Análise do volume do nódulo linfático por ultra-alta frequência ultrassom no modelo de camundongos geneticamente modificado braf/pten de melanoma
Summary
O melanoma é uma doença muito agressiva que rapidamente se espalha para outros órgãos. Este protocolo descreve a aplicação de imagens de ultrassom de ultra-alta frequência, juntamente com renderização 3D, para monitorar o volume dos linfonodos inguinais no modelo de camundongo Braf/Pten de melanoma metastático.
Abstract
Tyr::CreER+,BrafCA/+,Ptenlox/lox camundongos geneticamente modificados (camundongos Braf/Pten) são amplamente utilizados como um modelo in vivo de melanoma metastático. Uma vez que um tumor primário tenha sido induzido pelo tratamento de tamoxifen, um aumento da carga metastática é observado dentro de 4-6 semanas após a indução. Este artigo mostra como imagens ultra-altas de frequência ultra-alta-freqüência ultrasound (UHFUS) podem ser exploradas para monitorar o aumento do envolvimento metastático dos linfonodos inguinais medindo o aumento de seu volume.
O sistema UHFUS é usado para digitalizar camundongos anestesiados com uma sonda linear UHFUS (22-55 MHz, resolução axial de 40 μm). As imagens do modo B dos linfonodos inguinais (ambos os lados esquerdo e direito) são adquiridas em uma visão de eixo curto, posicionando os animais em recumbência dorsal. Os registros de ultrassom são adquiridos usando um tamanho de passo de 44 μm em um braço mecânico motorizado. Posteriormente, aquisições bidimensionais (2D) do modo B são importadas para a plataforma de software para pós-processamento de imagens de ultrassom, e os linfonodos inguinais são identificados e segmentados semi-automaticamente nas imagens 2D transversais adquiridas. Finalmente, uma reconstrução total do volume tridimensional (3D) é obtida automaticamente juntamente com a renderização do volume do linfonodo, que também é expressa como uma medição absoluta.
Esta técnica in vivo não invasiva é muito bem tolerada e permite o agendamento de múltiplas sessões de imagem no mesmo animal experimental ao longo de 2 semanas. É, portanto, ideal avaliar o impacto do tratamento farmacológico sobre a doença metastática.
Introduction
O melanoma é uma forma agressiva de câncer de pele que muitas vezes se espalha para outros locais de pele (metástases subcutâneas), bem como para linfonodos, pulmões, fígado, cérebro e ossos1. Na última década, novos medicamentos foram introduzidos na prática clínica e contribuíram para melhorar a expectativa de vida de pacientes com melanoma metastático. No entanto, permanecem limitações, incluindo tempo variável e grau de resposta, efeitos colaterais graves e a insurgência da resistência adquirida1. Portanto, é crucial detectar a propagação metastática em seus estágios iniciais, ou seja, quando chega aos linfonodos locais.
Uma biópsia dos linfonodos locais (linfonodos sentinelas) é geralmente realizada para verificar a presença de células de melanoma. No entanto, a imagem de ultrassom está tomando conta como um método não invasivo de detecção de envolvimento metastático, pois supera a avaliação clínica e pode ajudar a evitar uma biópsia desnecessária2,3,4. Além disso, a imagem de ultrassom parece apropriada para a vigilância de linfonodos, especialmente no caso de idade avançada e/ou comorbidades5,6. As características detectadas pela análise do ultrassom e permitem a diferenciação entre linfonodos normais e metastáticos compreendem aumento de tamanho (volume), mudança de forma de oval para redondo, margem irregular, padrão ecogênico alterado e vascularização alterada7.
Tyr::CreER+,BrafCA/+,Ptenlox/lox camundongos geneticamente modificados (camundongos Braf/Pten) foram recentemente disponibilizados para a comunidade científica como um modelo específico de tecido e indutível para melanoma metastático8. Neste modelo animal, os tumores primários desenvolvem-se muito rapidamente: tornam-se visíveis dentro de 2-3 semanas após a indução da mudança de braf tipo selvagem (wt) para BrafV600E e da perda de Pten, enquanto atingem um volume de 50-100 mm3 dentro de 4 semanas. Nas 2 semanas seguintes, o crescimento do tumor primário é acompanhado por um aumento progressivo da carga metastática em outros locais de pele, linfonodos e pulmões.
Os camundongos Braf/Pten têm sido amplamente utilizados para múltiplos propósitos, incluindo a dissecção de vias de sinalização envolvidas na melanomagênese 9,10, a identificação de células de melanoma de origem11,12,13 e o teste de novas opções terapêuticas em termos de terapia direcionada e imunoterapia8,14,15,16 . Especificamente, usamos camundongos Braf/Pten para demonstrar que listeria monocytogenes atenuada (Lmat) funciona como uma vacina anti-melanoma. Quando administrado sistematicamente no ambiente terapêutico, o Lmat não está associado à toxicidade geral, pois se acumula seletivamente em locais tumorais. Além disso, causa uma notável diminuição da massa primária de melanoma e uma redução da carga metastática nos linfonodos e pulmões. No nível molecular, o Lmat causa morte apoptótica de células de melanoma, o que se deve, pelo menos em parte, a atividades não autônomas de células (recrutamento no local de linfócitos CD4+ e CD8+ T)16.
Quando os camundongos Braf/Pten são usados para modelagem de melanoma, o crescimento de tumores primários e metástases subcutâneas pode ser monitorado por medidas de pinça. No entanto, o envolvimento de linfonodos e pulmões precisa ser investigado usando uma técnica alternativa, possivelmente uma não invasiva que permite aos pesquisadores seguir o mesmo animal ao longo do tempo. Este artigo descreve o uso de imagens de ultrassom (Figura 1), juntamente com uma análise volumétrica 3D subsequente dos dados obtidos, para o monitoramento longitudinal do aumento do tamanho (volume) de linfonodos inguinais.
Protocol
Representative Results
Discussion
Os dados obtidos neste estudo atestam a capacidade da ultrassom de monitorar o envolvimento metastático de linfonodos inguinais do modelo de camundongo Braf/Pten de melanoma metastático. Como mostrado anteriormente16, esta técnica é especialmente útil para avaliar a eficácia do tratamento medicamentoso. Isso porque permite o monitoramento da alteração no volume de linfonodos no mesmo animal ao longo do tempo, comparando as medidas coletadas no t1 andt2 co…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores gostariam de agradecer a S. Burchielli (FTGM, Pisa) por sua ajuda com procedimentos animais. Este trabalho foi apoiado pelo ISPRO-Istituto per lo Studio la Prevenzione e la Rete Oncologica financiamento institucional para lp; MFAG #17095 concedido pela AIRC-Associazione Italiana Ricerca sul Cancro ao LP.
Materials
| 4-hydroxytamoxifen | Merck | H6278 | drug used for tumor induction |
| B6.Cg-Braftm1Mmcm Ptentm1Hwu Tg(Tyr-cre/ERT2)13Bos/BosJ (Braf/Pten) mice | The Jackson Laboratory | 013590 | |
| Blu gel | Sooft Ialia | ophthalmic solution gel | |
| BRAFV600E antibody | Spring Bioscience Corporation | E19290 | |
| IsoFlo (isoflorane) | Zoetis | liquid for gaseous anaesthesia | |
| MLANA antibody | Thermo Fisher Scientific | M2-7C10 | |
| Sigma gel | Parker | electrode gel | |
| Transonic gel clear | Telic SAU | ultrasound gel | |
| Veet | Reckitt Benckiser IT | depilatory cream | |
| Compact Dual Anesthesia System | Fujifilm, Visualsonics Inc. | Isoflurane-based anesthesia system equipped with nose cone and induction chamber | |
| MX550S | Fujifilm, Visualsonics Inc. | UHFUS linear probe | |
| Vevo 3100 | Fujifilm, Visualsonics Inc. | UHFUS system | |
| Vevo Imaging Station | Fujifilm, Visualsonics Inc. | UHFUS imaging station and Advancing Physiological Monitoring Unit endowed with heated board | |
| Vevo Lab | Fujifilm, Visualsonics Inc. | software platform for ultrasound image post-processing |
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