ניתוח נפח בלוטות הלימפה על ידי הדמיית אולטרסאונד בתדר גבוה במיוחד במודל העכבר המהונדס גנטית Braf /Pten של מלנומה
Summary
מלנומה היא מחלה אגרסיבית מאוד שמתפשטת במהירות לאיברים אחרים. פרוטוקול זה מתאר את היישום של הדמיית אולטרסאונד בתדר גבוה במיוחד, יחד עם עיבוד 3D, כדי לפקח על הנפח של בלוטות הלימפה מפשעתיות במודל העכבר Braf / Pten של מלנומה גרורתית.
Abstract
Tyr::CreER+, BrafCA/+,Ptenlox/lox עכברים מהונדסים גנטית (עכברי Braf/Pten) נמצאים בשימוש נרחב כמודל in vivo של מלנומה גרורתית. לאחר גידול ראשוני כבר המושרה על ידי טיפול טמוקסיפן, עלייה בנטל גרורתי הוא ציין בתוך 4-6 שבועות לאחר אינדוקציה. מאמר זה מראה כיצד ניתן לנצל הדמיית UltraSound בתדר גבוה במיוחד (UHFUS) כדי לעקוב אחר העלייה במעורבות גרורתית של בלוטות הלימפה המפשעתיות על ידי מדידת הגידול בנפחן.
מערכת UHFUS משמשת לסריקת עכברים מורדמים באמצעות בדיקה ליניארית UHFUS (22-55 מגה-הרץ, רזולוציה צירית 40 מיקרומטר). תמונות במצב B מבלוטות הלימפה המפשעתיות (הן בצד שמאל והן בצד ימין) נרכשות בתצוגה של ציר קצר, וממקמות את בעלי החיים באיסוף גב. רשומות אולטראסאונד נרכשות באמצעות גודל צעד 44 מיקרומטר על זרוע מכנית ממונעת. לאחר מכן, רכישות דו-ממדיות (2D) במצב B מיובאות לפלטפורמת התוכנה לתמונת אולטרסאונד לאחר עיבוד, ובלוטות לימפה מפשעתיות מזוהות ומפולחות באופן אוטומטי למחצה בתמונות הדו-ממדיות החתך שנרכשו. לבסוף, שחזור כולל של נפח תלת מימדי (3D) מתקבל באופן אוטומטי יחד עם עיבוד של נפח בלוטות הלימפה, אשר בא לידי ביטוי גם כמדידה מוחלטת.
טכניקת vivo לא פולשנית זו נסבלת היטב ומאפשרת תזמון של מפגשי הדמיה מרובים על אותה חיה ניסיונית במשך שבועיים. זה, אם כן, אידיאלי להעריך את ההשפעה של טיפול תרופתי על מחלות גרורתיות.
Introduction
מלנומה היא צורה אגרסיבית של סרטן העור המתפשטת לעתים קרובות לאתרי עור אחרים (גרורות תת עוריות), כמו גם לקשריות לימפה, ריאות, כבד, מוח ועצמות1. בעשור האחרון, תרופות חדשות הוכנסו לפרקטיקה קלינית ותרמו לשיפור תוחלת החיים של חולי מלנומה גרורתית. עם זאת, מגבלות להישאר, כולל זמן משתנה ומידת התגובה, תופעות לוואי חמורות, ואת ההתקוממות של התנגדות שנרכשה1. לכן, חשוב לזהות התפשטות גרורתית בשלביה המוקדמים, כלומר, כאשר היא מגיעה לבלוטות הלימפה המקומיות.
ביופסיה של בלוטות הלימפה המקומיות (בלוטות הלימפה הזקיף) מבוצעת בדרך כלל כדי לבדוק את נוכחותם של תאי מלנומה. עם זאת, הדמיית אולטרסאונד תופסת אחיזה כשיטה לא פולשנית של גילוי מעורבות גרורתית, כפי שהוא עולה על הערכה קלינית והוא יכול לעזור למנוע ביופסיה מיותרת2,3,4. יתר על כן, הדמיית אולטרסאונד נראה מתאים למעקב בלוטות הלימפה, במיוחד במקרה של גיל מתקדם ו/או תחלואה5,6. התכונות שזוהו על ידי ניתוח אולטרסאונד ומאפשרות את ההבחנה בין בלוטות לימפה רגילות גרורתיות כוללות גודל מוגבר (נפח), שינוי צורה מהאליפסה לעגול, שוליים לא סדירים, דפוס אקוגני שונה, ושינוי (מוגבר) כלי דם7.
Tyr::CreER +,BrafCA/+,Ptenlox/lox עכברים מהונדסים גנטית (עכברי Braf/Pten) הפכו לאחרונה לזמינים לקהילה המדעית כמודל ספציפי לרקמות ובלתי ניתן למניעה למלנומה גרורתית8. במודל זה של בעלי חיים, גידולים ראשוניים מתפתחים מהר מאוד: הם הופכים גלויים בתוך 2-3 שבועות לאחר אינדוקציה של המעבר מסוג בר (wt) בראף כדי BrafV600E ועל אובדן Pten, בעוד הם מגיעים נפח של 50-100 mm3 בתוך 4 שבועות. בשבועיים שלאחר מכן, הצמיחה של הגידול העיקרי מלווה בעלייה הדרגתית בנטל גרורתי באתרי עור אחרים, בלוטות הלימפה והריאות.
עכברי Braf/Pten שימשו בהרחבה למטרות רבות, כולל ניתוח של מסלולי איתות המעורבים במלנומגנזה9,10, זיהוי תאי מלנומה ממוצא11,12,13, ובדיקת אפשרויות טיפוליות חדשות במונחים של טיפול ממוקד ואימונותרפיה8,14,15,16 . באופן ספציפי, השתמשנו בעכברים Braf / Pten כדי להוכיח כי מונוציטוגנים ליסטריה מוחלשים (Lmat) עובד כחיסון נגד מלנומה. כאשר מנוהל באופן שיטתי בסביבה הטיפולית, Lmat אינו קשור לרעילות הכללית כפי שהוא מצטבר באופן סלקטיבי באתרי גידול. יתר על כן, זה גורם לירידה יוצאת דופן במסת המלנומה העיקרית וירידה בנטל גרורתי בבלוטות הלימפה והריאות. ברמה המולקולרית, Lmat גורם להרג אפופטוטי של תאי מלנומה, אשר נובע, לפחות בחלקו, לפעילויות שאינן אוטונומיות תאים (גיוס באתר של CD4 + ו CD8 + T לימפוציטים)16.
כאשר עכברי Braf / Pten משמשים למידול מלנומה, הצמיחה של גידולים ראשוניים וגרורות תת עוריות ניתן לפקח על ידי מדידות caliper. עם זאת, יש לחקור את המעורבות של בלוטות הלימפה והריאות באמצעות טכניקה חלופית, אולי לא פולשנית המאפשרת לחוקרים לעקוב אחר אותה חיה לאורך זמן. מאמר זה מתאר את השימוש בהדמיית אולטרסאונד (איור 1), יחד עם ניתוח נפחי תלת-ממדי עוקב של הנתונים המתקבלים, לניטור האורך של הגידול בגודל (נפח) של בלוטות הלימפה המפשעתיות.
Protocol
Representative Results
Discussion
הנתונים המתקבלים במחקר זה מעידים על היכולת של הדמיית אולטרסאונד כדי לפקח על המעורבות גרורתית של בלוטות הלימפה מפשעתיות של מודל העכבר Braf / Pten של מלנומה גרורתית. כפי שמוצג בעבר16, טכניקה זו שימושית במיוחד כדי להעריך את היעילות של טיפול תרופתי. הסיבה לכך היא כי זה מאפשר ניטור של הש…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים רוצים להודות לס. בורצ’יאלי (FTGM, פיזה) על עזרתה בהליכים בבעלי חיים. עבודה זו נתמכה על ידי ISPRO-Istituto per lo Studio la Prevenzione e la Rete Oncologica institutional Funding to LP; MFAG #17095 הוענק על ידי AIRC-Associazione Italiana Ricerca סול קנקרו ל- LP.
Materials
| 4-hydroxytamoxifen | Merck | H6278 | drug used for tumor induction |
| B6.Cg-Braftm1Mmcm Ptentm1Hwu Tg(Tyr-cre/ERT2)13Bos/BosJ (Braf/Pten) mice | The Jackson Laboratory | 013590 | |
| Blu gel | Sooft Ialia | ophthalmic solution gel | |
| BRAFV600E antibody | Spring Bioscience Corporation | E19290 | |
| IsoFlo (isoflorane) | Zoetis | liquid for gaseous anaesthesia | |
| MLANA antibody | Thermo Fisher Scientific | M2-7C10 | |
| Sigma gel | Parker | electrode gel | |
| Transonic gel clear | Telic SAU | ultrasound gel | |
| Veet | Reckitt Benckiser IT | depilatory cream | |
| Compact Dual Anesthesia System | Fujifilm, Visualsonics Inc. | Isoflurane-based anesthesia system equipped with nose cone and induction chamber | |
| MX550S | Fujifilm, Visualsonics Inc. | UHFUS linear probe | |
| Vevo 3100 | Fujifilm, Visualsonics Inc. | UHFUS system | |
| Vevo Imaging Station | Fujifilm, Visualsonics Inc. | UHFUS imaging station and Advancing Physiological Monitoring Unit endowed with heated board | |
| Vevo Lab | Fujifilm, Visualsonics Inc. | software platform for ultrasound image post-processing |
References
- Schvartsman, G., et al. Management of metastatic cutaneous melanoma: updates in clinical practice. Therapeutic Advances in Medical Oncology. 11, 1758835919851663 (2019).
- Blum, A., et al. Ultrasound examination of regional lymph nodes significantly improves early detection of locoregional metastases during the follow-up of patients with cutaneous melanoma – Results of a prospective study of 1288 patients. Cancer. 88 (11), 2534-2539 (2000).
- Olmedo, D., et al. Use of lymph node ultrasound prior to sentinel lymph node biopsy in 384 patients with melanoma: a cost-effectiveness analysis. Actas Dermo-Sifiliograficas. 108 (10), 931-938 (2017).
- Voit, C., et al. Ultrasound morphology criteria predict metastatic disease of the sentinel nodes in patients with melanoma. Journal of Clinical Oncology. 28 (5), 847-852 (2010).
- Hayes, A. J., et al. Prospective cohort study of ultrasound surveillance of regional lymph nodes in patients with intermediate-risk cutaneous melanoma. British Journal of Surgery. 106 (6), 729-734 (2019).
- Ipenburg, N. A., Thompson, J. F., Uren, R. F., Chung, D., Nieweg, O. E. Focused ultrasound surveillance of lymph nodes following lymphoscintigraphy without sentinel node biopsy: a useful and safe strategy in elderly or frail melanoma patients. Annals of Surgical Oncology. 26 (9), 2855-2863 (2019).
- Jayapal, N., et al. Differentiation between benign and metastatic cervical lymph nodes using ultrasound. Journal of Pharmacy and Bioallied Sciences. 11, 338-346 (2019).
- Dankort, D., et al. Braf(V600E) cooperates with Pten loss to induce metastatic melanoma. Nature Genetics. 41 (5), 544-552 (2009).
- Damsky, W. E., et al. β-catenin signaling controls metastasis in Braf-activated Pten-deficient melanomas. Cancer Cell. 20 (6), 741-754 (2011).
- Xie, X., Koh, J. Y., Price, S., White, E., Mehnert, J. M. Atg7 overcomes senescence and promotes growth of BrafV600E-driven melanoma. Cancer Discovery. 5 (4), 410-423 (2015).
- Kohler, C., et al. Mouse cutaneous melanoma induced by mutant BRaf arises from expansion and dedifferentiation of mature pigmented melanocytes. Cell Stem Cell. 21 (5), 679-693 (2017).
- Yuan, P., et al. Phenformin enhances the therapeutic benefit of BRAF(V600E) inhibition in melanoma. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (45), 18226-18231 (2013).
- Marsh Durban, V., Deuker, M. M., Bosenberg, M. W., Phillips, W., McMahon, M. Differential AKT dependency displayed by mouse models of BRAFV600E-initiated melanoma. Journal of Clinical Investigation. 123 (12), 5104-5118 (2013).
- Hooijkaas, A. I., Gadiot, J., vander Valk, M., Mooi, W. J., Blank, C. U. Targeting BRAFV600E in an inducible murine model of melanoma. American Journal of Pathology. 181 (3), 785-794 (2012).
- Steinberg, S. M., et al. BRAF inhibition alleviates immune suppression in murine autochthonous melanoma. Cancer Immunology Research. 2 (11), 1044-1050 (2014).
- Vitiello, M., et al. Antitumoral effects of attenuated Listeria monocytogenes in a genetically engineered mouse model of melanoma. Oncogene. 38 (19), 3756-3762 (2019).
- Moon, H., et al. Melanocyte stem cell activation and translocation initiate cutaneous melanoma in response to UV exposure. Cell Stem Cell. 21 (5), 665-678 (2017).
- Zhao, L., Zhan, Y. T., Rutkowski, J. L., Feuerstein, G. Z., Wang, X. K. Correlation between 2-and 3-dimensional assessment of tumor volume and vascular density by ultrasonography in a transgenic mouse model of mammary carcinoma. Journal of Ultrasound in Medicine. 29 (4), 587-595 (2010).
