תאי CD34+ שמקורם במסנני לויקודלציה כמקור לתא לחקר בידול מגהקריוציט והיווצרות טסיות דם
Summary
פרוטוקול זה מתאר בפירוט את כל השלבים הכרוכים בהשגת CD34+ hematopoietic שמקורם ב- leukofilter ואת בידול המבחנה וההתבגרות שלהם למגקריוציטים נושאי פרופלטלט המסוגלים לשחרר טסיות דם במדיום התרבותי. הליך זה שימושי לניתוח מעמיק של מנגנונים תאיים ומולקולריים השולטים megakaryopoiesis.
Abstract
הרחבת במבחנה ובידול של אבות hematopoietic אנושי לתוך megakaryocytes מסוגל להאריך את מרחיבים ושחרור טסיות מאפשר מחקר מעמיק של המנגנונים שבבסיס ביוגנזה טסיות דם. פרוטוקולי התרבות הזמינים מבוססים בעיקר על אבות hematopoietic נגזר מח עצם או דם טבורי העלאת מספר חששות אתיים, טכניים וכלכליים. אם יש כבר פרוטוקולים זמינים להשגת תאי CD34 מדם היקפי, כתב יד זה מציע פרוטוקול פשוט וממוטב להשגת תאי CD34+ ממסנני לויקו-פלציה הזמינים במרכזי דם. תאים אלה מבודדים ממסנני לויקודלציה המשמשים להכנת מוצרי עירוי דם, המתאימים לשמונה תרומות דם. מסננים אלה אמורים להימחק. הליך מפורט לאיסוף אבות hematopoietic מזוהה כתאי CD34 + ממסננים אלה מתואר. השיטה להשיג megakaryocytes בוגר הרחבת פרופלטלטים תוך כדי דיון האבולוציה הפנוטיפית שלהם מפורט גם. לבסוף, הפרוטוקול מציג שיטת צנרת מכוילת, כדי לשחרר ביעילות טסיות דם הדומות מבחינה מורפולוגית ופונקציונלית לאלה ילידים. פרוטוקול זה יכול לשמש בסיס להערכת תרכובות פרמקולוגיות הפועלות בשלבים שונים של התהליך כדי לנתח את המנגנונים הבסיסיים ולגשת לתשואות טסיות ה- in vivo.
Introduction
טסיות הדם מגיעות מתאי פוליפלואיד גדולים מיוחדים, המגקריוציטים (MK), שמקורם בתהליך ייצור קבוע ומכוון המכונה megakaryopoiesis (MKP). בשיאו של תהליך זה נמצאים תאי גזע hematopoietic אשר, במגע עם סביבת מח העצם (ציטוקינים, גורמי שעתוק, נישה hematopoietic), יוכלו להתרבות ולהבדיל לתוך אבות hematopoietic (HP) מסוגל להתחייב לכיוון המסלול megakaryocytic, יצירת חברי פרל”ק לא בשלים1. בהשפעת ציטוקינים שונים, ובמיוחד תרומבו-אפיטין (TPO), שהוא הציטוקינים העיקריים של MKP; לאחר מכן יעבור הח”כ שני שלבים עיקריים של התבגרות: אנדומיטוזיס ופיתוח ממברנות תיחום (DMS). ח”כ בוגר לחלוטין זה מופיע אז קרוב לכלי סינויד שבו הוא יכול לפלוט הרחבות ציטופלסמיות, את proplatelets, אשר ישוחררו תחת זרימת הדם ולאחר מכן שופץ לתוך טסיות תפקוד2. השיבוט של TPO בשנת 1994 3 סיפקדחיפה במחקר של MKP על ידי האצת הפיתוח של טכניקות תרבות במבחנה המאפשרות בידול HP והתבגרות MK.
ישנן פתולוגיות רבות המשפיעות על טסיות הדם, הן מבחינת מספר טסיות הדם (עלייה או ירידה) והן מבחינת פונקציה4,5. היכולת לשחזר את MKP במבחנה של HP האנושית יכולה לשפר את ההבנה של המנגנונים המולקולריים והתאים שבבסיס תהליך זה ובסופו של דבר את הניהול הטיפולי של המטופלים.
מקורות שונים של HP האנושית מתאימים: דם טבורי, מח עצם, ודם היקפי6,7,8. קצירת HP מדם היקפי מעלה פחות בעיות לוגיסטיות ואתיות מאשר החלמתן מדם טבורי או ממח העצם. ניתן לשחזר את HP מלוקפרזיס או מעיל באפי, אך מקורות אלה יקרים ולא תמיד זמינים במרכזי דם. פרוטוקולים אחרים, פחות יקר וקל לביצוע, מאפשרים התאוששות ישירה של תאים מונונוקלאריים בדם היקפי אנושי (PBMCs) ללא צורך בבידוד מונע CD34 קודם4,8. עם זאת, טוהר המגקריוציטים אינו משביע רצון בשיטה זו ובחירה של תאי CD34+ מ- PBMC מומלצת לבידול אופטימלי לח”כ. זה הוביל אותנו ליישם טיהור HP ממסנני לויקורדוקציה (LRF), המשמש באופן שגרתי בבנקי דם כדי להסיר תאי דם לבנים ובכך למנוע תגובות חיסוניות שליליות9. ואכן, מאז 1998, תרכיזי טסיות דם כבר אוטומטי לויקודל בצרפת. בסוף תהליך זה, LRF נמחקים וכל התאים שנשמרו ב- LRF נהרסים. תאים במפות ה-LR הם, אם כן, זמינים ללא עלות נוספת. ל-LRFs יש תוכן סלולרי קרוב לזה המתקבל על ידי לויקפרזיס או במעילי באפי, במיוחד בהרכב של CD34+ HP, מה שהופך אותם למקור אטרקטיבי להפליא10. LRF כמקור HP אנושי כבר הוכח לספק לתאים יכולות תפקודיות שלמות11. מקור זה יש את היתרון של להיות בשפע ובמחיר סביר למחקר מעבדה. בהקשר זה, מאמר זה מתאר ברציפות: i) את החילוץ והבחירה של CD34+ HP מ- LRFs; ii) תרבות ממוטבת דו-פאזית, אשר משחזרת את המחויבות של HP למסלול המגקריוציטי והבשלת ח”כים המסוגלים לפלוט מפיץ; iii) שיטה לשחרור יעיל של טסיות דם מח”כים אלה; ו-4) הליך של ח”כ פנוטיפינג וטסיות דם תרבותיות.
Protocol
Representative Results
Discussion
פרוטוקול זה מתאר שיטה לייצור MK המסוגלת לפלוט פרופלטלטים מ- HP שמקורה בדם ולשחרר טסיות דם מדיום התרבות. HP מתקבלת מ- LRF, תוצר לוואי של בנקי הדם, המשמשת להסרת לויקוציטים מזהמים ממוצרי דם תאיים ולהימנע מתופעות לוואי. למרות ששיטה זו היא פשוטה יחסית, כמה נקודות ראויות לתשומת לב מיוחדת.
<p class="jove_conte…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי ANR (אגנס נשיונל דה לה Recherche) גרנט ANR- 17-CE14-0001-1.
Materials
| 7-AAD | Biolegend | 558819 | |
| ACD | EFS-Alsace | NA | |
| Anti-CD34-PE | Miltenyi biotec | 130-081-002 | |
| Anti-CD34-PECy7 | eBioscience | 25-0349-42 | |
| Anti-CD41-Alexa Fluor 488 | Biolegend | 303724 | |
| Anti-CD42a-PE | BD Bioscience | 559919 | |
| Apyrase | EFS-Alsace | NA | |
| BD Trucount Tubes | BD Bioscience | 340334 | |
| CD34 MicroBead Kit UltraPure, human | Miltenyi biotec | 130-100-453 | |
| Centrifuge | Heraeus | Megafuge 1.OR | Or equivalent material |
| Compteur ADAM | DiagitalBio | NA | Or equivalent material |
| Cryotubes | Dutscher | 55002 | Or equivalent material |
| Dextran from leuconostoc spp | Sigma | 31392-50g | Or equivalent material |
| DMSO Hybri-max | Sigma | D2650 | |
| EDTA 0.5 M | Gibco | 15575-039 | |
| Eppendorf 1,5 mL | Dutscher | 616201 | Or equivalent material |
| Filtration unit Steriflip PVDF | Merck Millipore Ltd | SE1M179M6 | |
| Flow Cytometer | BD Bioscience | Fortessa | |
| Human LDL | Stemcell technologies | #02698 | |
| ILOMEDINE 0,1 mg/1 mL | Bayer | MA038EX | |
| Inserts | Fenwal | R4R1401 | Or equivalent material |
| Laminar flow hood | Holten | NA | Archived product |
| LS Columms | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| Lymphoprep | Stemcell | 7861 | |
| Pen Strep Glutamine (100x) | Gibco | 10378-016 | |
| PBS (-) | Life Technologies | 14190-169 | Or equivalent material |
| PGi2 | Sigma | P6188 | |
| Poches de transferts 600ml | Macopharma | VSE4001XA | |
| Pre-Separation Filters (30µm) | Miltenyi Biotec | 130-041-407 | |
| StemRegenin 1 (SR1) | Stemcell technologies | #72344 | |
| StemSpan Expansion Supplement (100x) | Stemcell technologies | #02696 | |
| StemSpan-SFEM | Stemcell technologies | #09650 | |
| Stericup Durapore 0,22µm PVDF | Merck Millipore Ltd | SCGVU05RE | |
| SVF Hyclone | Thermos scientific | SH3007103 | |
| Syringues 30 mL | Terumo | SS*30ESE1 | Or equivalent material |
| Syringe filters Millex 0,22µM PVDF | Merck Millipore Ltd | SLGV033RB | |
| TPO | Stemcell technologies | #02822 | |
| Tubes 50 mL | Sarstedt | 62.548.004 PP | Or equivalent material |
| Tubes 15 mL | Sarstedt | 62.554.001 PP | Or equivalent material |
| Tubulures | B Braun | 4055137 | Or equivalent material |
References
- Deutsch, V. R., Tomer, A. Megakaryocyte development and platelet production. British Journal of Haematology. 134 (5), 453-466 (2006).
- Lefrancais, E., et al. The lung is a site of platelet biogenesis and a reservoir for haematopoietic progenitors. Nature. 544 (7648), 105-109 (2017).
- de Sauvage, F. J., et al. Stimulation of megakaryocytopoiesis and thrombopoiesis by the c-Mpl ligand. Nature. 369 (6481), 533-538 (1994).
- Almomani, M. H., Mangla, A. . StatPearls. , (2020).
- Strassel, C., Hechler, B., Bull, A., Gachet, C., Lanza, F. Studies of mice lacking the GPIb-V-IX complex question the role of this receptor in atherosclerosis. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 7 (11), 1935-1938 (2009).
- Delalat, B., et al. Isolation and ex vivo expansion of human umbilical cord blood-derived CD34+ stem cells and their cotransplantation with or without mesenchymal stem cells. Hematology. 14 (3), 125-132 (2009).
- Yin, T., Li, L. The stem cell niches in bone. The Journal of Clinical Investigation. 116 (5), 1195-1201 (2006).
- Salunkhe, V., Papadopoulos, P., Gutiérrez, L. Culture of megakaryocytes from human peripheral blood mononuclear cells. Bio-protocol. 5 (21), 1639 (2015).
- Peytour, Y., Villacreces, A., Chevaleyre, J., Ivanovic, Z., Praloran, V. Discarded leukoreduction filters: a new source of stem cells for research, cell engineering and therapy. Stem Cell Research. 11 (2), 736-742 (2013).
- Lapostolle, V., et al. Repopulating hematopoietic stem cells from steady-state blood before and after ex vivo culture are enriched in the CD34(+)CD133(+)CXCR4(low) fraction. Haematologica. 103 (10), 1604-1615 (2018).
- Ivanovic, Z., et al. Whole-blood leuko-depletion filters as a source of CD 34+ progenitors potentially usable in cell therapy. Transfusion. 46 (1), 118-125 (2006).
- Strassel, C., et al. Aryl hydrocarbon receptor-dependent enrichment of a megakaryocytic precursor with a high potential to produce proplatelets. Blood. 127 (18), 2231-2240 (2016).
- Do Sacramento, V., et al. Functional properties of human platelets derived in vitro from CD34(+) cells. Scientific Reports. 10 (1), 914 (2020).
- Blin, A., et al. Microfluidic model of the platelet-generating organ: beyond bone marrow biomimetics. Scientific Reports. 6, 21700 (2016).
- Ito, Y., et al. Turbulence activates platelet biogenesis to enable clinical scale ex vivo production. Cell. 174 (3), 636-648 (2018).
- Pallotta, I., Lovett, M., Kaplan, D. L., Balduini, A. Three-dimensional system for the in vitro study of megakaryocytes and functional platelet production using silk-based vascular tubes. Tissue Engineering. Part C, Methods. 17 (12), 1223-1232 (2011).
