Leukodepletion Filtre-afledte CD34 + celler som en celle kilde til at studere Megakaryocyte differentiering og blodplade dannelse
Summary
Denne protokol beskriver i detaljer alle de trin, der er involveret i at opnå leukofilter-afledte CD34 + hæmatopoietic forfædre og deres in vitro differentiering og modning i proplatelet-bærende megakaryocytter, der er i stand til at frigive blodplader i kulturmediet. Denne procedure er nyttig til dybdegående analyse af cellulære og molekylære mekanismer, der styrer megakaryopoiesis.
Abstract
In vitro ekspansion og differentiering af menneskelige hæmatoopoietic forfædre i megakaryocytter i stand til at aflange proplatelets og frigive blodplader giver mulighed for en dybdegående undersøgelse af de mekanismer, der ligger til grund for blodplade biogenese. Tilgængelige kulturprotokoller er for det meste baseret på hæmatoopoietic forfædre stammer fra knoglemarv eller navlestrengsblod rejser en række etiske, tekniske og økonomiske bekymringer. Hvis der allerede er tilgængelige protokoller for at opnå CD34-celler fra perifert blod, foreslår dette manuskript en enkel og optimeret protokol til at opnå CD34 + celler fra leukodepletion filtre let tilgængelige i blodcentre. Disse celler er isoleret fra leukodepletion filtre, der anvendes til fremstilling af blodtransfusion produkter, svarende til otte bloddonationer. Disse filtre er beregnet til at blive kasseret. En detaljeret procedure for indsamling af hæmatoopoietic forfædre identificeret som CD34 + celler fra disse filtre er beskrevet. Metoden til at opnå modne megakaryocytter udvide proplatelets samtidig diskutere deres fænotypiske evolution er også detaljeret. Endelig præsenterer protokollen en kalibreret pipetteringsmetode for effektivt at frigive blodplader, der er morfologisk og funktionelt ligner indfødte. Denne protokol kan tjene som grundlag for evaluering af farmakologiske forbindelser, der virker på forskellige trin i processen for at dissekere de underliggende mekanismer og nærme sig in vivo-blodpladeudbyttet.
Introduction
Blodplader kommer fra specialiserede store polyploidceller, megakaryocytterne (MK), der stammer fra en konstant og finjusteret produktionsproces kendt som megakaryopoiesis (MKP). På toppen af denne proces er hæmatoopoietic stamceller, som i kontakt med knoglemarvsmiljøet (cytokiner, transskription faktorer, hæmatopoietic niche), vil være i stand til at formere sig og differentiere sig til hæmatopoietic forfædre (HP) i stand til at forpligte sig mod megakaryocytisk vej, hvilket giver anledning til umodne MKs1. Under indflydelse af forskellige cytokiner, og især thrombopoietin (TPO), som er den største cytokin af MKP; MK vil derefter gennemgå to store stadier af modning: endomitose og udvikling af afgrænsningsmembraner (DMS). Denne fuldt modne MK vises derefter tæt på et sinusoidt fartøj, hvor det kan udsende cytoplasmaiske udvidelser, proplatelets, som vil blive frigivet under blodgennemstrømningen og efterfølgende ombygget til funktionelle blodplader2. Kloning af TPO i 19943 gav et løft i undersøgelsen af MKP ved at fremskynde udviklingen af in vitro kultur teknikker, der tillader HP differentiering og MK modning.
Der er mange patologier, der påvirker blodplader, både med hensyn til blodpladenummer (stigning eller fald) og funktion4,5. At være i stand til at generobre MKP in vitro fra human HP kunne forbedre forståelsen af de molekylære og cellulære mekanismer, der ligger til grund for denne proces og i sidste ende den terapeutiske behandling af patienter.
Forskellige kilder til human HP er egnede: navlestrengsblod, knoglemarv og perifert blod6,7,8. Høst af HP fra perifert blod giver færre logistiske og etiske problemer end deres genfinding fra navlestrengsblod eller knoglemarven. HP kan genvindes fra leukaferese eller buffy frakke, men disse kilder er dyre og ikke altid tilgængelige i blodcentre. Andre protokoller, billigere og lettere at udføre, tillader direkte inddrivelse af humane perifere blod mononukleare celler (PBMCs) uden behov for forudgående CD34 drevet isolation4,8. Renheden af megakaryocytter er dog ikke tilfredsstillende med denne metode, og et udvalg af CD34+ celler fra PBMC anbefales til optimal differentiering i MK. Dette førte os til at gennemføre en HP rensning fra leukoreduction filtre (LRF), rutinemæssigt anvendes i blodbanker til at fjerne hvide blodlegemer og dermed undgå bivirkninger immunologiske reaktioner9. Siden 1998 er blodpladekoncentrater blevet automatisk leukodepleted i Frankrig. Ved afslutningen af denne proces kasseres LRF, og alle de celler, der opbevares i LRF, ødelægges. Celler i LRF’er er derfor let tilgængelige uden ekstra omkostninger. LRFs har et cellulært indhold tæt på det, der opnås ved leukferferese eller i buffy frakker, især i deres sammensætning af CD34 + HP gør dem til en bemærkelsesværdig attraktiv kilde10. LRF som en menneskelig HP-kilde har allerede vist sig at give celler intakt funktionel kapacitet11. Denne kilde har den fordel, at den er rigelig og overkommelig for laboratorieforskning. I denne sammenhæng beskrives successivt: i) udvinding og udvælgelse af CD34+ HP fra LRF’er; ii) en tofaset optimeret kultur, som generobrer HP’s engagement i den megakarycytiske vej og modningen af MK, der er i stand til at udsende proplatelets iii) en metode til effektiv frigivelse af blodplader fra disse MK; og iv) en procedure for phenotyping MK og kultiverede blodplader.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne protokol beskriver en metode til fremstilling af MK, der er i stand til at udsende proplatelets fra blodafledt HP og til at frigive blodplader fra kulturmediet. HP er fremstillet af LRF, et biprodukt af blodbankerne, der anvendes til at fjerne forurenende leukocytter fra cellulære blodprodukter og undgå bivirkninger. Selv om denne metode er relativt enkel, fortjener et par punkter særlig opmærksomhed.
Aflejring af celleaffjedringen på tæthedensgradientmediet (trin 1.3.1) skal udfø…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde er blevet støttet af ANR (Agence National de la Recherche) Grant ANR- 17-CE14-0001-1.
Materials
| 7-AAD | Biolegend | 558819 | |
| ACD | EFS-Alsace | NA | |
| Anti-CD34-PE | Miltenyi biotec | 130-081-002 | |
| Anti-CD34-PECy7 | eBioscience | 25-0349-42 | |
| Anti-CD41-Alexa Fluor 488 | Biolegend | 303724 | |
| Anti-CD42a-PE | BD Bioscience | 559919 | |
| Apyrase | EFS-Alsace | NA | |
| BD Trucount Tubes | BD Bioscience | 340334 | |
| CD34 MicroBead Kit UltraPure, human | Miltenyi biotec | 130-100-453 | |
| Centrifuge | Heraeus | Megafuge 1.OR | Or equivalent material |
| Compteur ADAM | DiagitalBio | NA | Or equivalent material |
| Cryotubes | Dutscher | 55002 | Or equivalent material |
| Dextran from leuconostoc spp | Sigma | 31392-50g | Or equivalent material |
| DMSO Hybri-max | Sigma | D2650 | |
| EDTA 0.5 M | Gibco | 15575-039 | |
| Eppendorf 1,5 mL | Dutscher | 616201 | Or equivalent material |
| Filtration unit Steriflip PVDF | Merck Millipore Ltd | SE1M179M6 | |
| Flow Cytometer | BD Bioscience | Fortessa | |
| Human LDL | Stemcell technologies | #02698 | |
| ILOMEDINE 0,1 mg/1 mL | Bayer | MA038EX | |
| Inserts | Fenwal | R4R1401 | Or equivalent material |
| Laminar flow hood | Holten | NA | Archived product |
| LS Columms | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| Lymphoprep | Stemcell | 7861 | |
| Pen Strep Glutamine (100x) | Gibco | 10378-016 | |
| PBS (-) | Life Technologies | 14190-169 | Or equivalent material |
| PGi2 | Sigma | P6188 | |
| Poches de transferts 600ml | Macopharma | VSE4001XA | |
| Pre-Separation Filters (30µm) | Miltenyi Biotec | 130-041-407 | |
| StemRegenin 1 (SR1) | Stemcell technologies | #72344 | |
| StemSpan Expansion Supplement (100x) | Stemcell technologies | #02696 | |
| StemSpan-SFEM | Stemcell technologies | #09650 | |
| Stericup Durapore 0,22µm PVDF | Merck Millipore Ltd | SCGVU05RE | |
| SVF Hyclone | Thermos scientific | SH3007103 | |
| Syringues 30 mL | Terumo | SS*30ESE1 | Or equivalent material |
| Syringe filters Millex 0,22µM PVDF | Merck Millipore Ltd | SLGV033RB | |
| TPO | Stemcell technologies | #02822 | |
| Tubes 50 mL | Sarstedt | 62.548.004 PP | Or equivalent material |
| Tubes 15 mL | Sarstedt | 62.554.001 PP | Or equivalent material |
| Tubulures | B Braun | 4055137 | Or equivalent material |
References
- Deutsch, V. R., Tomer, A. Megakaryocyte development and platelet production. British Journal of Haematology. 134 (5), 453-466 (2006).
- Lefrancais, E., et al. The lung is a site of platelet biogenesis and a reservoir for haematopoietic progenitors. Nature. 544 (7648), 105-109 (2017).
- de Sauvage, F. J., et al. Stimulation of megakaryocytopoiesis and thrombopoiesis by the c-Mpl ligand. Nature. 369 (6481), 533-538 (1994).
- Almomani, M. H., Mangla, A. . StatPearls. , (2020).
- Strassel, C., Hechler, B., Bull, A., Gachet, C., Lanza, F. Studies of mice lacking the GPIb-V-IX complex question the role of this receptor in atherosclerosis. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 7 (11), 1935-1938 (2009).
- Delalat, B., et al. Isolation and ex vivo expansion of human umbilical cord blood-derived CD34+ stem cells and their cotransplantation with or without mesenchymal stem cells. Hematology. 14 (3), 125-132 (2009).
- Yin, T., Li, L. The stem cell niches in bone. The Journal of Clinical Investigation. 116 (5), 1195-1201 (2006).
- Salunkhe, V., Papadopoulos, P., Gutiérrez, L. Culture of megakaryocytes from human peripheral blood mononuclear cells. Bio-protocol. 5 (21), 1639 (2015).
- Peytour, Y., Villacreces, A., Chevaleyre, J., Ivanovic, Z., Praloran, V. Discarded leukoreduction filters: a new source of stem cells for research, cell engineering and therapy. Stem Cell Research. 11 (2), 736-742 (2013).
- Lapostolle, V., et al. Repopulating hematopoietic stem cells from steady-state blood before and after ex vivo culture are enriched in the CD34(+)CD133(+)CXCR4(low) fraction. Haematologica. 103 (10), 1604-1615 (2018).
- Ivanovic, Z., et al. Whole-blood leuko-depletion filters as a source of CD 34+ progenitors potentially usable in cell therapy. Transfusion. 46 (1), 118-125 (2006).
- Strassel, C., et al. Aryl hydrocarbon receptor-dependent enrichment of a megakaryocytic precursor with a high potential to produce proplatelets. Blood. 127 (18), 2231-2240 (2016).
- Do Sacramento, V., et al. Functional properties of human platelets derived in vitro from CD34(+) cells. Scientific Reports. 10 (1), 914 (2020).
- Blin, A., et al. Microfluidic model of the platelet-generating organ: beyond bone marrow biomimetics. Scientific Reports. 6, 21700 (2016).
- Ito, Y., et al. Turbulence activates platelet biogenesis to enable clinical scale ex vivo production. Cell. 174 (3), 636-648 (2018).
- Pallotta, I., Lovett, M., Kaplan, D. L., Balduini, A. Three-dimensional system for the in vitro study of megakaryocytes and functional platelet production using silk-based vascular tubes. Tissue Engineering. Part C, Methods. 17 (12), 1223-1232 (2011).
