Dit protocol beschrijft in detail alle stappen die betrokken zijn bij het verkrijgen van leukofilter-afgeleide CD34 + hematopoietische voorlopers en hun in vitro differentiatie en rijping tot proplatelet-dragende megakaryocyten die in staat zijn om bloedplaatjes in het kweekmedium vrij te geven. Deze procedure is nuttig voor diepgaande analyse van cellulaire en moleculaire mechanismen die megakaryopoiese beheersen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Leukodepletiefilters-afgeleide CD34 + -cellen als een celbron om megakaryocytendifferentiatie en bloedplaatjesvorming te bestuderen
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
De in vitro expansie en differentiatie van menselijke hematopoietische voorlopers in megakaryocyten die in staat zijn om voorplaatjes te verlengen en bloedplaatjes vrij te geven, maakt een diepgaande studie mogelijk van de mechanismen die ten grondslag liggen aan de biogenese van bloedplaatjes. Beschikbare kweekprotocollen zijn meestal gebaseerd op hematopoëtische voorlopercellen afgeleid van beenmerg- of navelstrengbloed die een aantal ethische, technische en economische zorgen oproepen. Als er al protocollen beschikbaar zijn voor het verkrijgen van CD34-cellen uit perifeer bloed, stelt dit manuscript een eenvoudig en geoptimaliseerd protocol voor voor het verkrijgen van CD34 + -cellen uit leukodepletiefilters die direct beschikbaar zijn in bloedcentra. Deze cellen worden geïsoleerd uit leukodepletiefilters die worden gebruikt bij de bereiding van bloedtransfusieproducten, wat overeenkomt met acht bloeddonaties. Deze filters zijn bedoeld om weggegooid te worden. Een gedetailleerde procedure om hematopoëtische voorlopercellen geïdentificeerd als CD34+ cellen uit deze filters te verzamelen, wordt beschreven. De methode om volwassen megakaryocyten te verkrijgen die proplatelets verlengen terwijl hun fenotypische evolutie wordt besproken, is ook gedetailleerd. Ten slotte presenteert het protocol een gekalibreerde pipetteermethode, om bloedplaatjes die morfologisch en functioneel vergelijkbaar zijn met inheemse bloedplaatjes efficiënt vrij te geven. Dit protocol kan dienen als basis voor het evalueren van farmacologische verbindingen die in verschillende stappen van het proces werken om de onderliggende mechanismen te ontleden en de in vivo bloedplaatjesopbrengsten te benaderen.
Inleiding
Bloedplaatjes zijn afkomstig van gespecialiseerde grote polyploïde cellen, de megakaryocyten (MK), die afkomstig zijn van een constant en nauwkeurig afgestemd productieproces dat bekend staat als megakaryopoiese (MKP). Aan de top van dit proces bevinden zich hematopoëtische stamcellen die, in contact met de beenmergomgeving (cytokines, transcriptiefactoren, hematopoietische niche), in staat zullen zijn om zich te vermenigvuldigen en te differentiëren in hematopoëtische voorlopers (HP) die zich kunnen committeren aan de megakaryocytische route, wat aanleiding geeft tot onrijpe MKs1. Onder invloed van verschillende cytokines, en in het bijzonder ....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Controle menselijke monsters werden verkregen van volonteer bloeddonoren die schriftelijke geïnformeerde toestemming gaven gerekruteerd door het bloedtransfusiecentrum waar het onderzoek werd uitgevoerd (Etablissement Français du Sang-Grand Est). Alle procedures werden geregistreerd en goedgekeurd door het Franse ministerie van Hoger Onderwijs en Onderzoek en geregistreerd onder het nummer AC_2015_2371.De donoren gaven hun goedkeuring in het CODHECO-nummer AC- 2008 - 562 toestemmingsformulier, zodat de monsters voor onderzoeksdoeleinden konden worden gebruikt. Menselijke studies werden uitgevoerd volgens de verklaring van Helsinki.
1. Extract....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Extractie en selectie van CD34+ cellen uit LRF's
Hier beschrijft de methode, afgeleid van Peytour et al.9, de extractie en selectie van CD34+ cellen uit afgedankte LRF's die beschikbaar zijn in bloedbanken na verwijdering van leukocyten. Na de backflush-procedure worden gewoonlijk 1,03 x 109 ± 2,45 x10 8 cellen/LRF (Mean±SEM; n = 155) teruggevonden met een levensvatbaarheid van 94,88 ± 0,10% (figuur 2A i
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Dit protocol beschrijft een methode voor het produceren van MK die in staat is om proplatelets uit bloedafname HP uit te zenden en bloedplaatjes uit het kweekmedium vrij te geven. HP worden verkregen uit LRF, een bijproduct van de bloedbanken, gebruikt om besmettelijk leukocyten uit cellulaire bloedproducten te verwijderen en bijwerkingen te voorkomen. Hoewel deze methode relatief eenvoudig is, verdienen een paar punten speciale aandacht.
De afzetting van de celsuspensie op het medium met dich.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Dit werk is ondersteund door ANR (Agence National de la Recherche) Grant ANR- 17-CE14-0001-1.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 7-AAD | Biolegend | 558819 | |
| ACD | EFS-Alsace | NA | |
| Anti-CD34-PE | Miltenyi biotec | 130-081-002 | |
| Anti-CD34-PECy7 | eBioscience | 25-0349-42 | |
| Anti-CD41-Alexa Fluor 488 | Biolegend | 303724 | |
| Anti-CD42a-PE | BD Bioscience | 559919 | |
| Apyrase | EFS-Alsace | NA | |
| BD Trucount Tubes | BD Bioscience | 340334 | |
| CD34 MicroBead Kit UltraPure, human | Miltenyi biotec | 130-100-453 | |
| Centrifuge | Heraeus | Megafuge 1.OR | Of gelijkwaardig materiaal |
| Compteur ADAM | DiagitalBio | NA | Of gelijkwaardig materiaal |
| Cryotubes | Dutscher | 55002 | Of gelijkwaardig materiaal |
| Dextran from leuconostoc spp | Sigma | 31392-50g | Of gelijkwaardig materiaal |
| DMSO Hybri-max | Sigma | D2650 | |
| EDTA 0.5 M | Gibco | 15575-039 | |
| Eppendorf 1,5 mL | Dutscher | 616201 | Of gelijkwaardig materiaal |
| Filtration unit Steriflip PVDF | Merck Millipore Ltd | SE1M179M6 | |
| Flow Cytometer | BD Bioscience | Fortessa | |
| Human LDL | Stemcell technologies | #02698 | |
| ILOMEDINE 0,1 mg/1 mL | Bayer | MA038EX | |
| Inserts | Fenwal | R4R1401 | Of gelijkwaardig materiaal |
| Laminar flow hood | Holten | NA | Gearchiveerd product |
| LS Columms | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| Lymphoprep | Stemcell | 7861 | |
| Pen Strep Glutamine (100x) | Gibco | 10378-016 | |
| PBS (-) | Life Technologies | 14190-169 | Of gelijkwaardig materiaal |
| PGi2 | Sigma | P6188 | |
| Poches de transferts 600ml | Macopharma | VSE4001XA | |
| Pre-Separation Filters (30µm) | Miltenyi Biotec | 130-041-407 | |
| StemRegenin 1 (SR1) | Stemcell technologies | #72344 | |
| StemSpan Expansion Supplement (100x) | Stemcell technologies | #02696 | |
| StemSpan-SFEM | Stemcell technologies | #09650 | |
| Stericup Durapore 0,22µm PVDF | Merck Millipore Ltd | SCGVU05RE | |
| SVF Hyclone | Thermos scientific | SH3007103 | |
| Syringues 30 mL | Terumo | SS*30ESE1 | Of gelijkwaardig materiaal |
| Syringe filters Millex 0,22µM PVDF | Merck Millipore Ltd | SLGV033RB | |
| TPO | Stemcell technologies | #02822 | |
| Tubes 50 mL | Sarstedt | 62.548.004 PP | Of gelijkwaardig materiaal |
| Tubes 15 mL | Sarstedt | 62.554.001 PP | Of gelijkwaardig materiaal |
| Tubulures | B Braun | 4055137 | Of gelijkwaardig materiaal |
Referenties
- Deutsch, V. R., Tomer, A. Megakaryocyte development and platelet production. British Journal of Haematology. 134 (5), 453-466 (2006).
- Lefrancais, E., et al. The lung is a site of platelet biogenesis and a reservoir for haematopoietic progenitors. Natu....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
