Summary

Gebruik van trowell-type orgaancultuur om de regulatie van tandheelkundige stamcellen te bestuderen

Published: July 08, 2021
doi:

Summary

De Trowell-type orgaankweekmethode is gebruikt om complexe signaleringsnetwerken te ontrafelen die de tandontwikkeling regelen en, meer recent, voor het bestuderen van regulatie die betrokken is bij stamcellen van de continu groeiende muizensnijder. Fluorescerende reporter diermodellen en live-imaging methoden vergemakkelijken diepgaande analyses van tandheelkundige stamcellen en hun specifieke niche micro-omgeving.

Abstract

Orgaanontwikkeling, functie en regeneratie zijn afhankelijk van stamcellen, die zich bevinden in discrete anatomische ruimtes die stamcelniches worden genoemd. De continu groeiende muizensnijtand biedt een uitstekend model om weefselspecifieke stamcellen te bestuderen. De epitheliale weefselspecifieke stamcellen van de snijtand bevinden zich aan het proximale uiteinde van de tand in een nis die de cervicale lus wordt genoemd. Ze zorgen voor een continue instroom van cellen om de constante slijtage van de zelfslijpende punt van de tand te compenseren. Hier wordt een gedetailleerd protocol gepresenteerd voor de isolatie en cultuur van het proximale uiteinde van de muizensnijder die stamcellen en hun niche herbergt. Dit is een gemodificeerd Trowell-type orgaankweekprotocol dat in vitro kweek van weefselstukken (explantaten) mogelijk maakt, evenals de dikke weefselplakken op de vloeistof / lucht-interface op een filter ondersteund door een metalen rooster. Het hier beschreven orgaankweekprotocol maakt weefselmanipulaties mogelijk die in vivo niet haalbaar zijn, en in combinatie met het gebruik van een fluorescerende verslaggever (s), biedt het een platform voor de identificatie en tracking van discrete celpopulaties in levende weefsels in de loop van de tijd, inclusief stamcellen. Verschillende regulerende moleculen en farmacologische verbindingen kunnen in dit systeem worden getest op hun effect op stamcellen en hun niches. Dit biedt uiteindelijk een waardevol hulpmiddel om stamcelregulatie en -onderhoud te bestuderen.

Introduction

Muizensnijtanden groeien continu door levenslang behoud van de stamcellen (SC) die de onophoudelijke productie van tandcomponenten ondersteunen. Deze omvatten epitheliale SC’s, die glazuurproducerende ameloblasten genereren, en mesenchymale stamcellen (MSC’s), die dentineproducerende odontoblasten genereren, naast andere cellen1. De epitheliale SC’s in de continu groeiende snijtanden werden aanvankelijk geïdentificeerd als labelkerende cellen 2,3 en sindsdien is aangetoond dat ze een aantal bekende stamgenen tot expressie brengen, waaronder Sox24. Deze cellen delen gemeenschappelijke kenmerken met epitheliale SC’s in andere organen en bevinden zich in de SC-niche die de cervicale lus aan de labiale kant van de snijtand wordt genoemd. De niche is een dynamische entiteit die bestaat uit cellen en extracellulaire matrix die SC-activiteit5 regelen. Afstammingsonderzoeken hebben aangetoond dat Sox2+ epitheliale SC’s het hele epitheliale compartiment van de tand kunnen regenereren en dat ze cruciaal zijn voor successietandvorming 6,7. MSC’s met dentine herstellend of regeneratief potentieel worden grotendeels van buiten het orgaan gerekruteerd via bloedvaten en zenuwen 8,9,10,11, waardoor een geschikt model wordt geboden om werving, migratie en huisvesting van de MSC-populatie te bestuderen.

Het is niet altijd haalbaar om SC’s in vivo te bestuderen, omdat veel van de genetische en /of farmacologische manipulaties de homeostase van organen kunnen beïnvloeden en / of dodelijke gevolgen kunnen hebben. Daarom biedt orgaancultuur een uitstekend hulpmiddel om de regulatie van SC’s en hun niches in vitro te bestuderen. Het orgaankweeksysteem dat gebruik maakt van een metalen raster werd aanvankelijk ontwikkeld door Trowell12 om orgaanontwikkeling te bestuderen en is verder aangepast door Saxen13 om inductieve signalen in de nierontwikkeling te bestuderen. Sindsdien is deze in vitro methode om het geheel of een deel van het orgaan te kweken met succes toegepast op verschillende gebieden. Op het gebied van tandontwikkeling is deze methode op grote schaal gebruikt om de epitheliaal-mesenchymale interacties te bestuderen die de tandontwikkelingregelen 14 en de successietandvorming15. Het werk van het Thesleff-laboratorium heeft het nut van dit systeem aangetoond voor temporele analyse van tandgroei en morfogenese, voor analyse van het effect van verschillende moleculen en groeifactoren op tandgroei, en voor time-lapse live beeldvorming van tandontwikkeling 16,17. Meer recent is deze methode gebruikt om de regulatie van snijtandSC’s en hun niche18,19 te bestuderen, die hier in detail wordt beschreven.

Protocol

Dit protocol omvat het gebruik van dieren en alle procedures zijn goedgekeurd door ethische commissies voor het gebruik en de verzorging van dieren en de dierenfaciliteit aan de Universiteit van Helsinki. 1. Bereiding van de orgelcultuurschaal Voer alle procedures uit in een laminaire stromingskap. Reinig werkoppervlakken met 70% ethanol en gebruik instrumenten en oplossingen van autoclaved glas. Steriliseer een schaar en andere metalen apparatuur in een sterilisator met glaskralen.<…

Representative Results

De epitheliale SC’s bevinden zich in een niche die de cervicale lus wordt genoemd, die zich aan het proximale uiteinde van de snijtand bevindt (figuur 3A). Cervicale lussen zijn morfologisch verschillende structuren die bestaan uit binnenste en buitenste glazuurepitheel die het stellaire reticulum omhullen, een kern van losjes gerangschikte epitheelcellen (figuur 3B,C). Er zijn twee cervicale lussen in elke snijtand (figuur …

Discussion

In vitro orgaankweek is op grote schaal gebruikt om inductief potentieel en epitheliaal-mesenchymale interacties te bestuderen die orgaangroei en morfogenese regelen. Het Thesleff-laboratorium heeft aangetoond hoe de Saxén-modificatie van de Trowell-type orgaancultuur kan worden aangepast en gebruikt om de ontwikkeling van tanden tebestuderen 14. De reproduceerbare omstandigheden en vooruitgang in fluorescerende verslaggevers hebben dit een nuttige methode gemaakt voor het monitoren van …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Deze studie werd ondersteund door de Jane and Aatos Erkko Foundation.

Materials

1-mL plastic syringes
Disposable 20/26 gauge hypodermic needles Terumo
DMEM Gibco 61965-026
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline Gibco 14287
Extra Fine Bonn Scissors F.S.T. 14084-08
F-12 Gibco 31765-027
FBS South American (CE) LifeTechn. 10270106 divide in aliquotes, store at -20°C
Glass bead sterilizer, Steri 250 Seconds-Sterilizer Simon Keller Ltd 4AJ-6285884
GlutaMAX-1 (200 mM L-alanyl-L-glutamine dipeptide) Gibco 35050-038
Isopore Polycarb.Filters, 0,1 um 25-mm diameter MerckMillipore VCTP02500 Store in 70% ethanol at room temperature.
L-Ascobic Acid Sigma A4544-25g diluted 100 mg/ml in MilliQ, filter strerilized and divided in 20μl aliquotes, store at dark, -20°C
Low melting agarose TopVision R0801
Metal grids Commercially available, or self-made from stainless-steel mesh (corrosion resistant, size of mesh 0.7 mm). Cut approximately 30 mm diameter disk and bend the edges to give 3 mm height. Use nails to make holes.
Micro forceps Medicon 07.60.03
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich
Penicillin-Streptomycin (10,000U/ml) sol. Gibco 15140-148
Petri dishes, Soda-Lime glass DWK Life Sciences 9170442
Petridish 35 mm, with vent Duran 237554008
Petridish 90 mm, no vent classic Thermo Fisher 101RT/C
Small scissors

References

  1. Balic, A. Biology explaining tooth repair and regeneration: A mini-review. Gerontology. 64 (4), 382-388 (2018).
  2. Harada, H., et al. Localization of putative stem cells in dental epithelium and their association with Notch and FGF signaling. The Journal of Cell Biology. 147 (1), 105-120 (1999).
  3. Smith, C. E., Warshawsky, H. Cellular renewal in the enamel organ and the odontoblast layer of the rat incisor as followed by radioautography using 3H-thymidine. The Anatomical Record. 183 (4), 523-561 (1975).
  4. Balic, A., Thesleff, I. Tissue interactions regulating tooth development and renewal. Current Topics in Developmental Biology. 115, 157-186 (2015).
  5. Scadden, D. T. The stem-cell niche as an entity of action. Nature. 441 (7097), 1075-1079 (2006).
  6. Juuri, E., et al. Sox2 marks epithelial competence to generate teeth in mammals and reptiles. Development. 140 (7), 1424-1432 (2013).
  7. Juuri, E., et al. Sox2+ stem cells contribute to all epithelial lineages of the tooth via Sfrp5+ progenitors. Developmental Cell. 23 (2), 317-328 (2012).
  8. Feng, J., Mantesso, A., De Bari, C., Nishiyama, A., Sharpe, P. T. Dual origin of mesenchymal stem cells contributing to organ growth and repair. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (16), 6503-6508 (2011).
  9. Kaukua, N., et al. Glial origin of mesenchymal stem cells in a tooth model system. Nature. 513 (7519), 551-554 (2014).
  10. Zhao, H., et al. Secretion of shh by a neurovascular bundle niche supports mesenchymal stem cell homeostasis in the adult mouse incisor. Cell Stem Cell. 14 (2), 160-173 (2014).
  11. Vidovic, I., et al. alphaSMA-expressing perivascular cells represent dental pulp progenitors in vivo. Journal of Dental Research. 96 (3), 323-330 (2017).
  12. Trowell, O. A. A modified technique for organ culture in vitro. Experimental Cell Research. 6 (1), 246-248 (1954).
  13. Saxen, L., Vainio, T., Toivonen, S. Effect of polyoma virus on mouse kidney rudiment in vitro. Journal of the National Cancer Institute. 29, 597-631 (1962).
  14. Thesleff, I., Sahlberg, C. Organ culture in the analysis of tissue interactions. Methods in Molecular Biology. 461, 23-30 (2008).
  15. Jarvinen, E., Shimomura-Kuroki, J., Balic, A., Jussila, M., Thesleff, I. Mesenchymal Wnt/beta-catenin signaling limits tooth number. Development. 145 (4), (2018).
  16. Ahtiainen, L., Uski, I., Thesleff, I., Mikkola, M. L. Early epithelial signaling center governs tooth budding morphogenesis. The Journal of Cell Biology. 214 (6), 753-767 (2016).
  17. Narhi, K., Thesleff, I. Explant culture of embryonic craniofacial tissues: analyzing effects of signaling molecules on gene expression. Methods in Molecular Biology. 666, 253-267 (2010).
  18. Yang, Z., Balic, A., Michon, F., Juuri, E., Thesleff, I. Mesenchymal Wnt/beta-Catenin signaling controls epithelial stem cell homeostasis in teeth by inhibiting the antiapoptotic effect of Fgf10. Stem Cells. 33 (5), 1670-1681 (2015).
  19. Binder, M., et al. Functionally distinctive Ptch receptors establish multimodal hedgehog signaling in the tooth epithelial stem cell niche. Stem Cells. 37 (9), 1238-1248 (2019).
  20. Harada, H., et al. Localization of putative stem cells in dental epithelium and their association with Notch and FGF signaling. The Journal of Cell Biology. 147 (1), 105-120 (1999).
  21. Seidel, K., et al. Hedgehog signaling regulates the generation of ameloblast progenitors in the continuously growing mouse incisor. Development. 137 (22), 3753-3761 (2010).
  22. Hadjantonakis, A. K., Nagy, A. FACS for the isolation of individual cells from transgenic mice harboring a fluorescent protein reporter. Genesis. 27 (3), 95-98 (2000).
  23. Yu, Y. A., Szalay, A. A., Wang, G., Oberg, K. Visualization of molecular and cellular events with green fluorescent proteins in developing embryos: a review. Luminescence. 18 (1), 1-18 (2003).
  24. D’Amour, K. A., Gage, F. H. Genetic and functional differences between multipotent neural and pluripotent embryonic stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, 11866-11872 (2003).
  25. Chavez, M. G., et al. Isolation and culture of dental epithelial stem cells from the adult mouse incisor. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (87), (2014).
  26. Binder, M., et al. Novel strategies for expansion of tooth epithelial stem cells and ameloblast generation. Science Reports. 10 (1), 4963 (2020).

Play Video

Cite This Article
Juuri, E., Balic, A. Use of Trowell-Type Organ Culture to Study Regulation of Dental Stem Cells. J. Vis. Exp. (173), e62462, doi:10.3791/62462 (2021).

View Video