Leukodepletion مرشحات المشتقة CD34 + الخلايا كمصدر الخلية لدراسة التمايز Megakaryocyte وتشكيل الصفائح الدموية
Summary
يصف هذا البروتوكول بالتفصيل جميع الخطوات التي ينطوي عليها الحصول على السلف المشتق من اللوكوفلتر CD34+ hematopoietic وتمايزها في المختبر ونضجها في الخلايا الضخمة الحاملة للصفيحات التي تكون قادرة على إطلاق الصفائح الدموية في وسط الثقافة. هذا الإجراء مفيد للتحليل المتعمق للآليات الخلوية والجزيئية التي تتحكم في الخلايا الضخمة.
Abstract
التوسع في المختبر والتمايز من السلف الدموية البشرية في الخلايا الضخمة قادرة على استطالة الصفائح الدموية والإفراج عن الصفائح الدموية يسمح دراسة متعمقة للآليات الكامنة وراء الصفائح الدموية biogenesis. تعتمد بروتوكولات الثقافة المتاحة في الغالب على السلف الدموية المشتقة من نخاع العظم أو دم الحبل السري مما يثير عددا من المخاوف الأخلاقية والتقنية والاقتصادية. إذا كانت هناك بروتوكولات متاحة بالفعل للحصول على خلايا CD34 من الدم المحيطي ، تقترح هذه المخطوطة بروتوكولا مباشرا ومحسنا للحصول على خلايا CD34 + من مرشحات leukodepletion المتاحة بسهولة في مراكز الدم. هذه الخلايا معزولة عن مرشحات leukodepletion المستخدمة في إعداد منتجات نقل الدم، المقابلة لثمانية التبرع بالدم. هذه المرشحات من المفترض أن يتم تجاهلها. ويرد وصف لإجراء مفصل لجمع السلف الدموية التي تم تحديدها على أنها خلايا CD34+ من هذه المرشحات. طريقة الحصول على megakaryocytes ناضجة تمديد proplatelets أثناء مناقشة تطورها phenotypic مفصلة أيضا. وأخيرا، يقدم البروتوكول طريقة معايرة للأنابيب، لإطلاق الصفائح الدموية التي تشبه بشكل شكلي ووظيفي تلك الأصلية بكفاءة. يمكن أن يكون هذا البروتوكول بمثابة أساس لتقييم المركبات الدوائية التي تعمل على خطوات مختلفة من العملية لتشريح الآليات الأساسية والنهج في الصفائح الدموية في الجسم الحي الغلة.
Introduction
تأتي الصفائح الدموية من خلايا متعددة الأضلاع كبيرة متخصصة ، وهي خلايا الكريكريات الضخمة (MK) ، التي تنشأ من عملية إنتاج ثابتة ومضبوطة تعرف باسم megakaryopoiesis (MKP). في ذروة هذه العملية هي الخلايا الجذعية الدموية التي، في اتصال مع بيئة نخاع العظام (السيتوكينات، وعوامل النسخ، المتخصصة الدموية)، وسوف تكون قادرة على الانتشار وتفرق في السلف الدموية (HP) قادرة على الالتزام نحو المسار megakaryocytic، مما أدى إلى MKsغير ناضجة 1. تحت تأثير السيتوكينات المختلفة، وخاصة الجلطات (TPO)، وهو السيتوكين الرئيسي ل MKP؛ سيخضع عضو الكنيست بعد ذلك لمرحلتين رئيسيتين من النضج: بطانة الرحم وتطوير أغشية الترسيم (DMS). هذا MK ناضجة تماما ثم يبدو قريبا من وعاء sinusoid التي يمكن أن تنبعث منها ملحقات السيتوبلازمية، وبروغليتس، والتي سيتم إطلاقها تحت تدفق الدم وإعادة تشكيلها في وقت لاحق إلى الصفائح الدموية وظيفية2. وقد وفر استنساخ TPO في عام 19943 دفعة قوية في دراسة MKP من خلال تسريع تطوير تقنيات الثقافة في المختبر مما يسمح بتمايز HP ونضوج MK.
هناك العديد من الأمراض التي تؤثر على الصفائح الدموية ، سواء من حيث عدد الصفائح الدموية (زيادة أو نقصان) ووظيفة4،5. يمكن أن تكون قادرة على تلخيص MKP في المختبر من HP الإنسان تحسين فهم الآليات الجزيئية والخلوية الكامنة وراء هذه العملية، وفي نهاية المطاف الإدارة العلاجية للمرضى.
مصادر مختلفة من HP الإنسان هي مناسبة: دم الحبل السري, نخاع العظام, والدم المحيطي6,7,8. حصاد HP من الدم المحيطي يثير مشاكل لوجستية وأخلاقية أقل من شفائهم من دم الحبل السري أو نخاع العظام. يمكن استرداد HP من leukapheresis أو معطف برتقالي، ولكن هذه المصادر مكلفة وغير متوفرة دائما في مراكز الدم. بروتوكولات أخرى، أقل تكلفة وأسهل لأداء، تسمح الانتعاش المباشر للخلايا أحادية النوى الدم المحيطي البشري (PBMCs) دون الحاجة إلى العزل CD34 مدفوعة مسبقا4،8. ومع ذلك ، فإن نقاء الخلايا الضخمة غير مرضية مع هذه الطريقة ، ويوصى بمجموعة مختارة من خلايا CD34 + من PBMC للتمايز الأمثل في MK. وهذا ما أدى بنا إلى تنفيذ تنقية HP من مرشحات leukoreduction (LRF)، وتستخدم بشكل روتيني في بنوك الدم لإزالة خلايا الدم البيضاء وبالتالي تجنب ردود الفعل المناعية السلبية9. في الواقع ، منذ عام 1998 ، تم تزويج تركيزات الصفائح الدموية تلقائيا في فرنسا. في نهاية هذه العملية، يتم تجاهل LRF ويتم تدمير جميع الخلايا المحتجزة في LRF. ولذلك، فإن الخلايا الموجودة في أطر العمل الدولية متاحة بسهولة دون أي تكلفة إضافية. LRFs لديها محتوى الخلوية قريبة من تلك التي تم الحصول عليها من قبل leukapheresis أو في المعاطف بافي، لا سيما في تكوينها من CD34 + HP مما يجعلها مصدرا جذابا بشكل ملحوظ10. LRF كمصدر HP الإنسان وقد ثبت بالفعل لتزويد الخلايا مع القدرات الوظيفية سليمة11. هذا المصدر لديه ميزة كونها وفيرة وبأسعار معقولة للبحوث المختبرية. في هذا السياق، توضح هذه المقالة على التوالي: ‘1’ استخراج واختيار CD34 + HP من LRFs؛ ‘2’ الاستخراج والتحديد من CD34 + HP من LRFs؛ ‘2’ الاستخراج والتحديد من ملفات CD34+ HP من LRFs؛ ‘2’ الاستخراج والتحديد من صيغة CD34+ HP من LRFs؛ 2) ثقافة محسنة من مرحلتين ، والتي تلخص التزام HP في المسار الضخمyocytic ونضوج MK قادرة على انبعاث الصفائح الدموية ؛ 3) طريقة لإطلاق الصفائح الدموية بكفاءة من هذه MK؛ و4) إجراء لphenotyping MK والصفائح الدموية المستزرعة.
Protocol
Representative Results
Discussion
يصف هذا البروتوكول طريقة لإنتاج MK قادرة على انبعاث الصفائح من HP المشتقة من الدم وإطلاق الصفائح الدموية من وسيط الثقافة. يتم الحصول على HP من LRF، وهو منتج ثانوي لبنوك الدم، يستخدم لإزالة الكريات البيض الملوثة من منتجات الدم الخلوية وتجنب ردود الفعل السلبية. على الرغم من أن هذه الطريقة بسيطة ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد دعم هذا العمل من قبل ANR (وكالة الوطنية للريشة) منح ANR- 17-CE14-0001-1.
Materials
| 7-AAD | Biolegend | 558819 | |
| ACD | EFS-Alsace | NA | |
| Anti-CD34-PE | Miltenyi biotec | 130-081-002 | |
| Anti-CD34-PECy7 | eBioscience | 25-0349-42 | |
| Anti-CD41-Alexa Fluor 488 | Biolegend | 303724 | |
| Anti-CD42a-PE | BD Bioscience | 559919 | |
| Apyrase | EFS-Alsace | NA | |
| BD Trucount Tubes | BD Bioscience | 340334 | |
| CD34 MicroBead Kit UltraPure, human | Miltenyi biotec | 130-100-453 | |
| Centrifuge | Heraeus | Megafuge 1.OR | Or equivalent material |
| Compteur ADAM | DiagitalBio | NA | Or equivalent material |
| Cryotubes | Dutscher | 55002 | Or equivalent material |
| Dextran from leuconostoc spp | Sigma | 31392-50g | Or equivalent material |
| DMSO Hybri-max | Sigma | D2650 | |
| EDTA 0.5 M | Gibco | 15575-039 | |
| Eppendorf 1,5 mL | Dutscher | 616201 | Or equivalent material |
| Filtration unit Steriflip PVDF | Merck Millipore Ltd | SE1M179M6 | |
| Flow Cytometer | BD Bioscience | Fortessa | |
| Human LDL | Stemcell technologies | #02698 | |
| ILOMEDINE 0,1 mg/1 mL | Bayer | MA038EX | |
| Inserts | Fenwal | R4R1401 | Or equivalent material |
| Laminar flow hood | Holten | NA | Archived product |
| LS Columms | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| Lymphoprep | Stemcell | 7861 | |
| Pen Strep Glutamine (100x) | Gibco | 10378-016 | |
| PBS (-) | Life Technologies | 14190-169 | Or equivalent material |
| PGi2 | Sigma | P6188 | |
| Poches de transferts 600ml | Macopharma | VSE4001XA | |
| Pre-Separation Filters (30µm) | Miltenyi Biotec | 130-041-407 | |
| StemRegenin 1 (SR1) | Stemcell technologies | #72344 | |
| StemSpan Expansion Supplement (100x) | Stemcell technologies | #02696 | |
| StemSpan-SFEM | Stemcell technologies | #09650 | |
| Stericup Durapore 0,22µm PVDF | Merck Millipore Ltd | SCGVU05RE | |
| SVF Hyclone | Thermos scientific | SH3007103 | |
| Syringues 30 mL | Terumo | SS*30ESE1 | Or equivalent material |
| Syringe filters Millex 0,22µM PVDF | Merck Millipore Ltd | SLGV033RB | |
| TPO | Stemcell technologies | #02822 | |
| Tubes 50 mL | Sarstedt | 62.548.004 PP | Or equivalent material |
| Tubes 15 mL | Sarstedt | 62.554.001 PP | Or equivalent material |
| Tubulures | B Braun | 4055137 | Or equivalent material |
References
- Deutsch, V. R., Tomer, A. Megakaryocyte development and platelet production. British Journal of Haematology. 134 (5), 453-466 (2006).
- Lefrancais, E., et al. The lung is a site of platelet biogenesis and a reservoir for haematopoietic progenitors. Nature. 544 (7648), 105-109 (2017).
- de Sauvage, F. J., et al. Stimulation of megakaryocytopoiesis and thrombopoiesis by the c-Mpl ligand. Nature. 369 (6481), 533-538 (1994).
- Almomani, M. H., Mangla, A. . StatPearls. , (2020).
- Strassel, C., Hechler, B., Bull, A., Gachet, C., Lanza, F. Studies of mice lacking the GPIb-V-IX complex question the role of this receptor in atherosclerosis. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 7 (11), 1935-1938 (2009).
- Delalat, B., et al. Isolation and ex vivo expansion of human umbilical cord blood-derived CD34+ stem cells and their cotransplantation with or without mesenchymal stem cells. Hematology. 14 (3), 125-132 (2009).
- Yin, T., Li, L. The stem cell niches in bone. The Journal of Clinical Investigation. 116 (5), 1195-1201 (2006).
- Salunkhe, V., Papadopoulos, P., Gutiérrez, L. Culture of megakaryocytes from human peripheral blood mononuclear cells. Bio-protocol. 5 (21), 1639 (2015).
- Peytour, Y., Villacreces, A., Chevaleyre, J., Ivanovic, Z., Praloran, V. Discarded leukoreduction filters: a new source of stem cells for research, cell engineering and therapy. Stem Cell Research. 11 (2), 736-742 (2013).
- Lapostolle, V., et al. Repopulating hematopoietic stem cells from steady-state blood before and after ex vivo culture are enriched in the CD34(+)CD133(+)CXCR4(low) fraction. Haematologica. 103 (10), 1604-1615 (2018).
- Ivanovic, Z., et al. Whole-blood leuko-depletion filters as a source of CD 34+ progenitors potentially usable in cell therapy. Transfusion. 46 (1), 118-125 (2006).
- Strassel, C., et al. Aryl hydrocarbon receptor-dependent enrichment of a megakaryocytic precursor with a high potential to produce proplatelets. Blood. 127 (18), 2231-2240 (2016).
- Do Sacramento, V., et al. Functional properties of human platelets derived in vitro from CD34(+) cells. Scientific Reports. 10 (1), 914 (2020).
- Blin, A., et al. Microfluidic model of the platelet-generating organ: beyond bone marrow biomimetics. Scientific Reports. 6, 21700 (2016).
- Ito, Y., et al. Turbulence activates platelet biogenesis to enable clinical scale ex vivo production. Cell. 174 (3), 636-648 (2018).
- Pallotta, I., Lovett, M., Kaplan, D. L., Balduini, A. Three-dimensional system for the in vitro study of megakaryocytes and functional platelet production using silk-based vascular tubes. Tissue Engineering. Part C, Methods. 17 (12), 1223-1232 (2011).
