Uso da cultura de órgãos do tipo Trowell para estudar a regulação de células-tronco dentárias

Summary

O método de cultura de órgãos do tipo Trowell tem sido usado para desvendar redes de sinalização complexas que governam o desenvolvimento dentário e, mais recentemente, para estudar a regulação envolvida nas células-tronco do incisivo de camundongos em crescimento contínuo. Modelos animais fluorescentes-repórteres e métodos de imagem ao vivo facilitam análises aprofundadas de células-tronco dentárias e seu microambiente de nicho específico.

Abstract

O desenvolvimento, a função e a regeneração dos órgãos dependem das células-tronco, que residem em espaços anatômicos discretos chamados nichos de células-tronco. O incisivo de camundongo em crescimento contínuo fornece um excelente modelo para estudar células-tronco específicas de tecidos. As células-tronco específicas do tecido epitelial do incisivo estão localizadas na extremidade proximal do dente em um nicho chamado alça cervical. Eles fornecem um influxo contínuo de células para contrabalançar a abrasão constante da ponta auto-afiada do dente. Apresenta-se aqui um protocolo detalhado para o isolamento e cultura da extremidade proximal do incisivo de camundongo que abriga células-tronco e seu nicho. Este é um protocolo de cultura de órgãos do tipo Trowell modificado que permite a cultura in vitro de pedaços de tecido (explantes), bem como as fatias de tecido espesso na interface líquido/ar em um filtro suportado por uma grade metálica. O protocolo de cultura de órgãos descrito aqui permite manipulações teciduais inviáveis in vivo e, quando combinado com o uso de um repórter fluorescente, fornece uma plataforma para a identificação e rastreamento de populações de células discretas em tecidos vivos ao longo do tempo, incluindo células-tronco. Várias moléculas reguladoras e compostos farmacológicos podem ser testados neste sistema quanto ao seu efeito sobre as células-tronco e seus nichos. Isso, em última análise, fornece uma ferramenta valiosa para estudar a regulação e a manutenção das células-tronco.

Introduction

Os incisivos de camundongos crescem continuamente devido à preservação ao longo da vida das células-tronco (SC) que suportam a produção incessante de componentes dentários. Estes incluem SCs epiteliais, que geram ameloblastos produtores de esmalte, e células-tronco mesenquimais (MSCs), que geram odontoblastos produtores de dentina, entre outras células¹. Os SCs epiteliais nos incisivos de crescimento contínuo foram inicialmente identificados como células de retenção de rótulo^2,3 e, desde então, demonstraram expressar uma série de genes de caule bem conhecidos^, incluindo Sox2⁴. Essas células compartilham características comuns com SCs epiteliais em outros órgãos e residem dentro do nicho SC chamado alça cervical localizado no lado labial do incisivo. O nicho é uma entidade dinâmica composta por células e matriz extracelular que controlam a atividade da SC⁵. Estudos de traçado de linhagem demonstraram que os SCs epiteliais Sox2+ podem regenerar todo o compartimento epitelial do dente e que são cruciais para a formação sucessional do dente ^6,7. As CTMs com potencial reparador ou regenerativo dentinário são em grande parte recrutadas de fora do órgão através de vasos sanguíneos e nervos 8,9,10,11, fornecendo, portanto, um modelo adequado para estudar o recrutamento^, a migração e o alojamento da população de CTM.

Estudar SCs in vivo nem sempre é viável, uma vez que muitas das manipulações genéticas e/ou farmacológicas podem afetar a homeostase dos órgãos e/ou ter consequências letais. Portanto, a cultura de órgãos fornece uma excelente ferramenta para estudar a regulação das SCs e seus nichos in vitro. O sistema de cultura de órgãos que utiliza uma grade de metal foi inicialmente desenvolvido por Trowell¹² para estudar o desenvolvimento de órgãos e foi modificado por Saxen¹³ para estudar sinais indutivos no desenvolvimento renal. Desde então, este método in vitro de cultura da totalidade ou parte do órgão tem sido aplicado com sucesso em diferentes campos. No campo do desenvolvimento dentário, esse método tem sido amplamente utilizado para estudar as interações epitelial-mesenquimais que regem o desenvolvimento dentário¹⁴ e a formação sucessional dentária¹⁵. O trabalho do laboratório Thesleff demonstrou a utilidade desse sistema para a análise temporal do crescimento e morfogênese dentária, para a análise do efeito de várias moléculas e fatores de crescimento no crescimento dentário e para a imagem ao vivo em tempo de lapso temporal do desenvolvimento dentário^16,17. Mais recentemente, esse método tem sido utilizado para estudar a regulação de SCs incisivos e seu nicho^18,19, o que é descrito em detalhes aqui.

Protocol

Este protocolo envolve o uso de animais e todos os procedimentos foram aprovados pelos Comitês de Ética sobre o Uso e Cuidado de Animais e o Animal Facility da Universidade de Helsinque. 1. Preparação do prato de cultura de órgãos Realizar todos os procedimentos em um exaustor de fluxo laminar. Limpe as superfícies de trabalho com etanol a 70% e utilize instrumentos e soluções de vidro autoclavado. Esterilize tesouras e outros equipamentos de metal em um esterilizador de con…

Representative Results

Os SCs epiteliais residem em um nicho denominado alça cervical, que se localiza na extremidade proximal do incisivo (Figura 3A). As alças cervicais são estruturas morfologicamente distintas compostas de epitélio interno e externo do esmalte que envolvem o retículo estrelado, um núcleo de células epiteliais frouxamente dispostas (Figura 3B,C). Existem duas alças cervicais em cada incisivo (Figura 3A), mas ape…

Discussion

A cultura de órgãos in vitro tem sido amplamente utilizada para estudar o potencial indutivo e as interações epitelial-mesenquimais que governam o crescimento e a morfogênese dos órgãos. O laboratório Thesleff demonstrou como adaptar a modificação de Saxén da cultura de órgãos do tipo Trowell e usá-la para estudar o desenvolvimento dentário¹⁴. As condições reprodutíveis e os avanços nos repórteres fluorescentes tornaram este um método útil para monitorar a morfogêne…

Materials

1-mL plastic syringes
Disposable 20/26 gauge hypodermic needles	Terumo
DMEM	Gibco	61965-026
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline	Gibco	14287
Extra Fine Bonn Scissors	F.S.T.	14084-08
F-12	Gibco	31765-027
FBS South American (CE)	LifeTechn.	10270106	divide in aliquotes, store at -20°C
Glass bead sterilizer, Steri 250 Seconds-Sterilizer	Simon Keller Ltd	4AJ-6285884
GlutaMAX-1 (200 mM L-alanyl-L-glutamine dipeptide)	Gibco	35050-038
Isopore Polycarb.Filters, 0,1 um 25-mm diameter	MerckMillipore	VCTP02500	Store in 70% ethanol at room temperature.
L-Ascobic Acid	Sigma	A4544-25g	diluted 100 mg/ml in MilliQ, filter strerilized and divided in 20μl aliquotes, store at dark, -20°C
Low melting agarose	TopVision	R0801
Metal grids			Commercially available, or self-made from stainless-steel mesh (corrosion resistant, size of mesh 0.7 mm). Cut approximately 30 mm diameter disk and bend the edges to give 3 mm height. Use nails to make holes.
Micro forceps	Medicon	07.60.03
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich
Penicillin-Streptomycin (10,000U/ml) sol.	Gibco	15140-148
Petri dishes, Soda-Lime glass	DWK Life Sciences	9170442
Petridish 35 mm, with vent	Duran	237554008
Petridish 90 mm, no vent classic	Thermo Fisher	101RT/C
Small scissors