Summary
Dit protocol beschrijft in detail alle stappen die betrokken zijn bij het verkrijgen van leukofilter-afgeleide CD34 + hematopoietische voorlopers en hun in vitro differentiatie en rijping tot proplatelet-dragende megakaryocyten die in staat zijn om bloedplaatjes in het kweekmedium vrij te geven. Deze procedure is nuttig voor diepgaande analyse van cellulaire en moleculaire mechanismen die megakaryopoiese beheersen.
Abstract
De in vitro expansie en differentiatie van menselijke hematopoietische voorlopers in megakaryocyten die in staat zijn om voorplaatjes te verlengen en bloedplaatjes vrij te geven, maakt een diepgaande studie mogelijk van de mechanismen die ten grondslag liggen aan de biogenese van bloedplaatjes. Beschikbare kweekprotocollen zijn meestal gebaseerd op hematopoëtische voorlopercellen afgeleid van beenmerg- of navelstrengbloed die een aantal ethische, technische en economische zorgen oproepen. Als er al protocollen beschikbaar zijn voor het verkrijgen van CD34-cellen uit perifeer bloed, stelt dit manuscript een eenvoudig en geoptimaliseerd protocol voor voor het verkrijgen van CD34 + -cellen uit leukodepletiefilters die direct beschikbaar zijn in bloedcentra. Deze cellen worden geïsoleerd uit leukodepletiefilters die worden gebruikt bij de bereiding van bloedtransfusieproducten, wat overeenkomt met acht bloeddonaties. Deze filters zijn bedoeld om weggegooid te worden. Een gedetailleerde procedure om hematopoëtische voorlopercellen geïdentificeerd als CD34+ cellen uit deze filters te verzamelen, wordt beschreven. De methode om volwassen megakaryocyten te verkrijgen die proplatelets verlengen terwijl hun fenotypische evolutie wordt besproken, is ook gedetailleerd. Ten slotte presenteert het protocol een gekalibreerde pipetteermethode, om bloedplaatjes die morfologisch en functioneel vergelijkbaar zijn met inheemse bloedplaatjes efficiënt vrij te geven. Dit protocol kan dienen als basis voor het evalueren van farmacologische verbindingen die in verschillende stappen van het proces werken om de onderliggende mechanismen te ontleden en de in vivo bloedplaatjesopbrengsten te benaderen.
Introduction
Bloedplaatjes zijn afkomstig van gespecialiseerde grote polyploïde cellen, de megakaryocyten (MK), die afkomstig zijn van een constant en nauwkeurig afgestemd productieproces dat bekend staat als megakaryopoiese (MKP). Aan de top van dit proces bevinden zich hematopoëtische stamcellen die, in contact met de beenmergomgeving (cytokines, transcriptiefactoren, hematopoietische niche), in staat zullen zijn om zich te vermenigvuldigen en te differentiëren in hematopoëtische voorlopers (HP) die zich kunnen committeren aan de megakaryocytische route, wat aanleiding geeft tot onrijpe MKs1. Onder invloed van verschillende cytokines, en in het bijzonder trombopoietine (TPO), het belangrijkste cytokine van MKP; de MK zal dan twee belangrijke stadia van rijping ondergaan: endomitose en de ontwikkeling van demarcatiemembranen (DMS). Deze volledig volwassen MK verschijnt dan dicht bij een sinusoïde vat waarin het cytoplasmatische extensies kan uitzenden, de proplatelets, die onder de bloedstroom worden vrijgegeven en vervolgens worden omgevormd tot functionele bloedplaatjes2. Het klonen van TPO in 19943 gaf een impuls aan de studie van MKP door de ontwikkeling van in vitro kweektechnieken te versnellen die HP-differentiatie en MK-rijping mogelijk maakten.
Er zijn veel pathologieën die bloedplaatjes beïnvloeden, zowel in termen van bloedplaatjesaantal (toename of afname) als functie4,5. In staat zijn om MKP in vitro van menselijke HP samen te vatten, zou het begrip van de moleculaire en cellulaire mechanismen die ten grondslag liggen aan dit proces en uiteindelijk het therapeutisch beheer van patiënten kunnen verbeteren.
Verschillende bronnen van menselijk HP zijn geschikt: navelstrengbloed, beenmerg en perifeer bloed6,7,8. Het oogsten van HP uit perifeer bloed levert minder logistieke en ethische problemen op dan hun herstel uit navelstrengbloed of het beenmerg. HP kan worden hersteld van leukaferese of buffy coat, maar deze bronnen zijn duur en niet altijd beschikbaar in bloedcentra. Andere protocollen, minder duur en gemakkelijker uit te voeren, maken direct herstel van menselijke perifere bloedmononucleaire cellen (PBMC's) mogelijk zonder de noodzaak van voorafgaande CD34-gestuurde isolatie4,8. De zuiverheid van megakaryocyten is echter niet bevredigend met deze methode en een selectie van CD34+ cellen uit PBMC wordt aanbevolen voor optimale differentiatie in MK. Dit bracht ons ertoe om een HP-zuivering van leukoreductiefilters (LRF) te implementeren, routinematig gebruikt in bloedbanken om witte bloedcellen te verwijderen en zo nadelige immunologische reacties te voorkomen9. Sinds 1998 zijn bloedplaatjesconcentraten in Frankrijk zelfs automatisch leukodeputten. Aan het einde van dit proces worden LRF weggegooid en worden alle cellen die in de LRF worden vastgehouden, vernietigd. Cellen in LRF's zijn daarom direct beschikbaar zonder extra kosten. LRF's hebben een cellulair gehalte dat dicht in de buurt komt van dat verkregen door leukaferese of in buffy coats, met name in hun samenstelling van CD34 + HP waardoor ze een opmerkelijk aantrekkelijke bronzijn 10. Van LRF als menselijke HP-bron is al aangetoond dat het cellen voorziet van intacte functionele capaciteiten11. Deze bron heeft het voordeel dat het overvloedig en betaalbaar is voor laboratoriumonderzoek. In dit verband beschrijft dit artikel achtereenvolgens: i) de extractie en selectie van CD34+ HP uit LPF's; ii) een tweefasige geoptimaliseerde cultuur, die de inzet van HP in de megakaryocytische route en de rijping van MK die proplatelets kan uitzenden, samenvat; iii) een methode voor het efficiënt vrijgeven van bloedplaatjes uit deze MK; en iv) een procedure voor fenotypering van MK en gekweekte bloedplaatjes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Controle menselijke monsters werden verkregen van volonteer bloeddonoren die schriftelijke geïnformeerde toestemming gaven gerekruteerd door het bloedtransfusiecentrum waar het onderzoek werd uitgevoerd (Etablissement Français du Sang-Grand Est). Alle procedures werden geregistreerd en goedgekeurd door het Franse ministerie van Hoger Onderwijs en Onderzoek en geregistreerd onder het nummer AC_2015_2371.De donoren gaven hun goedkeuring in het CODHECO-nummer AC- 2008 - 562 toestemmingsformulier, zodat de monsters voor onderzoeksdoeleinden konden worden gebruikt. Menselijke studies werden uitgevoerd volgens de verklaring van Helsinki.
1. Extractie en selectie van CD34+ cellen (HP) uit LRF
-
Bereiding van het reagens (voor één LRF)
- Bereid 25 ml gefilterde elutiebuffer voor: 21,25 ml fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS), 2,5 ml zuur-citraat-dextrose (ACD) en 1,25 ml gedecomplementeerd foetaal runderserum (FBS). Filter op 0,22 μm en plaats op 37 °C.
- Bereid 500 ml PBS met 2 mM ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA).
- Gooi 25 ml dichtheidsgradiëntmedium (DGM) (1,077 g/ml) weg in twee buizen van 50 ml.
-
LRF-terugspoelingsmodaliteiten (Figuur 1)
OPMERKING: Deze stap vereist een steriele buislasmachine, waardoor steriele verbinding van thermoplastische buizen mogelijk is.- Sluit eerst de LRF aan op een lege transferzak van 600 ml en de LRF op een slangenset(figuur 1A). Injecteer onder de bioveiligheidskast het totale volume gefilterde en voorbereide elutiebuffer dat overeenkomt met het aantal behandelde LRF's (xLRF x 25 ml) in de lege zak. Gebruik vervolgens een spuit van 30 ml om de volledige inhoud van de zak voorzichtig door de LRF te zuigen, terugvloei en breng de cellen over in een nieuwe buis van 50 ml(figuur 1B).
- Voor de sedimentatie van rode bloedcellen, verdun de celsuspensie met de helft met Dextran 2% en meng goed om rode bloedcellen te aggregeren. Wacht 30 minuten bij kamertemperatuur (RT).
Figuur 1: LRF-terugspoelmodaliteiten. (A) Representatief schema van (i) de steriele aansluiting van de transferzak op de LRF en (ii) de slangenset op de LRF. B)Representatief schema voor de aansluiting van de spuiten voor celverzameling. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
-
PBMC collectie
- Na de sedimentatie van de rode bloedcellen, verwijdert en breng het supernatant over in een buis van 50 ml en vul het met PBS-EDTA 2 mM. Leg het supernatant voorzichtig over de hierboven voorbereide DGM. Laat het bovennatuurlijk zachtjes stromen zonder het oppervlaktevlak van de dichtheidsgradiënt te breken. Centrifugeer bij 400 x g bij RT gedurende 30 minuten in de brake off-modus.
- Verzamel de PBMC-laag met een wegwerptransferpipet. Breng de cellen van elke DGM-buis over in een nieuwe steriele buis van 50 ml. Vul elke buis met PBS-EDTA 2 mM en was tweemaal in 50 ml PBS-EDTA 2 mM bij 200 x g gedurende 10 minuten bij RT in brake on-modus.
- Pipetteer af en pool de celkorrel met 50 ml PBS-EDTA 2 mM.
OPMERKING: Er is een mogelijkheid om de procedure te stoppen door de verzamelde cellen 's nachts op 4 °C te laten roeren. Filter vervolgens de suspensie met een celzeef van 40 μm om de gevormde aggregaten te verwijderen.
-
CD34+ cellen selectie
- Bepaal het celnummer en centrifugeer bij 400 x g bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten met de pauze aan.
- Adem het supernatant volledig op en resuspend in het juiste volume PBS-EDTA 2 mM, gedetailleerd door de fabrikant van de CD34-selectiekit (300 μL PBS-EDTA voor 108 cellen). Voeg het FcR-blokkerende reagens en de CD34 Microbeads toe in de juiste concentratie (50 μL voor 108 cellen).
- Was de celsuspensie na 30 minuten bij 4 °C en resuspendatie in het juiste volume PBS-EDTA 2 mM, zoals beschreven door de fabrikant van de CD34-selectiekit (500 μL per 108 cellen).
OPMERKING: De selectie wordt gemaakt op sorteerkolommen voor de passage van maximaal 2 x 109 cellen per kolom. - Geef het monster over de natte kolom van de magneet. Was tweemaal met 3 ml PBS-EDTA 2 mM en eluteer de cellen met 5 ml PBS-EDTA 2 mM. Een tweede run op een nieuwe kolom volgens dezelfde procedure is nodig om de zuiverheid van het monster te verbeteren.
OPMERKING: Een verwacht aantal van 6,1 x 105 cellen/LRF(figuur 2A). Voor hogere LRF-nummers, schaal reagentia en methoden dienovereenkomstig op.
-
Evaluatie van cd34+ celzuiverheid
- Voeg aan een aliquot van 100 μL suspensie verkregen na de CD34+ selectie, 2 μL humaan CD34-PE-antilichaam of 2 μL IgG - PE (controle) toe. Meng goed en incubeer gedurende 15 min bij 4 °C.
- Was de cellen door 2 ml PBS toe te voegen en centrifugeer gedurende 5 minuten bij 400 x g. Aspiraat supernatant volledig en resuspend in 200 μL PBS.
- Analyseer de zuiverheid door flowcytometrie zoals weergegeven in figuur 2A en in de discussie.
OPMERKING: Een zuiverheid van CD34+ cellen boven 90% wordt verwacht(Figuur 2Bii). - Gebruik de CD34+ cellen direct of bevries voor verder gebruik.
-
CD34+ cellen bevriezen
OPMERKING: CD34+ cellen bevriezen gebeurt bij een dichtheid van 106 cellen per ml.- Bereid na de bepaling van het CD34+ celgetal de volgende cryopreservatiemedia voor: (1) 60% Stemspan + 40% FBS, (2) 40% Stemspan + 40% FBS + 20% DimethylSulfoxide (DMSO) en laat afkoeling toe bij 4 °C.
- Centrifugeer de CD34+ cellen bij 400 x g bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten en resuspend de pellet in koude oplossing 1 en voeg dan onmiddellijk toe aan de koude oplossing 2 (v/v).
- Plaats de cryobuizen onmiddellijk in een vriezer van -80 °C gedurende 24 uur en breng vervolgens cryobuizen over in de tank met vloeibare stikstof.
2. Kweek en differentiatie van CD34+ cellen om volwassen proplatelet-dragende megakaryocyten te produceren
OPMERKING: Celkweekprotocol (Figuur 3A), representatief schema van de celkweekprocedure worden in deze sectie beschreven.
-
CD34+ cellen ontdooien (indien nodig)
- Bereid de ontdooioplossing voor: 13 ml PBS-20% FBS en plaats deze gedurende 15 minuten op 37 °C. Breng de cryobuizen snel over in een waterbad van 37 °C tot slechts één klein ijskristal. Pipetteer onder de biologische kweekkast de hele inhoud en breng langzaam over in 13 ml voorgewarmde ontdooioplossing.
- Bepaal het celnummer en de levensvatbaarheid van de cel.
-
Cultuurprotocol, stap 1: van dag 0 tot dag 7
OPMERKING: Gewoonlijk worden culturen gemaakt in 24-well platen met 1 ml medium per put met een dichtheid van 40.000 levensvatbare cellen / ml, wat overeenkomt met 20.000 levensvatbare cellen / cm2. Het is cruciaal om deze dichtheid te respecteren als er een opschalings gepland is.- Groeimediumpreparaat : Voeg in serumvrije hematopoëtische celexpansiemedia (eerder verwarmd tot 37 °C) penicilline-streptomycine-glutamine (PSG) 1x, humaan lipoproteïne met lage dichtheid (hLDL) toe bij 20 μg / ml, cytokinecocktail van megakaryocytenexpansie 1x en stemregenine 1 (SR1) bij 1 μM.
- Cell seeding : Centrifugeer de ontdooide CD34+ cellen bij 400 x g bij kamertemperatuur gedurende 5 min. Verwijder het supernatant grondig en resuspend de celkorrel in 1 ml kweekmedia en voer een celnumeratie en levensvatbaarheid uit om het juiste volume te bepalen om de cellen te zaaien.
- Centrifugeer de cellen 400 x g bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten en resuspend de pellet in het juiste volume van het warme groeimedium. Incubeer de cellen bij 37 °C met 5% CO2 gedurende 7 dagen.
-
Cultuurprotocol, stap 2: van dag 7 tot dag 13 (Figuur 3B, representatieve beelden op dag 13)
OPMERKING: Gewoonlijk worden culturen gemaakt in 24-well platen met 1 ml medium per put met een dichtheid van 50.000 levensvatbare cellen / ml, wat overeenkomt met 25.000 levensvatbare cellen / cm². Het is cruciaal om deze dichtheid te respecteren als er een opschalings gepland is.- Rijpingsmediumpreparaat: Voeg in serumvrije hematopoëtische celexpansiemedia (eerder verwarmd tot 37 °C) PSG 1x, hLDL bij 20 μg/ml, TPO bij 50 ng/ml en SR1 bij 1 μM toe.
- Onderzoek de cellen onder de microscoop. Op dag 7 vertonen cellen een rond en homogeen uiterlijk door de putten of de kolven te vullen zonder te confluent te zijn.
- Breng onder een bioveiligheidskast de cellen voorzichtig over in een buis van 15 ml. Was putten met PBS. Bepaal vervolgens het aantal cellen en hun levensvatbaarheid om het juiste volume te berekenen om de cellen te zaaien.
- Centrifugeer de cellen bij 400 x g bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten. Verwijder het supernatant en resuspend de cellen in het juiste volume warme media dat in de vorige stap is berekend. Incubeer de cellen bij 37 °C, 5% CO2 gedurende 6 dagen.
-
Gekweekte bloedplaatjesafgifte op dag 13
- Voeg 0,5 μM prostaglandine I2 (BGA2) en 0,02 U/ml apyrase toe aan de kweek en pipetteren vijf keer met een pipet van 1 ml.
OPMERKING: Bloedplaatjes worden nu vrijgegeven in het medium.
- Voeg 0,5 μM prostaglandine I2 (BGA2) en 0,02 U/ml apyrase toe aan de kweek en pipetteren vijf keer met een pipet van 1 ml.
3. Flowcytometrie-analyse (MK-fenotypering en aantal gekweekte bloedplaatjes)
OPMERKING: Dit protocol kan worden toegepast op de fenotypering van de cellen op de geselecteerde kweekdagen. Het maakt het ook mogelijk om het aantal gekweekte bloedplaatjesafgifte te bepalen (Figuur 4A,B).
-
Voorbereiding op MK-analyse
- Label vier sets microcentrifugebuizen als volgt: Ongelabelde cellen als controle, cellen + 5 μL CD41 - Alexa Fluor 488, Cellen + 5 μL CD34 - PECy7, Cellen + 5 μL CD41 - Alexa Fluor 488 + 5 μL CD34 - PECy7. Gebruik minimaal 1,105 cellen per buis, niet meer dan 1,106 cellen per buis. Voeg toe aan 100 μL celsuspensie per cytometriebuis en de verschillende antilichamen. Incubeer in het donker gedurende 30 minuten bij 4 °C.
- Voeg vervolgens 2 ml PBS-EDTA 2 mM per buis toe en centrifugeer 400 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Bereid tijdens het centrifugeren een oplossing van PBS-EDTA 2 mM + 7-aminoactinomycine-D (7AAD) (1/100), zorg voor 300 μL-oplossing per buis.
- Verwijder het supernatant en neem de pellet op in 300 μL PBS-EDTA 2 mM met 7AAD. Voer monsters binnen 30 minuten door de flowcytometer.
OPMERKING: Analysestrategie voor flowcytometrie wordt weergegeven in figuur 3C en in de discussie.
-
Buisvoorbereiding voor gekweekte bloedplaatjesanalyse
- Label vier sets microcentrifugebuizen als volgt: Ongelabelde cellen als controle, Cellen + 5 μL CD41 - Alexa Fluor 488, Cellen + 20 μL CD42a - PE, Cellen + 5 μL CD41 - Alexa Fluor 488 + 20 μL CD42a - PE. Na vijf opeenvolgende pipetteringen in de kweekput, breng 300 μL van de suspensie in buis over voor cytometrie met een gekalibreerd aantal fluorescerende kralen.
- Voeg antilichamen toe en incubeer in het donker bij RT gedurende 30 minuten.
- Voer de monsters binnen 30 minuten door de flowcytometer en stel de acquisitie in voor de passage van 5.000 kralen.
OPMERKING: Analysestrategie voor flowcytometrie wordt weergegeven in figuur 4B en in de discussie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Extractie en selectie van CD34+ cellen uit LRF's
Hier beschrijft de methode, afgeleid van Peytour et al.9, de extractie en selectie van CD34+ cellen uit afgedankte LRF's die beschikbaar zijn in bloedbanken na verwijdering van leukocyten. Na de backflush-procedure worden gewoonlijk 1,03 x 109 ± 2,45 x10 8 cellen/LRF (Mean±SEM; n = 155) teruggevonden met een levensvatbaarheid van 94,88 ± 0,10% (figuur 2A i). Na de CD34 positieve selectie wordt gemiddeld 615,54 x 103 ± 12,28 cellen/LRF verkregen (n = 155) (Figuur 2A ii). Als het aantal cellen minder dan 300.000 is, moet worden geconcludeerd dat de procedure niet correct is uitgevoerd en moet worden gestopt. Om het succes van de CD34-selectie te evalueren, wordt de zuiverheid van CD34+ cellen beoordeeld door middel van flowcytometrie(figuur 2B). Routinematig wordt een zuiverheid van meer dan 90% (91,88 ± 0,79%) verwacht(figuur 2B). Een zuiverheid van minder dan 75% zou kunnen betekenen dat er een probleem is opgetreden bij het uitvoeren van het protocol en in het bijzonder de elutie van de kolommen. Onder een zuiverheid van 75% worden de cellen niet geconserveerd voor kweekexperimenten.
Figuur 2: CD34+ celnummer/LRF en CD34 zuiverheidsanalyse. (A) (i) Een analyse, per celteller, van het aantal cellen en hun levensvatbaarheid verkregen volgens de procedure, inclusief zowel PBMC-verzameling als CD34-selectie wordt uitgevoerd ((1.03.109 ± 2.45.108 cellen/LRF (gemiddelde ± SEM; n = 155) met een levensvatbaarheid van 94,88 ± 0,10% (n = 155)). (ii) Een analyse, per celteller, wordt ook uitgevoerd na CD34-selectie (615,54 x 103 ± 12,28 cellen /LRF (n = 155)). (B) CD34 Zuiverheid wordt geanalyseerd door flowcytometrie. (i) Cellen werden gekleurd met een CD34-PE-antilichaam en geïdentificeerd op hun FSC / SSC-parameters. (ii) Op basis van het verstrooiingssignaal en de CD34-expressieanalyse wordt de zuiverheid bepaald. Een pre-gate van CD34 positiviteit werd gebruikt op basis van de negatieve controle voor de CD34 marker. (iii) Zoals te zien is in het staafdiagram, wordt een zuiverheid van CD34+ cellen van meer dan 90% (91,88 ± 0,79% (n = 17)) verwacht. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Differentie en rijping van MK-dragende proplatelets
De beschreven celkweekprocedure is verdeeld in twee stappen. De eerste, van dag (D) 0 tot D7, is gewijd aan HP proliferatie en toewijding aan de megakaryocytische route als reactie op een combinatie van cytokines en de toevoeging van een chemische verbinding SR1. De tweede, van D7 tot D13, is gericht op MK-rijping en proplateletuitbreiding na de toevoeging van TPO en SR1 (Figuur 3A). Als kwaliteitscontrole van de kweek worden celtelling, bepaling van de levensvatbaarheid van cellen en fenotypering van cellen geperfodeerd bij D7 en D10. Deze fasen zijn gekozen omdat ze cruciaal zijn voor hp commitment, respectievelijk D7 en MK rijping, D10 (persoonsgegevens). Bij D7 en 10 is de proliferatie routinematig respectievelijk x4,16 ± 0,25 (n = 34) en x2,30 ± 0,16 (n = 5), met een cel levensvatbaarheid tussen 86,38 ± 0,73% (n = 34); en 84,80 ± 2,67% (n = 5) (Figuur 3B). Wat betreft celfenotypering, zoals weergegeven in figuur 3C, bij D0, is meer dan 90% van de cellen positief voor CD34. Vervolgens worden CD34 + -cellen toegewijd aan de megakaryocytische afstamming, zoals blijkt uit de verschijning van CD41, een specifieke en vroege marker van MKP. Inderdaad, bij D7 zijn 50,20 ± 2,90% van de cellen positief voor zowel CD34 als CD41 (Figuur 3Bii). Vervolgens verbetert MK hun rijping. Bij D10 is een meerderheid van MK volwassen, met minder dan 15,60 ± 4,70% van de cellen negatief voor CD41, 47,90 ± 8,90% CD34+CD41+ en 36,40 ± 12,40% CD34-CD41+ (Figuur 3Biii).
Figuur 3: Differentie en rijping van MK-dragende proplatelets. A)Representatief schema van de celkweekprocedure. Er wordt een tweestapsmethode gebruikt: een proliferatiestap van D0 naar D7 (SR1 en cocktail van cytokines) en een rijpingsstap van D7 naar D13 (SR1 en TPO). Bij D13 kunnen gekweekte bloedplaatjes vrijkomen na vijf opeenvolgende pipetters. (B) (i) proliferatiesnelheid bij D7 (x4,16 ± 0,25 (n = 34)) en cel levensvatbaarheid (86,38 ± 0,73% (n = 34)). (ii) Proliferatiesnelheid bij D10 (x2,30 ± 0,16 (n = 5)) en cel levensvatbaarheid (84,80 ± 2,67% (n = 5)). (C) Flowcytometrie analyse stategy van de fenotypische evolutie van MK in cultuur. Bij D0 is 95,80 ± 0,80% van de cellen CD34-positief (n = 3). Bij D7 is 50,20 ± 2,90% van de cellen positief voor CD34 en CD41. Bij D10 zijn minder dan 15,60 ± 4,70% van de cellen negatief voor CD41. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Gekweekte bloedplaatjes laten los, dag 13
Onderzoek van de putten bij D13 toont ronde MK en proplatelet-dragende MK(Figuur 4A). Gemiddeld 35% van de gekweekte MK verlengt proplatelets12. Van belang is dat D13 de optimale dag vertegenwoordigt voor proplatelet-extensie en bloedplaatjesafgifte. Als het vereiste niveau van MK dat proplatelets kan uitzenden niet wordt bereikt, moet er iets mis zijn gegaan tijdens het kweekproces en moeten de resultaten niet in aanmerking worden genomen.
Hoewel de exacte mechanismen die de afgifte van bloedplaatjes door volwassen MK bevorderen nog steeds slecht worden begrepen, is het bekend dat hemodynamische krachten onmisbaar zijn. Om deze krachten in vitrona te bootsen, wordt de suspensie met proplatelet-dragende MK aangezogen en vijf keer afgestoten met een P1000-kegel en vervolgens geanalyseerd door flowcytometrie. Hiervoor worden buizen met een gekalibreerd aantal fluorescerende kralen gebruikt. Ten eerste zijn de kralen die in de buis aanwezig zijn, gated op het CD41-Alexa-fluor 488 / PErcP-Cy5-venster(Figuur 4Bi, in rood). Vervolgens worden gekweekte bloedplaatjes gevisualiseerd in een pre-gate (bloedplaatjesachtige elementen), bepaald op de parameters voorwaartse spreiding (FSC) en zijverstrooiing (SSC) van inheemse bloedplaatjes(figuur 4Bii). Het aantal bloedplaatjes wordt vervolgens bepaald op hun CD41/CD42a positiviteit (Figuur 4Biii). Het tellen van cellen wordt in dit protocol gestopt bij 5.000 kralen, maar afhankelijk van de aanbeveling van de leverancier kan een ander vast getal worden gebruikt. Uit de verkregen gegevens blijkt dat het aantal bloedplaatjes geteld per 5.000 kralen routinematig gemiddeld 24,01 ± 92 (n = 15) bedraagt (figuur 4C). Wetende het volume dat door de flowcytometer wordt aangezogen om 5.000 kralen te tellen (te berekenen voor elke cytometer) en het totale volume van de cultuur, is het mogelijk om een benadering te verkrijgen van het totale aantal gekweekte bloedplaatjes dat vrijkomt.
Figuur 4: Gekweekte bloedplaatjes geven vrij op dag 13. (A) Representatief lichtmicroscopiebeeld van MK-emitterende proplatelets bij D13. B) Strategie voor het kwantificeren van de afgifte van gekweekte bloedplaatjes. (i) Kralen zijn gated op het CD41-Alexa-fluor 488 / PErcP-Cy5 venster (in rood). (ii) Bloedplaatjesachtige elementen worden gevisualiseerd in een poort die wordt bepaald op de FSC/SSC-parameters van inheemse bloedplaatjes (grijze stippen). (iii) Gekweekte bloedplaatjes worden bepaald op hun CD41/CD42 positiviteit (paars). (C) Aantal bloedplaatjes geteld per 5.000 kralen kan worden verkregen, routinematig een gemiddelde van 24.011 ± 919 (n = 15). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
De procedure in één oogopslag
Om de methode beter samen te vatten en elke stap te begrijpen, wordt een poster gepresenteerd die het protocol stap voor stap samenvat in Figuur 5. Dit overzichtsblad kan in de cultuurkamer worden weergegeven en dient als memo. Van belang is dat het succes van de experimenten alleen wordt gegarandeerd met de productreferenties die in de verstrekte tabel zijn aangegeven.
Figuur 5: Isolatie van CD34+. Poster die het protocol stap voor stap samenvat. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit protocol beschrijft een methode voor het produceren van MK die in staat is om proplatelets uit bloedafname HP uit te zenden en bloedplaatjes uit het kweekmedium vrij te geven. HP worden verkregen uit LRF, een bijproduct van de bloedbanken, gebruikt om besmettelijk leukocyten uit cellulaire bloedproducten te verwijderen en bijwerkingen te voorkomen. Hoewel deze methode relatief eenvoudig is, verdienen een paar punten speciale aandacht.
De afzetting van de celsuspensie op het medium met dichtheidsgradiënt (stap 1.3.1) moet voorzichtig worden uitgevoerd om vermenging (rood gehalte) te voorkomen. Als deze stap niet zorgvuldig wordt uitgevoerd, moet het protocol op dit punt stoppen. Evenzo moet ook in stap 1.3.1 de rem in de uit-modus staan om te voorkomen dat de fracties worden gemengd. Als dit niet het jaar het is, moet de HP-selectie worden opgeschort. Zoals aangegeven in het protocol, paragraaf 1.4, kan de procedure worden onderbroken na de PBMC-verzameling. In dit geval kunnen cellen 's nachts onder roeren bij 4 °C worden gehouden. Gebruik vervolgens een celzeef van 40 μm om de gevormde aggregaten te verwijderen, wat van invloed kan zijn op de daaropvolgende CD34-selectie. Van belang is dat het onderbreken van de procedure geen invloed heeft op de opbrengst en zuiverheid van CD34+ -cellen. Aan het einde van de CD34-selectie moet de zuiverheid groter zijn dan 75% om de cellen te zaaien, omdat in een eerdere studie de differentiatie en rijping van MK slecht waren onder deze zuiverheid12 (figuur 2).
Speciale aandacht moet worden besteed aan het ontdooien van de CD34+ -cellen, die snel moeten worden uitgevoerd om te voorkomen dat de levensvatbaarheid van de cellen wordt aangetast. Bovendien moeten wasstappen zorgvuldig worden uitgevoerd om geen spoor van serum achter te laten. De celzaaidichtheid moet worden gerespecteerd, omdat deze rigoureus is gekozen voor een optimale CD34-inzet voor de MKP-route en MK-rijping(figuur 3A).
Een celfenotyperingsprotocol wordt voorgesteld om de differentiatie en rijping van MK te volgen. Dit protocol is relatief eenvoudig, maar het is belangrijk om alle controlebuizen, zowel ongelabelde als enkele etiketteringsbuizen, beschikbaar te hebben voor elke dag van analyse om betrouwbare instellingen op de cytometer te garanderen. Om ervoor te zorgen dat de cultuur soepel verloopt, is het belangrijk om informatie over proliferatie tijdens de procedure te verzamelen. Bij D7 ligt de gemiddelde proliferatie tussen de 2 en 4 keer13. Deze proliferatie varieert weinig tussen experimenten, omdat elke LRF cellen van 8 donoren bevat. Om de variaties verder glad te strijken, is het mogelijk om cellen te combineren die parallel zijn verkregen van 4 tot 8 LRV's.
Het is mogelijk om naar de morfologie van de cellen te kijken door middel van lichtmicroscopie, maar de cellen moeten niet elke dag worden geobserveerd omdat ze gevoelig zijn voor temperatuurschommelingen. Zorg er bij het verwijderen van de cellen uit de couveuse voor dat u langzame bewegingen maakt om te voorkomen dat de voorplaatjes breken.
Wat de bloedplaatjesafgifte betreft, is vijf keer opeenvolgend pipetteren vereist. Minder doen zorgt niet voor een optimale afgifte van bloedplaatjes en meer doen is schadelijk voor hun functionaliteit12. Het belangrijkste aspect in deze stap is om nauwkeurige en regelmatige bewegingen te gebruiken, om een regelmatige stroom te genereren die nodig is voor de bloedplaatjesafgifte14,15,16. De methode van vijf opeenvolgende pipetteren is daarom eenvoudig en gemakkelijk uit te voeren met bevredigende prestatieresultaten op basis van de in de literatuur beschreven opbrengsten. Het aantal vrijgekomen bloedplaatjes kan worden bepaald zoals vermeld in punt 3.3 met behulp van de strategie van flowcytometrie-analyse in figuur 4B. De kwaliteit van de vrijgekomen bloedplaatjes is goed gedocumenteerd in Do Sacramento et al. in termen van ultrastructuur (morfologie, grootte, korrelgehalte) en functie (hemostase), wat aantoont dat deze gekweekte bloedplaatjes sterk lijken op de inheemse13.
Het hier beschreven protocol is bijzonder geschikt voor culturen met een klein volume, maar is niet van toepassing op grootschalige cultuur. Het is daarom een optimale methode voor de studie van bloedplaatjesbiogenese om de moleculaire en cellulaire mechanismen die de bloedplaatjesproductie regelen beter te begrijpen door bijvoorbeeld kleine moleculen, agonisten of antagonisten toe te voegen. Bovendien, en om de mechanismen die MK-toewijding, MK-rijping en bloedplaatjesproductie reguleren verder te onderzoeken, is het nu mogelijk om de CD34+ HP genetisch te manipuleren met behulp van een CRISPR-Cas9-genoombewerkingsmethode.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk is ondersteund door ANR (Agence National de la Recherche) Grant ANR- 17-CE14-0001-1.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 7-AAD | Biolegend | 558819 | |
| ACD | EFS-Alsace | NA | |
| Anti-CD34-PE | Miltenyi biotec | 130-081-002 | |
| Anti-CD34-PECy7 | eBioscience | 25-0349-42 | |
| Anti-CD41-Alexa Fluor 488 | Biolegend | 303724 | |
| Anti-CD42a-PE | BD Bioscience | 559919 | |
| Apyrase | EFS-Alsace | NA | |
| BD Trucount Tubes | BD Bioscience | 340334 | |
| CD34 MicroBead Kit UltraPure, human | Miltenyi biotec | 130-100-453 | |
| Centrifuge | Heraeus | Megafuge 1.OR | Or equivalent material |
| Compteur ADAM | DiagitalBio | NA | Or equivalent material |
| Cryotubes | Dutscher | 55002 | Or equivalent material |
| Dextran from leuconostoc spp | Sigma | 31392-50g | Or equivalent material |
| DMSO Hybri-max | Sigma | D2650 | |
| EDTA 0.5 M | Gibco | 15575-039 | |
| Eppendorf 1,5 mL | Dutscher | 616201 | Or equivalent material |
| Filtration unit Steriflip PVDF | Merck Millipore Ltd | SE1M179M6 | |
| Flow Cytometer | BD Bioscience | Fortessa | |
| Human LDL | Stemcell technologies | #02698 | |
| ILOMEDINE 0,1 mg/1 mL | Bayer | MA038EX | |
| Inserts | Fenwal | R4R1401 | Or equivalent material |
| Laminar flow hood | Holten | NA | Archived product |
| LS Columms | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| Lymphoprep | Stemcell | 7861 | |
| Pen Strep Glutamine (100x) | Gibco | 10378-016 | |
| PBS (-) | Life Technologies | 14190-169 | Or equivalent material |
| PGi2 | Sigma | P6188 | |
| Poches de transferts 600ml | Macopharma | VSE4001XA | |
| Pre-Separation Filters (30µm) | Miltenyi Biotec | 130-041-407 | |
| StemRegenin 1 (SR1) | Stemcell technologies | #72344 | |
| StemSpan Expansion Supplement (100x) | Stemcell technologies | #02696 | |
| StemSpan-SFEM | Stemcell technologies | #09650 | |
| Stericup Durapore 0,22µm PVDF | Merck Millipore Ltd | SCGVU05RE | |
| SVF Hyclone | Thermos scientific | SH3007103 | |
| Syringues 30 mL | Terumo | SS*30ESE1 | Or equivalent material |
| Syringe filters Millex 0,22µM PVDF | Merck Millipore Ltd | SLGV033RB | |
| TPO | Stemcell technologies | #02822 | |
| Tubes 50 mL | Sarstedt | 62.548.004 PP | Or equivalent material |
| Tubes 15 mL | Sarstedt | 62.554.001 PP | Or equivalent material |
| Tubulures | B Braun | 4055137 | Or equivalent material |
References
- Deutsch, V. R., Tomer, A. Megakaryocyte development and platelet production. British Journal of Haematology. 134 (5), 453-466 (2006).
- Lefrancais, E., et al. The lung is a site of platelet biogenesis and a reservoir for haematopoietic progenitors. Nature. 544 (7648), 105-109 (2017).
- de Sauvage, F. J., et al. Stimulation of megakaryocytopoiesis and thrombopoiesis by the c-Mpl ligand. Nature. 369 (6481), 533-538 (1994).
- Almomani, M. H., Mangla, A. StatPearls. , (2020).
- Strassel, C., Hechler, B., Bull, A., Gachet, C., Lanza, F. Studies of mice lacking the GPIb-V-IX complex question the role of this receptor in atherosclerosis. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 7 (11), 1935-1938 (2009).
- Delalat, B., et al. Isolation and ex vivo expansion of human umbilical cord blood-derived CD34+ stem cells and their cotransplantation with or without mesenchymal stem cells. Hematology. 14 (3), 125-132 (2009).
- Yin, T., Li, L. The stem cell niches in bone. The Journal of Clinical Investigation. 116 (5), 1195-1201 (2006).
- Salunkhe, V., Papadopoulos, P., Gutiérrez, L. Culture of megakaryocytes from human peripheral blood mononuclear cells. Bio-protocol. 5 (21), 1639 (2015).
- Peytour, Y., Villacreces, A., Chevaleyre, J., Ivanovic, Z., Praloran, V. Discarded leukoreduction filters: a new source of stem cells for research, cell engineering and therapy. Stem Cell Research. 11 (2), 736-742 (2013).
- Lapostolle, V., et al. Repopulating hematopoietic stem cells from steady-state blood before and after ex vivo culture are enriched in the CD34(+)CD133(+)CXCR4(low) fraction. Haematologica. 103 (10), 1604-1615 (2018).
- Ivanovic, Z., et al. Whole-blood leuko-depletion filters as a source of CD 34+ progenitors potentially usable in cell therapy. Transfusion. 46 (1), 118-125 (2006).
- Strassel, C., et al. Aryl hydrocarbon receptor-dependent enrichment of a megakaryocytic precursor with a high potential to produce proplatelets. Blood. 127 (18), 2231-2240 (2016).
- Do Sacramento, V., et al. Functional properties of human platelets derived in vitro from CD34(+) cells. Scientific Reports. 10 (1), 914 (2020).
- Blin, A., et al. Microfluidic model of the platelet-generating organ: beyond bone marrow biomimetics. Scientific Reports. 6, 21700 (2016).
- Ito, Y., et al. Turbulence activates platelet biogenesis to enable clinical scale ex vivo production. Cell. 174 (3), 636-648 (2018).
- Pallotta, I., Lovett, M., Kaplan, D. L., Balduini, A. Three-dimensional system for the in vitro study of megakaryocytes and functional platelet production using silk-based vascular tubes. Tissue Engineering. Part C, Methods. 17 (12), 1223-1232 (2011).
