류코데플션 필터-유래 CD34+ 세포가 메가카요시테 분화 및 혈소판 형성을 연구하는 세포 공급원으로
Summary
이 프로토콜은 배양 배지에서 혈소판을 방출할 수 있는 배혈구를 방출할 수 있는 배혈구를 생성할 수 있는 배혈구-발광식 CD34+ 조혈선 및 체외 분화 및 성숙을 얻는 데 관련된 모든 단계를 자세히 설명합니다. 이 절차는 거대 karyopoiesis를 통제하는 세포 및 분자 기계장치의 심층 분석에 유용합니다.
Abstract
자궁 내 의 팽창 및 발판을 연장하고 혈소판을 방출 할 수있는 거대 karyocytes로 인간의 조혈 선조의 분화는 혈소판 생물 발생의 메커니즘의 심층 연구를 할 수 있습니다. 사용 가능한 배양 프로토콜은 주로 골수 또는 코드 혈액에서 파생 된 조혈 선조에 기초하여 윤리적, 기술적, 경제적 우려를 제기합니다. 말초 혈액에서 CD34 세포를 얻기 위한 이미 유효한 프로토콜이 있는 경우에, 이 원고는 혈액 센터에서 쉽게 유효한 백혈구 필터에서 CD34+ 세포를 얻기 위한 간단하고 최적화된 프로토콜을 제안합니다. 이 세포는 8개의 혈액 기증에 대응하는 수혈 제품의 준비에 사용된 백혈구 필터에서 격리됩니다. 이러한 필터는 폐기해야 합니다. 이러한 필터에서 CD34+ 세포로 확인된 조혈 선조를 수집하는 상세한 절차가 설명되어 있습니다. 그들의 현상 진화를 토론하는 동안 proplatelet을 확장하는 성숙한 megakaryocytes를 얻는 방법 또한 상세합니다. 마지막으로, 프로토콜은 형태학적으로 그리고 기능적으로 네이티브 와 유사한 혈소판을 효율적으로 방출하기 위해 보정된 파이펫팅 방법을 제시한다. 이 프로토콜은 기본 메커니즘을 해부하고 생체 내 혈소판 수율에 접근하는 과정의 다양한 단계에서 작용하는 약리학적 화합물을 평가하기위한 기초가 될 수 있습니다.
Introduction
혈액 혈소판은 메가카요포이시스(MKP)로 알려진 상수 및 미세 조정 된 생산 공정에서 유래한 특수 대형 폴리플로이드 세포, 메가 카요사이클 (MK)에서 비롯됩니다. 이 과정의 정점에는 골수 환경(사이토카인, 전사 인자, 조혈 성 틈새)과 접촉하여 거대 핵증식 경로로 커밋할 수 있는 조혈선(HP)으로 증식하고 분화할 수 있는 조혈 줄기세포가있습니다. MKP의 주요 사이토카인인 다양한 사이토카인 및 특히 혈전포이에틴(TPO)의 영향하에서; MK는 다음 성숙의 두 가지 주요 단계를 겪습니다: 내막과 경계 막의 개발 (DMS). 이 완전히 성숙한 MK는 세포질 확장을 방출할 수 있는 부비동성 혈관에 가깝게 나타나며, 혈류하에서 방출되고 이후에 기능혈소판2로리모델링될 프로플라소판이 된다. 1994년3월 TPO의 복제는 HP 분화 및 MK 성숙을 허용하는 체외 배양 기술의 개발을 가속화함으로써 MKP 연구에 활력을 불어넣습니다.
혈소판 수(증가 또는 감소) 및 기능4,5의 관점에서 혈액 혈소판에 영향을 미치는 많은 병리들이있다. 인간 HP에서 시험관에서 MKP를 다시 수면할 수 있다는 것은 이 과정의 근간을 근로하고 궁극적으로 환자의 치료 관리를 위한 분자 및 세포 기계장치의 이해를 향상시킬 수 있었습니다.
인간의 HP의 다양한 소스는 적합하다 : 코드 혈액, 골수, 말초 혈액6,7,8. 말초 혈액에서 HP를 수확하는 것은 코드 혈액 또는 골수에서 회복하는 것보다 덜 물류 및 윤리적 문제를 제기합니다. HP는 백혈구 또는 버피 코트에서 복구 할 수 있지만, 이러한 소스는 비싸고 혈액 센터에서 항상 사용할 수 없습니다. 다른 프로토콜은, 더 저렴하고 수행하기 쉬운, 이전 CD34 구동절연4에대한 필요없이 인간의 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)의 직접 복구를 허용4,8. 그러나, 메가카요세포의 순도는 이 방법으로 만족스럽지 못하며 PBMC로부터 CD34+ 셀을 선택하여 MK로의 최적의 분화를 권장한다. 이것은 백혈구를 제거하고 따라서 불리한 면역 반응을 피하기 위하여 혈액 은행에서 일상적으로 이용되는 백혈구 감소 필터 (LRF)에서 HP 정화를 구현하기 위하여 저희를지도했습니다. 실제로, 1998 년 이후, 혈소판 농축액은 자동으로 프랑스에서 백류오데트되었습니다. 이 과정이 끝나면 LRF가 폐기되고 LRF에 유지되는 모든 셀이 파괴됩니다. 따라서 LRF의 세포는 추가 비용 없이 쉽게 사용할 수 있습니다. LRF는 백혈구 또는 버피 코트에 의해 얻은 것과 가까운 셀룰러 함량을 가지고 있으며, 특히 CD34 + HP의 구성에서 놀랍도록 매력적인 소스10을만듭니다. 인간 HP 소스로서의 LRF는 이미 세포에 온전한 기능성 용량을 제공하는 것으로입증되었다(11). 이 소스는 실험실 연구에 대 한 풍부 하 고 저렴 한 되 고의 장점이 있다. 이 맥락에서 이 문서에서는 연속적으로 설명합니다: i) LRFs의 CD34+ HP의 추출 및 선택; ii) 2단계 최적화 된 문화, 이는 발판을 방출 할 수있는 MK의 메가 카요 사이클 경로 및 성숙에 HP의 헌신을 재구성; iii) 이러한 MK로부터 혈소판을 효율적으로 방출하는 방법; 및 iv) Phenotyping MK 및 배양 혈소판에 대한 절차.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 프로토콜은 혈액 유래 HP로부터 프로플라판을 방출하고 배양 배지에서 혈소판을 방출할 수 있는 MK를 생산하는 방법을 설명합니다. HP는 혈액 은행의 부산물인 LRF로부터 수득되며, 세포 혈액 제품에서 백혈구를 오염시키는 것을 제거하고 불리한 반응을 피하는 데 사용됩니다. 이 방법은 비교적 간단하지만 몇 가지 점은 특별한주의를 기울일 자격이 있습니다.
밀도 그라데이…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 ANR (기관 국가 드 라 Recherche) 그랜트 ANR- 17-CE14-0001-1에 의해 지원되었습니다.
Materials
| 7-AAD | Biolegend | 558819 | |
| ACD | EFS-Alsace | NA | |
| Anti-CD34-PE | Miltenyi biotec | 130-081-002 | |
| Anti-CD34-PECy7 | eBioscience | 25-0349-42 | |
| Anti-CD41-Alexa Fluor 488 | Biolegend | 303724 | |
| Anti-CD42a-PE | BD Bioscience | 559919 | |
| Apyrase | EFS-Alsace | NA | |
| BD Trucount Tubes | BD Bioscience | 340334 | |
| CD34 MicroBead Kit UltraPure, human | Miltenyi biotec | 130-100-453 | |
| Centrifuge | Heraeus | Megafuge 1.OR | Or equivalent material |
| Compteur ADAM | DiagitalBio | NA | Or equivalent material |
| Cryotubes | Dutscher | 55002 | Or equivalent material |
| Dextran from leuconostoc spp | Sigma | 31392-50g | Or equivalent material |
| DMSO Hybri-max | Sigma | D2650 | |
| EDTA 0.5 M | Gibco | 15575-039 | |
| Eppendorf 1,5 mL | Dutscher | 616201 | Or equivalent material |
| Filtration unit Steriflip PVDF | Merck Millipore Ltd | SE1M179M6 | |
| Flow Cytometer | BD Bioscience | Fortessa | |
| Human LDL | Stemcell technologies | #02698 | |
| ILOMEDINE 0,1 mg/1 mL | Bayer | MA038EX | |
| Inserts | Fenwal | R4R1401 | Or equivalent material |
| Laminar flow hood | Holten | NA | Archived product |
| LS Columms | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| Lymphoprep | Stemcell | 7861 | |
| Pen Strep Glutamine (100x) | Gibco | 10378-016 | |
| PBS (-) | Life Technologies | 14190-169 | Or equivalent material |
| PGi2 | Sigma | P6188 | |
| Poches de transferts 600ml | Macopharma | VSE4001XA | |
| Pre-Separation Filters (30µm) | Miltenyi Biotec | 130-041-407 | |
| StemRegenin 1 (SR1) | Stemcell technologies | #72344 | |
| StemSpan Expansion Supplement (100x) | Stemcell technologies | #02696 | |
| StemSpan-SFEM | Stemcell technologies | #09650 | |
| Stericup Durapore 0,22µm PVDF | Merck Millipore Ltd | SCGVU05RE | |
| SVF Hyclone | Thermos scientific | SH3007103 | |
| Syringues 30 mL | Terumo | SS*30ESE1 | Or equivalent material |
| Syringe filters Millex 0,22µM PVDF | Merck Millipore Ltd | SLGV033RB | |
| TPO | Stemcell technologies | #02822 | |
| Tubes 50 mL | Sarstedt | 62.548.004 PP | Or equivalent material |
| Tubes 15 mL | Sarstedt | 62.554.001 PP | Or equivalent material |
| Tubulures | B Braun | 4055137 | Or equivalent material |
References
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