Leukodepletion Filtre-Avledede CD34+ celler som en cellekilde for å studere Megakaryocyte differensiering og blodplatedannelse
Summary
Denne protokollen beskriver i detalj alle trinnene som er involvert i å skaffe leukofilter-avledede CD34+ hematopoietiske forfedre og deres in vitro differensiering og modning i proplateletbærende megakaryocytter som er i stand til å frigjøre blodplater i kulturmediet. Denne prosedyren er nyttig for grundig analyse av cellulære og molekylære mekanismer som kontrollerer megakaryopoiesis.
Abstract
In vitro-utvidelsen og differensiering av menneskelige hematopoietiske forfedre til megakaryocytter som er i stand til å forlenge proplater og frigjøre blodplater, tillater en grundig studie av mekanismene som ligger til grunn for blodplatebiogenese. Tilgjengelige kulturprotokoller er for det meste basert på hematopoietiske forfedre avledet fra benmarg eller ledningsblod som reiser en rekke etiske, tekniske og økonomiske bekymringer. Hvis det allerede finnes tilgjengelige protokoller for å skaffe CD34-celler fra perifert blod, foreslår dette manuskriptet en enkel og optimalisert protokoll for å skaffe CD34+ celler fra leukodepletion-filtre som er lett tilgjengelige i blodsentre. Disse cellene er isolert fra leukodepletion filtre som brukes i utarbeidelsen av blodoverføringsprodukter, tilsvarende åtte bloddonasjoner. Disse filtrene er ment å bli forkastet. En detaljert prosedyre for å samle hematopoietiske forfedre identifisert som CD34 + celler fra disse filtrene er beskrevet. Metoden for å oppnå modne megakaryocytter som utvider proplater mens de diskuterer deres fenotypiske evolusjon, er også detaljert. Til slutt presenterer protokollen en kalibrert pipetteringsmetode, for effektivt å frigjøre blodplater som er morfologiske og funksjonelt lik innfødte. Denne protokollen kan tjene som grunnlag for å evaluere farmakologiske forbindelser som virker på ulike trinn i prosessen for å dissekere de underliggende mekanismene og nærme seg in vivo-blodplater.
Introduction
Blodplater kommer fra spesialiserte store polyploide celler, megakaryocyttene (MK), som stammer fra en konstant og finjustert produksjonsprosess kjent som megakaryopoiesis (MKP). På toppen av denne prosessen er hematopoietiske stamceller som i kontakt med benmargsmiljøet (cytokiner, transkripsjonsfaktorer, hematopoietisk nisje), vil kunne spre seg og skille seg ut i hematopoietiske forfedre (HP) som er i stand til å forplikte seg mot megakaryocytisk vei, noe som gir opphav til umodne MKs1. Under påvirkning av ulike cytokiner, og spesielt trombopoetin (TPO), som er den store cytokin av MKP; MK vil da gjennomgå to store stadier av modning: endomitose og utvikling av avgrensningsmembraner (DMS). Denne fullt modne MK vises deretter nær et bihuleformet kar der det kan avgi cytoplasmatiske utvidelser, proplatelene, som frigjøres under blodstrømmen og deretter omdannet til funksjonelle blodplater2. Kloningen av TPO i 19943 ga et løft i studiet av MKP ved å akselerere utviklingen av in vitro-kulturteknikker som tillater HP-differensiering og MK-modning.
Det er mange patologier som påvirker blodplater, både når det gjelder blodplatenummer (økning eller reduksjon) og funksjon4,5. Å kunne rekapitulere MKP in vitro fra menneskelig HP kan forbedre forståelsen av de molekylære og cellulære mekanismene som ligger til grunn for denne prosessen og til slutt den terapeutiske behandlingen av pasienter.
Ulike kilder til menneskelig HP er egnet: ledningsblod, benmarg og perifert blod6,7,8. Høsting av HP fra perifert blod reiser mindre logistiske og etiske problemer enn deres utvinning fra ledningsblod eller benmargen. HP kan gjenvinnes fra leukaferese eller buffy coat, men disse kildene er dyre og ikke alltid tilgjengelige i blodsentre. Andre protokoller, billigere og enklere å utføre, tillater direkte gjenoppretting av humane perifere mononukleære celler i blodet (PBMCer) uten behov for tidligere CD34-drevet isolasjon4,8. Renheten til megakaryocytter er imidlertid ikke tilfredsstillende med denne metoden, og et utvalg av CD34+ celler fra PBMC anbefales for optimal differensiering i MK. Dette førte oss til å implementere en HP-rensing fra leukoreduksjonsfiltre (LRF), rutinemessig brukt i blodbanker for å fjerne hvite blodlegemer og dermed unngå negative immunologiske reaksjoner9. Faktisk, siden 1998, har blodplatekonsentrater blitt automatisk leukodepleted i Frankrike. På slutten av denne prosessen kastes LRF og alle cellene som beholdes i LRF blir ødelagt. Celler i LRFer er derfor lett tilgjengelige uten ekstra kostnad. LRFer har et cellulært innhold i nærheten av det som oppnås ved leukaferese eller i buffy strøk, spesielt i deres sammensetning av CD34 + HP, noe som gjør dem til en bemerkelsesverdig attraktiv kilde10. LRF som en menneskelig HP-kilde er allerede demonstrert for å gi celler intakt funksjonell kapasitet11. Denne kilden har fordelen av å være rikelig og rimelig for laboratorieforskning. I denne sammenhengen beskriver denne artikkelen suksessivt: i) utvinning og valg av CD34+ HP fra LRFer; ii) en tofaset optimalisert kultur, som rekapitulerer forpliktelsen til HP inn i megakaryocytisk vei og modningen av MK som er i stand til å avgi proplatelets; iii) en metode for effektivt å frigjøre blodplater fra disse MK; og iv) en prosedyre for fenotyping av MK og dyrkede blodplater.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne protokollen beskriver en metode for å produsere MK som er i stand til å sende ut proplater fra blodavledet HP og frigjøre blodplater fra kulturmediet. HP er hentet fra LRF, et biprodukt av blodbankene, som brukes til å fjerne forurensende leukocytter fra cellulære blodprodukter og unngå bivirkninger. Selv om denne metoden er relativt enkel, fortjener noen få punkter spesiell oppmerksomhet.
Avsetning av cellefjæringen på tetthetsgradientmediet (trinn 1.3.1) må utføres forsiktig…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet har blitt støttet av ANR (Agence National de la Recherche) Grant ANR- 17-CE14-0001-1.
Materials
| 7-AAD | Biolegend | 558819 | |
| ACD | EFS-Alsace | NA | |
| Anti-CD34-PE | Miltenyi biotec | 130-081-002 | |
| Anti-CD34-PECy7 | eBioscience | 25-0349-42 | |
| Anti-CD41-Alexa Fluor 488 | Biolegend | 303724 | |
| Anti-CD42a-PE | BD Bioscience | 559919 | |
| Apyrase | EFS-Alsace | NA | |
| BD Trucount Tubes | BD Bioscience | 340334 | |
| CD34 MicroBead Kit UltraPure, human | Miltenyi biotec | 130-100-453 | |
| Centrifuge | Heraeus | Megafuge 1.OR | Or equivalent material |
| Compteur ADAM | DiagitalBio | NA | Or equivalent material |
| Cryotubes | Dutscher | 55002 | Or equivalent material |
| Dextran from leuconostoc spp | Sigma | 31392-50g | Or equivalent material |
| DMSO Hybri-max | Sigma | D2650 | |
| EDTA 0.5 M | Gibco | 15575-039 | |
| Eppendorf 1,5 mL | Dutscher | 616201 | Or equivalent material |
| Filtration unit Steriflip PVDF | Merck Millipore Ltd | SE1M179M6 | |
| Flow Cytometer | BD Bioscience | Fortessa | |
| Human LDL | Stemcell technologies | #02698 | |
| ILOMEDINE 0,1 mg/1 mL | Bayer | MA038EX | |
| Inserts | Fenwal | R4R1401 | Or equivalent material |
| Laminar flow hood | Holten | NA | Archived product |
| LS Columms | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| Lymphoprep | Stemcell | 7861 | |
| Pen Strep Glutamine (100x) | Gibco | 10378-016 | |
| PBS (-) | Life Technologies | 14190-169 | Or equivalent material |
| PGi2 | Sigma | P6188 | |
| Poches de transferts 600ml | Macopharma | VSE4001XA | |
| Pre-Separation Filters (30µm) | Miltenyi Biotec | 130-041-407 | |
| StemRegenin 1 (SR1) | Stemcell technologies | #72344 | |
| StemSpan Expansion Supplement (100x) | Stemcell technologies | #02696 | |
| StemSpan-SFEM | Stemcell technologies | #09650 | |
| Stericup Durapore 0,22µm PVDF | Merck Millipore Ltd | SCGVU05RE | |
| SVF Hyclone | Thermos scientific | SH3007103 | |
| Syringues 30 mL | Terumo | SS*30ESE1 | Or equivalent material |
| Syringe filters Millex 0,22µM PVDF | Merck Millipore Ltd | SLGV033RB | |
| TPO | Stemcell technologies | #02822 | |
| Tubes 50 mL | Sarstedt | 62.548.004 PP | Or equivalent material |
| Tubes 15 mL | Sarstedt | 62.554.001 PP | Or equivalent material |
| Tubulures | B Braun | 4055137 | Or equivalent material |
References
- Deutsch, V. R., Tomer, A. Megakaryocyte development and platelet production. British Journal of Haematology. 134 (5), 453-466 (2006).
- Lefrancais, E., et al. The lung is a site of platelet biogenesis and a reservoir for haematopoietic progenitors. Nature. 544 (7648), 105-109 (2017).
- de Sauvage, F. J., et al. Stimulation of megakaryocytopoiesis and thrombopoiesis by the c-Mpl ligand. Nature. 369 (6481), 533-538 (1994).
- Almomani, M. H., Mangla, A. . StatPearls. , (2020).
- Strassel, C., Hechler, B., Bull, A., Gachet, C., Lanza, F. Studies of mice lacking the GPIb-V-IX complex question the role of this receptor in atherosclerosis. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 7 (11), 1935-1938 (2009).
- Delalat, B., et al. Isolation and ex vivo expansion of human umbilical cord blood-derived CD34+ stem cells and their cotransplantation with or without mesenchymal stem cells. Hematology. 14 (3), 125-132 (2009).
- Yin, T., Li, L. The stem cell niches in bone. The Journal of Clinical Investigation. 116 (5), 1195-1201 (2006).
- Salunkhe, V., Papadopoulos, P., Gutiérrez, L. Culture of megakaryocytes from human peripheral blood mononuclear cells. Bio-protocol. 5 (21), 1639 (2015).
- Peytour, Y., Villacreces, A., Chevaleyre, J., Ivanovic, Z., Praloran, V. Discarded leukoreduction filters: a new source of stem cells for research, cell engineering and therapy. Stem Cell Research. 11 (2), 736-742 (2013).
- Lapostolle, V., et al. Repopulating hematopoietic stem cells from steady-state blood before and after ex vivo culture are enriched in the CD34(+)CD133(+)CXCR4(low) fraction. Haematologica. 103 (10), 1604-1615 (2018).
- Ivanovic, Z., et al. Whole-blood leuko-depletion filters as a source of CD 34+ progenitors potentially usable in cell therapy. Transfusion. 46 (1), 118-125 (2006).
- Strassel, C., et al. Aryl hydrocarbon receptor-dependent enrichment of a megakaryocytic precursor with a high potential to produce proplatelets. Blood. 127 (18), 2231-2240 (2016).
- Do Sacramento, V., et al. Functional properties of human platelets derived in vitro from CD34(+) cells. Scientific Reports. 10 (1), 914 (2020).
- Blin, A., et al. Microfluidic model of the platelet-generating organ: beyond bone marrow biomimetics. Scientific Reports. 6, 21700 (2016).
- Ito, Y., et al. Turbulence activates platelet biogenesis to enable clinical scale ex vivo production. Cell. 174 (3), 636-648 (2018).
- Pallotta, I., Lovett, M., Kaplan, D. L., Balduini, A. Three-dimensional system for the in vitro study of megakaryocytes and functional platelet production using silk-based vascular tubes. Tissue Engineering. Part C, Methods. 17 (12), 1223-1232 (2011).
