 획득하기 위해 개발된 RNA 구조를 포함한다. EC50 및 CC50 값의 히트 화합물은 Rluc 활성의 50%를 억제하고 각각 50% 세포 독성을 유발하는 데 필요한 농도로 결정된다. 루시파라제 분석과 관련하여, DMSO 1%는 억제제(0% 억제) 및 NITD008이 이전에설명된바와 같이 양성 대조군(100% 억제)으로 사용된다.

상기 NS2B-NS3 프로테아제 활성은 프로테아제의 프로테올리틱 활성으로 인해 방출된 AMC의 형광 모니터링에 의해 측정된다(도2A). Aprotinin, 트립신 억제제역할을 하고 이미 플라비바이러스 프로테아제13,14,15의억제제로서 기술되고 있는 단백질은 실험양성 대조군(IC50 의 0.13 ± 0.02 μM, 데이터가 도시되지 않음)으로 사용되었다. 도 2B는 프로테아제 활성, 화합물 MMV1634402(IC50 의 0.36 ± 0.08 μM)를 표적으로 하는 분자의 투여 반응 억제 곡선을 나타낸다. NS5 RdRp의 신장 활성은 합성dsRNA(도2C)와상호작용할 때 SYBR 그린 I의 형광 강도의 증가에 의해 실시간으로 측정된다. ZIKV RdRp를 표적으로 하는 적중 분자의 투여 반응 억제 곡선, 화합물 MMV1782220(1.9 ± 0.8 μM의 IC50)은 도 2D로나타났다. NITD008과 같은 뉴클레오시드 아날로그 억제제는 효소 분석에 적합하지 않기 때문에 인산염이분자(16)에세포내로 통합되어야 하기 때문에 NS5 RdRp 신장 분석에 대한 어떠한 양성 조절도 사용하지 않았다. 그러나, 클로파지민, 우리가 최근에 바이러스 성 폴리머라제8의 억제제로 확인된상업적항생제는,다음 분석에서 실험적인 대조군으로 이용될 수 있었습니다.

Figure 1
그림 1: Replicon 기반 검진. A)3'UTR 종자에서 Rluc 서열을 포함하는 ZIKV 레플리콘 분재의 회로도 표현 및 3'UTR 종자에서 네오 유전자, 우리는 BHK-21-RepZIKV-IRES_Neo 세포주 8을얻기 위해 개발했다. B)ZIKV 복제억제제를 선별하기 위해 수행된 루시파라제 활성 분석 및 세포 증식 계 MTT 분석기의 회로도 표현. C)NITD008의 용량 반응 곡선(EC50 및 CC50). 분석은 중복으로 수행되었습니다. 오류 막대는 표준 편차를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 2
그림 2: 바이러스 효소 기반 분석. A)NS2B-NS3 프로테아제 활성 분석의 회로도 표현. B)화합물 MMV1634402의 용량 반응 억제 곡선(IC50). C)NS5 RdRp RNA 중합효소 활성 분석의 회로도 표현. D)화합물 MMV1782220의 용량 반응 억제 곡선(IC50). 이 에세이는 삼중기로 수행되었다. 오류 막대는 표준 편차를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

본 명세서에 기재된 프로토콜은 384 또는 1536웰 형식으로 스크리닝에 쉽게 적응할 수 있다. HTS 형식으로 수행된 생화학 및/또는 세포 기반 스크리닝의 경우, 통계파라미터인 Z'인자 값은 각 판에 대해 계산되어 이러한분석(12)의민감도, 재현성 및 정확성을 보장한다. 0.5 이상의 Z의 계수 값은 레플리턴 기반 스크리닝에 예상되며 NS3 및 NS5 활동 에세이의 값은 0.7 이상이 될 것으로 예상됩니다. 레플리콘 계 HTS의 경우, 5'UTR 영역에서 레닐라 루시파라아제(Rluc) 서열과 내부 리보소 입구 부위(IRES)에 의해 구동되는 신미신 인트랜스포라아제(Neo) 유전자를 포함하는 복제형 ZIKV 레플리콘을 수용하는 안정적인 세포주인 BHK-21-RepZIKV_IRES-Neo 세포를 개발했습니다. 우리는 RNA 번역의 정확한 개시에 필요한 캡슐38잔류와 30개의 잔류물을 보유하여 세포 통로 사이의 유사한 복제 수준 및 약물 민감도를유지한다. 구조적인 유전자의 부족으로 인해, 레플리톤은 자손 의 비운을 생성하지 않으므로 실험실에서 습득한 바이러스감염(17)의위험을 제거한다.

ZIKV 레플리콘 세포를 이용한 항바이러스 작용제는 루시파제 활성 및 세포 증식 기반 MTT(세포독성) 유사하게 수행된 세포 증식 기반 MTT(cytotoxicity) 작용으로 구성된다. 이는 리포터 단백질 발현 및/또는 활성을 직접적으로 방해하는 분자및 세포 건강에 악영향을 미치는 분자를 포함하는 거짓 양성 안타를 배제하는 데 필요하다7. Replicon 시스템은 RNA 복제를 억제하지만 바이러스 성 입력 및 virion 조립 / 방출에 필요한 분자의 발견을 허용합니다. 대안적으로, 트랜스 17에서구조 단백질을 제공함으로써 바이러스 레플리시온 입자(VRP)를 생성하도록 충류를 포장할 수 있다. 결과 1라운드 전염입자(SRIP)는 전염성이 있지만, 자손 바이러스는 패키지 게놈이 구조적 유전자가 부족하기 때문에 전파할 수 없다. 따라서, VRP는 리포터 단백질7의수준을 측정하여 바이러스 성 항목/복제억제제에 대해 테스트하는 데 사용될 수 있다.

또한, 리플리턴 기반 스크리닝 외에도, 재조합 NS3 프로테아제 및 NS5 RdRp에 대한 바이러스 효소 기반 분석서에 사용되는 프로토콜을 상세히 설명했습니다. 바이러스 성 프로테아제의 프로테오리틱 활성은 형광 태그 7-amine-4-메틸루마린(AMC)과 결합된 ZIKV 프로테아제 인식 및 분열 서열을 포함하는 형광 펩타이드 기판 Bz-nKRR-AMC를 사용하여 측정하였다. 프로테아제 활성으로 인해 형광 태그가 방출되고 반응 속도는 분광광계18,19에서형광을 모니터링하여 직접 측정된다. 이 분석법은 매우 합리적인, 상대적으로 저렴, 빠르고 큰 화합물 라이브러리의 스크리닝에 적합20,21. 주요 단점은 테스트 된 화합물과 거짓 양성 안타로 이어질 수있는 형광호 사이의 가능한 담금질입니다. 그러나 이 문제는 AMC가 있는 경우 추가형광 측정에 의해 해결될 수 있다. 또한, 플루오로포어의 동일한 파장에서 방출 또는 흡수를 나타내는 화합물은 본방법(18,20)에의해 평가될 수 없다.

NS5 RdRp에 관해서는, 그 신장 활성은 자가 프라이밍 3'UTR-U30 템플릿의 연신 동안 SYBR 녹색 I의 형광 신호의 증가에 의해 직접 검출된다. 이 프로토콜은 피코 그린 및 SYTO 9와 같은 상호 연관된 염료와 분석하여 다양한 바이러스 성 중합체 에 대한 화합물을 평가하는 데 널리 사용되어왔다 22,23,24,25,26. 우리는 분석에서 자기 프라이밍 생물요닉 템플릿(27)을 사용했지만, poliU와 같은 다른 템플릿은25뿐만아니라 사용할 수 있습니다. 이 방법의 주요 단점은 형광을 방해하거나 dsRNAintercalation(28)을감소시킴으로써 염료와 상호 작용하는 높은 수의 거짓 양성 안타이다. 따라서, 적중 화합물은 생물물리학 방법과 같은 반소로 검증되거나,화합물(29)의dsRNA에서 그린 I 형광™ 을 비교함으로써 검증될 필요가 있다. 그럼에도 불구하고, 간편한 구현, 직접 측정 및 경제성은27,30,31에서구현하기 어려운 무선 라벨 또는 결합된 저술과 비교하여 HTS 플랫폼으로서 형광 기반 방법의 사용에 핵심포인트이다.

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Disclosures

저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.

Acknowledgments

이 작품은 Fundação 드 Amparo à Pesquisa do Estado de 상파울루 (FAPESP), CEPID 교부금 2013/07600-3GO에 의해 지원되었다, RSF에 2018/05130-3 및 2016/19712-9 ASG에, 그리고 Coordenação 드 아페르페이소아멘토 드 페소알 드 니벨 슈페리어 (보조금 88887.516153/2020-00) ASG에 부여. 우리는 감사하게 말라리아 벤처에 대한 의학 (MMV, www.mmv.org) 및 방치 질환 이니셔티브 (DNDi, www.dndi.org)에 대한 그들의 지원, 전염병 응답 상자의 설계 및 화합물을 공급에 감사드립니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
5'-biotin-U30- ACUGGAGAUCGAUCUCCAGU -3' Dharmacon - 100 ng
96-well cell culture plates KASVI K12-096
96-well PCR Microplate KASVI K4-9610
96-well White Flat Bottom Polystyrene High Bind Microplate Corning 3922
AMC (7-amine-4-methylcoumarin) SIGMA-Aldrich 257370 100 mg
Aprotinin from bovine lung SIGMA-Aldrich A1153 10 mg
ATP JenaBioscience NU-1010-1G 1 g
Bz-nKRR-AMC International Peptides - 5 mg
Class II Biohazard Safety Cabinet ESCO
Diethyl pyrocarbonate SIGMA-Aldrich D5758 25 mL
DMSO (Dimethyl sulfoxide) SIGMA-Aldrich 472301 1 L
Dulbecco’s Modified Eagle Medium GIBCO 3760091
Fetal Bovine Serum GIBCO 12657-029 500 mL
G418 SIGMA-Aldrich A1720 Disulfate salt
Glycerol SIGMA-Aldrich G5516 1 L
HERACELL VIOS 160i CO2 incubator Thermo Scientific
MnCl2 tetrahydrate SIGMA-Aldrich 203734 25 g
MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide) Invitrogen M6494
NITD008 ≥98% (HPLC) Sigma-Aldrich SML2409 5 mg
qPCR system Mx3000P Agilent
Renilla luciferase Assay System PROMEGA E2810
SpectraMax Gemini EM Fluorescence Reader Molecular Devices
SpectraMax i3 Multi-Mode Detection Platform Molecular Devices
SpectraMax Plus 384 Absorbance Microplate Reader Molecular Devices
SYBR Green I Invitrogen S7563 500 µl
Triton X-100 SIGMA-Aldrich X100 500 mL
Trizma base SIGMA-Aldrich T1503 1 kg
Trypsin-EDTA Solution 1X SIGMA-Aldrich 59417-C 100 mL

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면역학 및 감염 문제 176
지카 바이러스 복제억제제에 대한 화면에 높은 처리량 항 바이러스 적 소사
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