Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Высокопроизводительный противовирусный анализ для скрининга ингибиторов репликации вируса Зика

Published: October 30, 2021 doi: 10.3791/62422
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1São Carlos Institute of Physics, University of Sao Paulo

Summary

В этой работе мы описываем протоколы, используемые в анализах на основе репликона и вирусных ферментов для скрининга ингибиторов репликации вируса Зика в высокопроизводительном формате скрининга.

Abstract

Открытие противовирусных препаратов требует разработки надежных биохимических и клеточных анализов, которые могут быть выполнены в форматах высокопроизводительного скрининга (HTS). Считается, что флавивирусные неструктурные (NS) белки совместно-трансляционно собираются на мембранах эндоплазматического ретикулума (ER), образуя компликационный комплекс (RC). NS3 и NS5 являются наиболее изученными ферментами RC и являются основными мишенями для разработки лекарств из-за их решающей роли в репликации вирусного генома. Домен протеазы NS3, который требует NS2B в качестве кофактора, отвечает за расщепление незрелого вирусного полипротеина на зрелые белки NS, тогда как домен NS5 RdRp отвечает за репликацию РНК. Здесь мы подробно описываем протоколы, используемые в скринингах на основе репликонов и ферментативных анализах для тестирования больших библиотек соединений на ингибиторы репликации вируса Зика (ZIKV). Репликоны представляют собой самовоспроизводящиеся субгеномные системы, экспрессируемые в клетках млекопитающих, в которых вирусные структурные гены заменяются репортерным геном. Ингибирующее воздействие соединений на репликацию вирусной РНК можно легко оценить, измерив снижение активности репортерного белка. Скрининги на основе репликона проводились с использованием клеточной линии репликона BHK-21 ZIKV, экспрессирующей люциферазу Renilla в качестве гена-репортера. Чтобы охарактеризовать конкретные мишени идентифицированных соединений, мы установили анализы на основе флуоресценции in vitro для рекомбинантно экспрессированной протеазы NS3 и NS5 RdRp. Протеолитическую активность вирусной протеазы измеряли с помощью фторогенного пептидного субстрата Bz-nKRR-AMC, в то время как активность элонгации NS5 RdRp непосредственно обнаруживалась увеличением флуоресцентного сигнала SYBR Green I при удлинении РНК с использованием синтетического биотинилированного самовсасывающего шаблона 3′UTR-U30 (5'-биотин-U30-ACUGGAGAUCGAUCCAGU-3').

Introduction

Вирус Зика (ZIKV) является новым членом переносимого членистоногогого вируса рода Flavivirus,который включает в себя тесно связанный вирус денге (DENV), вирус японского энцефалита (JEV) и вирус желтой лихорадки (YFV), которые представляют постоянную угрозу для общественного здравоохранения1. Вспышка ZIKV в 2015-16 годах в Северной и Южной Америке привлекла глобальное внимание после ее появления в Бразилии из-за связи с тяжелыми неврологическими расстройствами, такими как врожденная микроцефалия, связанная с ZIKV, у новорожденных2,3 и синдром Гийена-Барре у взрослых4. Хотя число случаев заражения снизилось в течение следующих двух лет, автохтонные передачи ZIKV, переносимые комарами, были проверены в 87 странах и территориях в 2019 году, что свидетельствует о потенциале вируса вновь появиться в качестве эпидемии5. На сегодняшний день не существует одобренных вакцин или эффективных препаратов против инфекции ZIKV.

Открытие противовирусных препаратов требует разработки надежных клеточных и биохимических анализов, которые могут быть выполнены в форматах высокопроизводительного скрининга (HTS). Скрининги на основе Replicon и анализы на основе вирусных ферментов являются двумя ценными стратегиями тестирования маломолекулярных соединений на ингибиторы ZIKV1. Считается, что флавивирусные неструктурные (NS) белки совместно-трансляционно собираются на мембранах эндоплазматического ретикулума (ER), образуя комплекс репликации (RC)6. NS3 и NS5 являются наиболее изученными ферментами RC и являются основными мишенями для разработки лекарств из-за их решающей роли в репликации вирусного генома. Протеазный домен NS3, который требует NS2B в качестве кофактора, отвечает за расщепление незрелого вирусного полипротеина на зрелые белки NS, тогда как домен NS5 RdRp отвечает за репликацию РНК6.

Репликоны представляют собой самовоспроизводящиеся субгеномные системы, экспрессируемые в клетках млекопитающих, в которых вирусные структурные гены заменяются репортерным геном. Ингибирующее действие соединений на репликацию вирусной РНК можно легко оценить, измерив снижение активности репортерного белка7. Здесь описываются протоколы, используемые для скрининга ингибиторов репликации ZIKV в формате пластины 96 скважин. Анализы на основе репликона были выполнены с использованием клеточной линии BHK-21 ZIKV Rluc, которую мы недавно разработали8. Для характеристики конкретных мишеней идентифицированных соединений мы установили анализы на основе флуоресценции in vitro для рекомбинантно экспрессированной протеазы NS3 с использованием фторогенного пептидного субстрата Bz-nKRR-AMC, тогда как для NS5 RdRp мы измерили удлинение синтетического биотинилированного самовсасывающего шаблона 3′UTR-U30 (5'-biotin-U30-ACUGGAGAUCGAUCCAGU-3'), используя интеркаляционный краситель SYBR Green I.

Протеазу ZIKV (45-96 остатков кофактора NS2B, связанного с остатками 1-177 протеазного домена NS3 богатым глицином линкером[G4SG4]),как описано для YFV9,в то время как полимеразу (276-898 остатков домена RdRp) клонировали и экспрессировали, как описано в10. Обе последовательности ферментов были получены из GenBank ALU33341.1. В качестве первичных противовирусных скринингов соединения тестируют при 10 мкМ, а те, которые показывают активность ≥ 80%, затем оценивают дозозависимым образом, что приводит к эффективному/ингибированию (EC50 или IC50)и цитотоксическим (CC50)концентрациям. В контексте репрезентативных результатов показаны значения EC50 и CC50 NITD008, известного ингибитора флавивирусов11,из скринингов на основе репликона. Для ферментативных анализов показаны значения IC50 двух соединений из MMV/DNDi Pandemic Response Box, библиотеки, состоящей из 400 молекул с антибактериальной, противогрибковой и противовирусной активностью. Протоколы, описанные в этой работе, могут быть модифицированы для скрининга ингибиторов других родственных флавивирусов.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Анализ активности люциферазы

ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что все процедуры, связанные с культивируемостью клеток, проводятся в сертифицированных вытяжках биобезопасности (см. Таблицу материалов).

  1. Подготовьте питательные среды, состоящие из модифицированной среды Dulbecco Eagle's Medium (DMEM), дополненной 10% FBS и 500 мкг/мл G418.
  2. Готовят 10 мМ запасного раствора искомых соединений в 100% ДМСО, а затем разводят их до 1 мМ в 100% ДМСО.
  3. Культивированы клетки ZIKV Rluc replicon в среде роста в культуральная колба 75см2 при 37 °C в CO2-увлажненный инкубатор (см. Таблицу материалов)до тех пор, пока они не достигнут 70-90% притока.
  4. Выбросьте среду. Добавьте 5 мл трипсина-ЭДТА в колбу в течение 5-10 мин, а затем центрифугируют клетки при 125 х г в течение 5 мин.
  5. Отбросьте супернатант, повторно суспендьте клетки в 5 мл DMEM 10% FBS и подсчитайте 10 мкл повторно суспендированных клеток на гемоцитометре.
  6. Отрегулируйте ячейки до 2 х 104 клеток/скважина в DMEM 10% FBS и засейте 100 мкл клеток на скважину в 96-скважинной клеточной культурной пластине (см. Таблицу материалов).
  7. Инкубируют пластину в течение 16 ч при37 °C в CO2-увлажненный инкубатор (см. Таблицу материалов).
  8. Затем отбросьте среду с помощью многоканальной микропипетки и добавьте на пластину 100 мкл/целую DMEM 2% FBS.
  9. Добавляют 1 мкл соединений на скважину, чтобы получить конечную концентрацию 10 мкМ 1% ДМСО в пробирной среде. В первом столбце добавьте только 1% DMSO в качестве контроля без ингибирования и NITD008 в последнем столбце в качестве положительного контроля (100% ингибирование).
  10. Инкубируют пластину в течение 48 ч при37 °C в CO2-увлажненный инкубатор (см. Таблицу материалов).
  11. Разморозьте комплект Renilla luciferase Assay System при комнатной температуре, приготовьте 1x ренилла люциферазы Лизис Буферный раствор и соответствующий объем реагента Renilla Luciferase (Буфер анализа + субстрат; 100 мкл на скважину), согласно инструкциям производителя.
  12. Выбросьте супернатант из клеток с помощью многоканальной микропипетки и добавьте 25 мкл 1x буфера лизиса Renilla luciferase на лунку.
  13. Инкубируют пластину при комнатной температуре в течение 15 мин, а затем переносят 20 мкл клеточных лизатов многоканальной микропипеткой на белую непрозрачную 96-скважинную пластину (см. Таблицу материалов),содержащую 100 мкл/скважину реагента Renilla luciferase Assay.
  14. Считывание люминесцентных сигналов в люминометре или в любом оборудовании, которое имеет возможность считывать люминесценцию (см. Таблицу материалов).
  15. Для каждой пластины вычислите значение Z-фактора 12, следующим образом: Z′ = 1 - ((3SD образца + 3SD контроля)/│Среднее пробы - Среднее контрольного│); SD - стандартное отклонение. Z-фактор между 0,5 и 1,0 означает анализ хорошего качества 12.
  16. Чтобы определить значения EC50 соединений, действуйте так, как описано на этапах 1.3-1.8, а затем добавляйте соединения, последовательно разбавленные в клетки, вместе с отрицательными (1% DMSO) и положительными (NITD008 при 10 мкМ) контрольными элементами. Выполните анализ дважды в дубликатах.
  17. Постройте график средних значений скорости ингибирования на концентрацию соединения и используйте программное обеспечение для анализа графов для выполнения сигмоидальной подгонки и получения значений EC50.

2. Анализ МТТ на основе пролиферации клеток

  1. Действуйте в том виде, в чем описано в пункте 1 этапы 1.1-1.8.
  2. Добавляют соединения первоначально при 10 мкМ и контрольный 1% ДМСО к клеткам.
  3. Готовят 5 мг/мл раствора МТТ (3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолия бромида) в фосфатном буферном физиологическом растворе (ПБС - 137 мМ NaCl, 2,7 мМ ККл, 10 мМ Na2HPO4,1,8 мМ KH2PO4;рН 7,4) и вихре до полной солюбилизации МТТ.
  4. Добавьте раствор МТТ в ячейки на одной десятой объема скважины (10 мкл/скважина).
  5. Инкубируют пластину при 37 °C в увлажненныйco2инкубатор (см. Таблицу материалов)в течение 3-4 ч.
  6. Выбросьте супернатант с помощью многоканальной микропипетки и добавьте 100 мкл DMSO (100%) в каждую лунку.
  7. Солюбилизируйте кристаллы формазана путем пипетирования вверх и вниз, а затем считывайте поглощение при 570 нм в спектрофотометре (см. Таблицу материалов).
  8. Чтобы определить значения CC50 соединений, действуйте так, как описано в пункте 1 этапов 1.1 - 1.8, а затем добавляют соединения, последовательно разбавленные в клетки, вместе отрицательный (1% DMSO) контроль. Выполните анализ дважды в дубликатах.
  9. Постройте график средних значений скорости ингибирования на концентрацию соединения и используйте программное обеспечение для анализа графов для выполнения сигмоидальной подгонки и получения значений CC50.

3. Анализ активности протеазы NS2B-NS3

  1. Разморозить белковую аликвоту на льду.
  2. Установите температуру считывателя пластин (см. Таблицу материалов)на 37°C.
  3. Приготовьте соответствующее количество белка, разбавленный до 80 нМ (5 мкл/хорошо). Конечная концентрация белка составляет 4 нМ.
  4. Разморозить соответствующее количество субстрата Bz-nKRR-AMC на льду (300 мкМ раствора, разбавленного в буфере анализа, 10 мкл/скважина).
  5. В 96-скважинную белую пластину (см. Таблицу материалов)дозируют 84 мкл буфера анализа (20 мМ Tris pH 8,5, 5% глицерина и 0,01% Тритона X-100) в каждую скважину.
  6. Чтобы произвести положительную контрольную реакцию, в каждую скважину последней колонны дозируют 1 мкл апротинина для достижения конечной концентрации 1 мкМ (запасной раствор 100 мкМ разбавляют водой)
  7. Чтобы сделать отрицательную контрольную реакцию, на первую колонку дозируют 1 мкл ДМСО (конечная концентрация 1%).
  8. Для проведения скрининга соединения дозируют по 1 мкл каждого соединения для достижения конечной концентрации 10 мкМ (концентрация запаса 1 мМ), исключая положительные и отрицательные контрольные скважины.
  9. Дозировать 5 мкл раствора протеазы.
  10. Инкубировать пластину при 4 °C в течение 30 минут.
  11. Для начала реакции дозируют 10 мкл раствора Bz-nKRR-AMC (конечная концентрация 30 мкМ).
  12. Установите длину волны возбуждения на 380 нм, а излучение на 460 нм и считывайте флуоресценцию в течение 30 мин каждые 1 мин в микропластинчатом считывателе (см. Таблицу материалов). Выполните весь эксперимент при 37 °C.
  13. Рассчитайте средние значения флуоресценции для положительных и отрицательных контрольных реакций. Установить как 100% активности протеазы среднее значение флуоресценции для отрицательных контрольных реакций вычитают из среднего значения положительного контроля и вычисляют процентное значение активности для каждого соединения.
  14. Для каждой пластины вычислите значение Z-фактора, как описано на шаге 1.15.
  15. Продолжайте определение IC50 для соединений, которые показали скорость ингибирования выше 80%.
  16. Выполняют анализ в трех количествах, как описано в шагах 3.1-3.13, используя последовательное разбавление соединения.
  17. Построить график средних значений скорости ингибирования на концентрацию соединения и использовать программное обеспечение для анализа графов для выполнения сигмоидальной подгонки и получения значений IC50.

4. Удлинивание NS5 RdRp

ПРИМЕЧАНИЕ: Все материалы, используемые в этом анализе, сертифицированы без РНКазы, ДНКазы и пирогеназы.

  1. Подготовьте как буфер анализа (50 мМ Tris pH 7,0, 2,5 мМ MnCl2,0,01% Triton X-100), так и 200 мМ раствора АТФ с 0,1% очищенной диэтилпирокарбонатной (DEPC) водой.
  2. Отжиг 5 мкл аликвоты 200 мкМ 3′UTR-U30 (5'-биотин-U 30-ACUGGAGAUCGAUCCAGU-3') в воде, обработанной ПЦР, путем инкубации ее в течение 5 минут при 55 °C в термоциклере.
  3. Разморозить на льду стоковый раствор NS5 RdRp, 200 мМ АТФ и x10.000 SYBR Green I.
  4. Разбавляют белок до конечной концентрации 250 нМ в 3 мл буфера анализа.
  5. Готовят субстратный раствор путем разбавления запасных растворов АТФ, 3'UTR-U30 и SYBR Green I в 3 мл пробирного буфера до конечной концентрации 1 мМ, 300 нМ и 1Х соответственно.
  6. В 96-скважинную ПЦР-пластину (см. Таблицу материалов)добавляют 24,5 мкл разбавленного белка в колонки с 1 по 11 каждого ряда. Добавьте такой же объем пробирного буфера в оставшиеся скважины.
  7. Для контроля и пустой реакции добавьте 0,5 мкл ДМСО в колонки 1 и 12. Добавьте 0,5 мкл соединения, разведенного в ДМСО, к конечной концентрации 10 мкМ 1мМ раствора запаса).
  8. Запечатайте пластину герметизной пленкой и высиживание при комнатной температуре в течение 15 минут.
  9. Начните реакцию, добавив 25 мкл раствора подложки и снова запечатайте пластину.
  10. Инкубируйте при 30 °C в системе ПЦР реального времени (см. Таблицу материалов)и контролируйте флуоресценцию в течение 1 часа, измеряя флуоресценцию каждые 30 с с помощью фильтра FAM (излучение: 494 нм / возбуждение: 521 нм).
  11. Для каждой пластины вычислите значение Z-фактора, как описано на шаге 1.15.
  12. Продолжайте определение IC50 для соединений, которые показали скорость ингибирования выше 80%, как описано на этапе 3.15.
  13. Построить график средних значений скорости ингибирования на концентрацию соединения и использовать программное обеспечение для анализа графов для выполнения сигмоидальной подгонки и получения значений IC50.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Все протоколы, описанные в настоящем описании, были установлены в 96-скважинных пластинах и позволяют оценить 80 соединений на пластину при первичном скрининге одной концентрации, включая отрицательный и положительный контрольные элементы, размещенные в первой и последней колонке пластин соответственно. Скрининги на основе репликона представлены на рисунке 1,который включает в себя конструкцию РНК, разработанную для получения клеточной линии BHK-21-RepZIKV_IRES-Neo(рисунок 1A),схематическое представление анализов(рисунок 1B)и кривые дозы-ответа NITD008 (EC50 0,28 мкМ, CC50 > 10 мкМ)(рисунок 1C). Значения EC50 и CC50 пораженных соединений определяются как концентрации, необходимые для ингибирования 50% активности Rluc и возникновения 50% цитотоксичности, соответственно. Что касается анализа люциферазы, DMSO 1% используется в качестве контроля без ингибитора (0% ингибирования), а NITD008 используется в качестве положительного контроля (100% ингибирование), как описаноранее 8.

Активность протеазы NS2B-NS3 измеряется путем флуоресцентного мониторинга АМС, высвобождаемого в результате протеолитической активности протеазы(рисунок 2А). Апротинин, белок, который действует как ингибитор трипсина и уже описан как ингибитор флавивирусных протеаз13,14,15,использовался в этом анализе в качестве экспериментального положительного контроля (IC50 0,13 ± 0,02 мкМ, данные не показаны). Фиг.2В иллюстрирует кривую ингибирования «доза-реакция» молекулы, нацеленной на активность протеазы, соединения MMV1634402 (IC50 0,36 ± 0,08 мкМ). Активность удлинения NS5 RdRp измеряется в реальном времени увеличением интенсивности флуоресценции SYBR Green I при интеркалировании с синтезированной дцРНК(рисунок 2C). Кривая ингибирования «доза-реакция» молекулы удара, нацеленной на ZIKV RdRp, соединение MMV1782220 (IC50 1,9 ± 0,8 мкМ), показана на рисунке 2D. Поскольку нуклеозидные аналоговые ингибиторы, такие как NITD008, не подходят для ферментативных анализов, так как фосфаты должны быть включены внутриклеточным образом в молекулу16,мы не использовали какой-либо положительный контроль для анализа элонгации NS5 RdRp. Тем не менее, Клофазимин, коммерческий антибиотик, который мы недавно идентифицировали как ингибитор вирусной полимеразы8,может быть использован в качестве экспериментального контроля в следующих анализах.

Figure 1
Рисунок 1:Скрининги на основе Replicon. A)Схематическое представление конструкции репликона ZIKV, содержащей последовательность Rluc на 5' UTR конце и ген Neo на 3' UTR конце, которую мы разработали для получения BHK-21-RepZIKV-IRES_Neo клеточной линии 8. B)Схематическое представление анализа активности люциферазы и анализа МТТ на основе клеточной пролиферации, выполненного для скрининга ингибиторов репликации ZIKV. C)Кривые "доза-реакция" (EC50 и CC50)NITD008. Анализ проводился в двух экземплярах. Полосы погрешности представляют стандартные отклонения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2:Анализы на основе вирусных ферментов. А) Схематическое представление анализа активности протеазы NS2B-NS3. B) Кривая ингибирования "доза-реакция" (IC50)соединения MMV1634402. C)Схематическое представление анализа активности NS5 RdRp РНК-полимеразы. D) Кривая ингибирования "доза-реакция" (IC50)соединения MMV1782220. Анализы проводились в трех разах. Полосы погрешности представляют стандартные отклонения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Протоколы, описанные в настоящем описании, могут быть легко адаптированы для скрининга в форматах 384 или 1536 скважин. Для биохимических и/или клеточных скринингов, выполняемых в формате HTS, значение Z' factor, статистический параметр, рассчитывается для каждой пластины для обеспечения чувствительности, воспроизводимости и точности этих анализов12. Значение Z' коэффициента 0,5 или выше ожидается для скринингов на основе репликона, в то время как значение 0,7 или выше ожидается для анализов активности NS3 и NS5. Для HTS на основе репликона мы разработали клетки BHK-21-RepZIKV_IRES-Neo, стабильную клеточную линию, содержащую репликтивный репликон ZIKV, содержащий последовательность Люциферазы Renilla (Rluc)в области 5' UTR и ген неомицинфосфотрансферазы (Neo), управляемый внутренним сайтом рибосомального входа (IRES) в 3'UTR. Мы сохранили 38 остатков капсида и 30 остатков генов обволакивающих веществ, которые необходимы для правильного начала трансляции РНК, для поддержания сопоставимых уровней репликации и чувствительности к лекарственным средствам между клеточными проходами8. Из-за отсутствия структурных генов репликоны не продуцируют вирионы потомства, тем самым исключая риск лабораторно-приобретенной вирусной инфекции17.

Противовирусные анализы с использованием репликонных клеток ZIKV состоят из активности люциферазы и анализов МТТ (цитотоксичности) на основе пролиферации клеток, выполняемых параллельно. Это необходимо для исключения ложноположительных попаданий, включающих молекулы, которые непосредственно мешают экспрессии и/или активности белка репортера, и те, которые отрицательно влияют на здоровье клеток7. Системы Replicon позволяют обнаружить молекулы, которые ингибируют репликацию РНК, но не те, которые необходимы для проникновения вируса и сборки / высвобождения вирионов. Альтернативно, репликоны могут быть упакованы для получения вирусных репликонных частиц (VRM) путем предоставления структурных белков в транс17. Полученные однокруглые инфекционные частицы (SRIP) являются инфекционными, но вирус потомство не может размножаться, поскольку в геноме пакета отсутствуют структурные гены. Таким образом, VP могут быть использованы для тестирования ингибиторов проникновения /репликации вируса путем измерения уровней репортерного белка7.

В дополнение к скринингам на основе репликона, мы также подробно описали здесь протоколы, используемые в анализах на основе вирусных ферментов для рекомбинантной протеазы NS3 и NS5 RdRp. Протеолитическую активность вирусной протеазы измеряли с помощью фторогенного пептидного субстрата Bz-nKRR-AMC, который содержит последовательность распознавания и расщепления протеазы ZIKV в сочетании с флуоресцентной меткой 7-амина-4-метилкумарина (AMC). Благодаря активности протеазы флуоресцентная метка высвобождается и скорость реакции непосредственно измеряется путем мониторинга флуоресценции в спектрофотометре18,19. Этот анализ очень разумный, относительно дешевый, быстрый и подходит для скрининга больших библиотек соединений20,21. Основным недостатком является возможное закалка между испытуемыми соединениями и флуорофором, что может привести к ложноположительным ударам. Однако эта проблема может быть решена путем дополнительного измерения флуоресценции в присутствии AMC. Кроме того, соединения, показывающие излучение или поглощение в одной длине волны флуорофора, не могут быть оценены этим методом18,20.

Что касается NS5 RdRp, то его активность удлинения непосредственно определяется увеличением флуоресцентного сигнала SYBR Green I при удлинении самовсасывающего шаблона 3'UTR-U30. Протокол был адаптирован из анализов с интеркалирующими красителями, такими как Pico Green и SYTO 9, которые широко использовались для оценки соединений для различных вирусных полимераз22,23,24,25,26. Несмотря на то, что мы использовали самовсасывающий биотинилированный шаблон27 в анализе, другие шаблоны, такие как poliU, также могут быть использованы25. Основным недостатком этого метода является большое количество ложноположительных попаданий, которые взаимодействуют с красителем, либо путем вмешательства в флуоресценцию, либо путем уменьшения интеркаляции дцРНК28. Поэтому пораженные соединения должны быть проверены с помощью контр-анализов, таких как методы биофизики, или путем сравнения флуоресценции SYBR™ Green I в дцРНК с соединением29и без него. Тем не менее, простота внедрения, прямое измерение и доступность являются ключевыми моментами для использования флуоресцентных методов в качестве платформ HTS по сравнению с радиомаркированных или связанными анализами, которые трудно реализовать в среднемасштабных / крупномасштабных кампаниях27,30,31.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Acknowledgments

Эта работа была поддержана Фондом Ампаро в Пескизе сан-Паулу (FAPESP), грантом CEPID 2013/07600-3 для GO, грантом 2018/05130-3 для RSF и 2016/19712-9 для ASG и Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (грант 88887.516153/2020-00) для ASG. Мы хотели бы с благодарностью поблагодарить Medicine for Malaria Ventures (MMV, www.mmv.org) и инициативу «Лекарства от забытых болезней» (DNDi, www.dndi.org) за их поддержку, разработку Блока реагирования на пандемию и поставку соединений.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
5'-biotin-U30- ACUGGAGAUCGAUCUCCAGU -3' Dharmacon - 100 ng
96-well cell culture plates KASVI K12-096
96-well PCR Microplate KASVI K4-9610
96-well White Flat Bottom Polystyrene High Bind Microplate Corning 3922
AMC (7-amine-4-methylcoumarin) SIGMA-Aldrich 257370 100 mg
Aprotinin from bovine lung SIGMA-Aldrich A1153 10 mg
ATP JenaBioscience NU-1010-1G 1 g
Bz-nKRR-AMC International Peptides - 5 mg
Class II Biohazard Safety Cabinet ESCO
Diethyl pyrocarbonate SIGMA-Aldrich D5758 25 mL
DMSO (Dimethyl sulfoxide) SIGMA-Aldrich 472301 1 L
Dulbecco’s Modified Eagle Medium GIBCO 3760091
Fetal Bovine Serum GIBCO 12657-029 500 mL
G418 SIGMA-Aldrich A1720 Disulfate salt
Glycerol SIGMA-Aldrich G5516 1 L
HERACELL VIOS 160i CO2 incubator Thermo Scientific
MnCl2 tetrahydrate SIGMA-Aldrich 203734 25 g
MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide) Invitrogen M6494
NITD008 ≥98% (HPLC) Sigma-Aldrich SML2409 5 mg
qPCR system Mx3000P Agilent
Renilla luciferase Assay System PROMEGA E2810
SpectraMax Gemini EM Fluorescence Reader Molecular Devices
SpectraMax i3 Multi-Mode Detection Platform Molecular Devices
SpectraMax Plus 384 Absorbance Microplate Reader Molecular Devices
SYBR Green I Invitrogen S7563 500 µl
Triton X-100 SIGMA-Aldrich X100 500 mL
Trizma base SIGMA-Aldrich T1503 1 kg
Trypsin-EDTA Solution 1X SIGMA-Aldrich 59417-C 100 mL

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Zou, J., Shi, P. Y. Strategies for Zika drug discovery. Current Opinion in Virology. 35, 19-26 (2019).
  2. Cugola, F. R., et al. The Brazilian Zika virus strain causes birth defects in experimental models. Nature. 534 (7606), 267-271 (2016).
  3. de Araújo, T. V. B., et al. Association between microcephaly, Zika virus infection, and other risk factors in Brazil: Final report of a case-control study. The Lancet Infectious Diseases. 18 (3), 328-336 (2018).
  4. Cao-Lormeau, V. -M., et al. Guillain-Barré Syndrome outbreak associated with Zika virus infection in French Polynesia: a case-control study. The Lancet. 387 (10027), 1531-1539 (2016).
  5. Pielnaa, P., et al. Zika virus-spread, epidemiology, genome, transmission cycle, clinical manifestation, associated challenges, vaccine and antiviral drug development. Virology. 543, 34-42 (2020).
  6. Bollati, M., et al. Structure and functionality in flavivirus NS-proteins: Perspectives for drug design Flaviviral NS3 protein Flaviviral NS5 protein Protease Helicase Polymerase Methyltransferase Flavivirus protein structure Antivirals VIZIER Consortium. Antiviral Research. 87, 125-148 (2010).
  7. Fernandes, R. S., et al. Reporter replicons for antiviral drug discovery against positive single-stranded RNA viruses. Viruses. 12 (6), (2020).
  8. Fernandes, R. S., et al. Discovery of an imidazonaphthyridine and a riminophenazine as potent anti-Zika virus agents through a replicon-based high-throughput screening. Virus Research. 299, 198388 (2021).
  9. Noske, G. D., et al. Structural characterization and polymorphism analysis of the NS2B-NS3 protease from the 2017 Brazilian circulating strain of Yellow Fever virus. Biochimica et Biophysica Acta - General Subjects. 1864 (4), 129521 (2020).
  10. Godoy, A. S., et al. Crystal structure of Zika virus NS5 RNA-dependent RNA polymerase. Nature Communications. 8, 14764 (2017).
  11. Yin, Z., et al. An adenosine nucleoside inhibitor of dengue virus. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (48), 20435-20439 (2009).
  12. Zhang, J. H., Chung, T. D. Y., Oldenburg, K. R. A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high throughput screening assays. Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).
  13. Brecher, M., Zhang, J., Li, H. The flavivirus protease as a target for drug discovery. Virologica Sinica. 28 (6), 326-336 (2013).
  14. Noble, C. G., Seh, C. C., Chao, A. T., Shi, P. Y. Ligand-bound structures of the dengue virus protease reveal the active conformation. Journal of Virology. 86 (1), 438-446 (2012).
  15. Chen, X., et al. Mechanisms of activation and inhibition of Zika virus NS2B-NS3 protease. Cell Research. 26 (11), 1260-1263 (2016).
  16. Eyer, L., Nencka, R., de Clercq, E., Seley-Radtke, K., Růžek, D. Nucleoside analogs as a rich source of antiviral agents active against arthropod-borne flaviviruses. Antiviral Chemistry and Chemotherapy. 26, (2018).
  17. Xie, X., et al. Zika Virus Replicons for Drug Discovery. EBioMedicine. 12, 156-160 (2016).
  18. Pan, K. L., Lee, J. C., Sung, H. W., Chang, T. Y., Hsu, J. T. A. Development of NS3/4A protease-based reporter assay suitable for efficiently assessing hepatitis C virus infection. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 53 (11), 4825-4834 (2009).
  19. Khumthong, R., Angsuthanasombat, C., Panyim, S., Katzenmeier, G. In Vitro Determination of Dengue Virus Type 2 NS2B-NS3 Protease Activity with Fluorescent Peptide Substrates. Journal of Biochemistry and Molecular Biology. 35 (2), (2002).
  20. Ulanday, G. E. L., Okamoto, K., Morita, K. Development and utility of an in vitro, fluorescence-based assay for the discovery of novel compounds against dengue 2 viral protease. Tropical Medicine and Health. 44 (1), 1-10 (2016).
  21. Ong, I. L. H., Yang, K. L. Recent developments in protease activity assays and sensors. Analyst. 142 (11), 1867-1881 (2017).
  22. Eltahla, A. A., Lackovic, K., Marquis, C., Eden, J. S., White, P. A. A fluorescence-based high-throughput screen to identify small compound inhibitors of the genotype 3a hepatitis c virus RNA polymerase. Journal of Biomolecular Screening. 18 (9), 1027-1034 (2013).
  23. Eydoux, C., et al. A fluorescence-based high throughput-screening assay for the SARS-CoV RNA synthesis complex. Journal of Virological Methods. 288, 114013 (2021).
  24. Shimizu, H., et al. Discovery of a small molecule inhibitor targeting dengue virus NS5 RNA-dependent RNA polymerase. PLoS Neglected Tropical Diseases. 13 (11), 1-21 (2019).
  25. Sáez-Álvarez, Y., Arias, A., del Águila, C., Agudo, R. Development of a fluorescence-based method for the rapid determination of Zika virus polymerase activity and the screening of antiviral drugs. Scientific Reports. 9 (1), 1-11 (2019).
  26. Kocabas, F., Turan, R. D., Aslan, G. S. Fluorometric RdRp assay with self-priming RNA. Virus Genes. 50 (3), 498-504 (2015).
  27. Niyomrattanakit, P., et al. A fluorescence-based alkaline phosphatase-coupled polymerase assay for identification of inhibitors of dengue virus RNA-Dependent RNA polymerase. Journal of Biomolecular Screening. 16 (2), 201-210 (2011).
  28. Simeonov, A., Davis, M. I. Interference with Fluorescence and Absorbance Flow Chart Fluorescence Interferences. (Md). , 1-8 (2016).
  29. Genick, C. C., et al. Applications of biophysics in high- Throughput screening hit validation. Journal of Biomolecular Screening. 19 (5), 707-714 (2014).
  30. Smith, T. M., et al. Identifying initiation and elongation inhibitors of dengue virus RNA polymerase in a high-throughput lead-finding campaign. Journal of Biomolecular Screening. 20 (1), 153-163 (2015).
  31. Porecha, R., Herschlag, D. RNA radiolabeling. Methods in enzymology. 530, 255-279 (2013).

Tags

Иммунология и инфекции выпуск 176
Высокопроизводительный противовирусный анализ для скрининга ингибиторов репликации вируса Зика
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Fernandes, R. S., Noske, G. D.,… More

Fernandes, R. S., Noske, G. D., Gawriljuk, V. O., de Oliveira, K. I. Z., Godoy, A. S., Mesquita, N. C. M. R., Oliva, G. High-throughput Antiviral Assays to Screen for Inhibitors of Zika Virus Replication. J. Vis. Exp. (176), e62422, doi:10.3791/62422 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter