Summary

डेंटल स्टेम सेल के विनियमन का अध्ययन करने के लिए ट्रोवेल-टाइप ऑर्गन कल्चर का उपयोग

Published: July 08, 2021
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Summary

ट्रोवेल-प्रकार की अंग संस्कृति विधि का उपयोग जटिल सिग्नलिंग नेटवर्क को उजागर करने के लिए किया गया है जो दांत के विकास को नियंत्रित करते हैं और हाल ही में, लगातार बढ़ते माउस छेदक के स्टेम कोशिकाओं में शामिल विनियमन का अध्ययन करने के लिए। फ्लोरोसेंट-रिपोर्टर पशु मॉडल और लाइव-इमेजिंग विधियां दंत स्टेम कोशिकाओं और उनके विशिष्ट आला माइक्रोएन्वायरमेंट के गहन विश्लेषण की सुविधा प्रदान करती हैं।

Abstract

अंग विकास, कार्य और पुनर्जनन स्टेम कोशिकाओं पर निर्भर करते हैं, जो स्टेम सेल आला नामक असतत शारीरिक रिक्त स्थान के भीतर रहते हैं। लगातार बढ़ते माउस छेदक ऊतक-विशिष्ट स्टेम कोशिकाओं का अध्ययन करने के लिए एक उत्कृष्ट मॉडल प्रदान करता है। छेदक के उपकला ऊतक-विशिष्ट स्टेम कोशिकाएं गर्भाशय ग्रीवा लूप नामक एक आला में दांत के समीपस्थ छोर पर स्थित होती हैं। वे दांत के आत्म-तेज सिरे के निरंतर घर्षण को संतुलित करने के लिए कोशिकाओं की निरंतर आमद प्रदान करते हैं। यहां प्रस्तुत माउस छेदक के समीपस्थ छोर के अलगाव और संस्कृति के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल है जिसमें स्टेम सेल और उनके आला हैं। यह एक संशोधित ट्रोवेल-प्रकार का अंग संस्कृति प्रोटोकॉल है जो ऊतक के टुकड़ों (खोजों) के इन विट्रो कल्चर को सक्षम बनाता है, साथ ही धातु ग्रिड द्वारा समर्थित फिल्टर पर तरल / वायु इंटरफ़ेस पर मोटे ऊतक स्लाइस भी सक्षम बनाता है। यहां वर्णित अंग संस्कृति प्रोटोकॉल विवो में संभव नहीं ऊतक जोड़तोड़ को सक्षम बनाता है, और जब फ्लोरोसेंट रिपोर्टर (ओं) के उपयोग के साथ जोड़ा जाता है, तो यह स्टेम कोशिकाओं सहित समय के साथ जीवित ऊतकों में असतत सेल आबादी की पहचान और ट्रैकिंग के लिए एक मंच प्रदान करता है। स्टेम कोशिकाओं और उनके आला पर उनके प्रभाव के लिए इस प्रणाली में विभिन्न नियामक अणुओं और औषधीय यौगिकों का परीक्षण किया जा सकता है। यह अंततः स्टेम सेल विनियमन और रखरखाव का अध्ययन करने के लिए एक मूल्यवान उपकरण प्रदान करता है।

Introduction

स्टेम कोशिकाओं (एससी) के जीवन भर के संरक्षण के कारण माउस छेदक लगातार बढ़ते हैं जो दांत घटकों के निरंतर उत्पादन का समर्थन करते हैं। इनमें उपकला एससी शामिल हैं, जो तामचीनी-उत्पादक एमेलोब्लास्ट उत्पन्न करते हैं, और मेसेनकाइमल स्टेम सेल (एमएससी), जोअन्य कोशिकाओं के बीच डेंटिन-उत्पादक ओडोंटोब्लास्ट उत्पन्न करते हैं। लगातार बढ़ते छेदकों में उपकला एससी को शुरू में लेबल-रिटेनिंग कोशिकाओं 2,3 के रूप में पहचाना गया था और तब से सोक्स 24 सहित कई प्रसिद्ध स्टेमनेस जीन व्यक्त करने के लिए दिखाया गया है। ये कोशिकाएं अन्य अंगों में उपकला एससी के साथ सामान्य विशेषताओं को साझा करती हैं और एससी आला के भीतर रहती हैं जिसे छेदक के लैबियल साइड पर स्थित ग्रीवा लूप कहा जाता है। आला कोशिकाओं और बाह्य मैट्रिक्स से बना एक गतिशील इकाई है जो एससी गतिविधि5 को नियंत्रित करता है। वंश-अनुरेखण अध्ययनों से पता चला है कि सॉक्स 2 + उपकला एससी दांत के पूरे उपकला डिब्बे को पुनर्जीवित कर सकते हैं और वे उत्तराधिकार दांत गठन 6,7 के लिए महत्वपूर्ण हैं। डेंटिन रिपैरेटिव या पुनर्योजी क्षमता वाले एमएससी को बड़े पैमाने पर रक्त वाहिकाओं और नसों 8,9,10,11 के माध्यम से अंग के बाहर से भर्ती किया जाता है, इसलिए, एमएससी आबादी की भर्ती, प्रवास और आवास का अध्ययन करने के लिए एक उपयुक्त मॉडल प्रदान करता है।

विवो में एससी का अध्ययन करना हमेशा संभव नहीं होता है, क्योंकि कई आनुवंशिक और / या औषधीय जोड़तोड़ अंग होमियोस्टैसिस को प्रभावित कर सकते हैं और / या घातक परिणाम हो सकते हैं। इसलिए, अंग संस्कृति एससी और उनके आला के विनियमन का अध्ययन करने के लिए एक उत्कृष्ट उपकरण प्रदान करती है। धातु ग्रिड का उपयोग करने वाली अंग संस्कृति प्रणाली को शुरू में अंग विकास का अध्ययन करने के लिए ट्रोवेल12 द्वारा विकसित किया गया था और गुर्दे के विकास में प्रेरक संकेतों का अध्ययन करने के लिए सक्सेन13 द्वारा आगे संशोधित किया गया है। तब से, अंग के पूरे या हिस्से को संवर्धन करने की इस इन विट्रो विधि को विभिन्न क्षेत्रों में सफलतापूर्वक लागू किया गया है। दांतों के विकास के क्षेत्र में, इस विधि का व्यापक रूप से उपकला-मेसेनकाइमल इंटरैक्शन का अध्ययन करने के लिए उपयोग किया गया है जो दांत के विकास को नियंत्रित करता है14 और उत्तराधिकार दांत गठन15। थेस्लेफ प्रयोगशाला के काम ने दांतों के विकास और मोर्फोजेनेसिस के अस्थायी विश्लेषण के लिए, दांत के विकास पर विभिन्न अणुओं और विकास कारकों के प्रभाव के विश्लेषण के लिए, और दांतोंके विकास की टाइम-लैप्स लाइव इमेजिंग के लिए इस प्रणाली की उपयोगिता का प्रदर्शन किया है। हाल ही में, इस विधि का उपयोग छेदक एससी और उनके आला18,19 के विनियमन का अध्ययन करने के लिए किया गया है, जिसे यहां विस्तार से वर्णित किया गया है।

Protocol

इस प्रोटोकॉल में जानवरों का उपयोग शामिल है और सभी प्रक्रियाओं को हेलसिंकी विश्वविद्यालय में जानवरों और पशु सुविधा के उपयोग और देखभाल पर नैतिक समितियों द्वारा अनुमोदित किया गया था। 1. अंग संस…

Representative Results

उपकला एससी ग्रीवा लूप नामक एक आला में रहते हैं, जो छेदक के समीपस्थ छोर पर स्थित है (चित्रा 3 ए)। ग्रीवा लूप आंतरिक और बाहरी तामचीनी उपकला से बने रूपात्मक रूप से अलग-अलग संरचनाएं हैं जो स्टेलेट र…

Discussion

इन विट्रो ऑर्गन कल्चर का उपयोग प्रेरक क्षमता और उपकला-मेसेनकाइमल इंटरैक्शन का अध्ययन करने के लिए बड़े पैमाने पर किया गया है जो अंग विकास और मॉर्फोजेनेसिस को नियंत्रित करते हैं। थेस्लेफ प्रयोगशाल?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

इस अध्ययन को जेन और एटोस एर्को फाउंडेशन द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

1-mL plastic syringes
Disposable 20/26 gauge hypodermic needles Terumo
DMEM Gibco 61965-026
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline Gibco 14287
Extra Fine Bonn Scissors F.S.T. 14084-08
F-12 Gibco 31765-027
FBS South American (CE) LifeTechn. 10270106 divide in aliquotes, store at -20°C
Glass bead sterilizer, Steri 250 Seconds-Sterilizer Simon Keller Ltd 4AJ-6285884
GlutaMAX-1 (200 mM L-alanyl-L-glutamine dipeptide) Gibco 35050-038
Isopore Polycarb.Filters, 0,1 um 25-mm diameter MerckMillipore VCTP02500 Store in 70% ethanol at room temperature.
L-Ascobic Acid Sigma A4544-25g diluted 100 mg/ml in MilliQ, filter strerilized and divided in 20μl aliquotes, store at dark, -20°C
Low melting agarose TopVision R0801
Metal grids Commercially available, or self-made from stainless-steel mesh (corrosion resistant, size of mesh 0.7 mm). Cut approximately 30 mm diameter disk and bend the edges to give 3 mm height. Use nails to make holes.
Micro forceps Medicon 07.60.03
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich
Penicillin-Streptomycin (10,000U/ml) sol. Gibco 15140-148
Petri dishes, Soda-Lime glass DWK Life Sciences 9170442
Petridish 35 mm, with vent Duran 237554008
Petridish 90 mm, no vent classic Thermo Fisher 101RT/C
Small scissors

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Cite This Article
Juuri, E., Balic, A. Use of Trowell-Type Organ Culture to Study Regulation of Dental Stem Cells. J. Vis. Exp. (173), e62462, doi:10.3791/62462 (2021).

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