Macrofaagdifferentiatie en polarisatie in een M2-achtig fenotype met behulp van een menselijke monocytachtige THP-1 leukemie cellijn
Summary
M2-achtige tumor-geassocieerde macrofagen (TAM) zijn geassocieerd met tumorprogressie en slechte prognose bij kanker. Dit protocol dient als een gedetailleerde gids om THP-1 monocytachtige cellen binnen 14 dagen reproduceerbaar te differentiëren en te polariseren in M2-achtige macrofagen. Dit model is de basis om de ontstekingsremmende effecten van TAM in de tumormicro-omgeving te onderzoeken.
Abstract
Tumor-geassocieerde macrofagen (TAM) kunnen hun expressie en cytokineprofiel veranderen op basis van externe stimuli. Deze opmerkelijke plasticiteit stelt TAM in staat zich aan te passen aan voortdurende veranderingen in de micro-omgeving van de tumor. Macrofagen kunnen voornamelijk pro-inflammatoire (M1-achtige) of ontstekingsremmende (M2-achtige) eigenschappen hebben en kunnen voortdurend schakelen tussen deze twee hoofdtoestanden. M2-achtige macrofagen in de tumoromgeving worden geassocieerd met kankerprogressie en slechte prognose bij verschillende soorten kanker. Veel verschillende methoden voor het induceren van differentiatie en polarisatie van THP-1-cellen worden gebruikt om cellulaire en intercellulaire mechanismen en de effecten van TAM in de micro-omgeving van tumoren te onderzoeken. Momenteel is er geen vastgesteld model voor M2-achtige macrofaagpolarisatie met behulp van de THP-1-cellijn en de resultaten van expressie- en cytokineprofielen van macrofagen als gevolg van bepaalde in vitro stimuli variëren tussen studies. Dit protocol dient als gedetailleerde leidraad om THP-1 monocytachtige cellen te differentiëren in M0-macrofagen en om cellen binnen 14 dagen verder te polariseren tot een M2-achtig fenotype. We demonstreren de morfologische veranderingen van THP-1 monocytachtige cellen, gedifferentieerde macrofagen en gepolariseerde M2-achtige macrofagen met behulp van lichtmicroscopie. Dit model is de basis voor cellijnmodellen die de ontstekingsremmende effecten van TAM en hun interacties met andere celpopulaties van de tumormicro-omgeving onderzoeken.
Introduction
Tumor-geassocieerde macrofagen (TAM) en hun rol bij chronische ontsteking, het begin van kanker en tumorontwikkeling zijn belangrijke doelen in recent onderzoek1,2. Perifere bloedmonocyten die worden gerekruteerd naar de weefselmicro-omgeving van de zich ontwikkelende tumor differentiëren in macrofagen en kunnen worden gepolariseerd in twee hoofdsubtypen van macrofagen3. De klassiek geactiveerde macrofaag vertegenwoordigt het voornamelijk pro-inflammatoire M1-achtige fenotype en het alternatief geactiveerde M2-achtige subtype vertoont overwegend ontstekingsremmende kenmerken4. Macrofagen kunnen dynamisch schakelen tussen deze twee belangrijkste fenotypen, afhankelijk van hun cellulaire metabolisme, waarbij intermediaire subtypen zowel inflammatoire als ontstekingsremmende eigenschappen hebben5. TAM vertegenwoordigt een heterogene populatie van beide fenotypen. Een tumorbevorderende functie en slechte prognose bij verschillende soorten kanker wordt echter vooral geassocieerd met M2-achtige macrofagen6,7,8.
De functionele profielen van macrofagen en hun interactie met andere cellen in de micro-omgeving van de tumor zijn complex en uitdagend om vast te leggen in een voortdurend veranderende omgeving tijdens de voortdurende tumorontwikkeling. Cellijnen kunnen een homogene celpopulatie bieden met een stabiele levensvatbaarheid in cultuur, wat het proces van het aantonen van gedefinieerde cellulaire en intercellulaire mechanismen kan vergemakkelijken. De monocyt-achtige THP-1 cellijn is een legitiem modelsysteem voor primaire menselijke monocyten9. Deze spontaan vereeuwigde cellijn is verkregen uit het perifere bloed van een eenjarig kind met acute monocytische leukemie9,10. De differentiatie en polarisatie van THP-1-cellen zijn gemeld door verschillende studies en zijn op meerdere verschillende manieren uitgevoerd11,12,13,14. Activering en daarom de polarisatie van macrofagen in een M1-achtig fenotype wordt gevolgd door een compenserend ontstekingsremmend reboundmechanisme, dat een M2-achtig fenotype bevordert via cytokines geproduceerd door inflammatoire macrofagen, zoals interleukine 6 (IL-6) of itaconate15,16. Dit kan dienen als een pauzemechanisme om een overschietende ontstekingsreactie na celactivering tedempen 17. Het proces van het differentiëren en polariseren van monocyten en THP-1 monocytachtige cellen tot een ontstekingsremmend M2-achtig fenotype gaat zelf ook gepaard met pro-inflammatoire stimuli die moeten worden overwonnen. Een inflammatoire cytokinerespons kan worden veroorzaakt door mechanische stress18, zoals het veranderen van media om de cellen te voeden, of het toevoegen van chemische verbindingen om THP-1-cellen te differentiëren, zoals phorbol 12-myristate 13-acetaat (PMA), en induceert de productie van tumornecrosefactor α (TNFα), interleukine 1β (IL-1β) of IL-619. Dit veranderde cytokine-expressieprofiel als reactie op PMA kan latere macrofaagpolarisatie beïnvloeden en voorkomen20. Adequate rustperioden, zoals gemeld vóór na PMA-behandeling, zorgen ervoor dat deze ontstekingsreacties verminderen en celpolarisatie vergemakkelijken tot een duidelijk M2-achtig fenotype21.
Dit protocol demonstreert een methode om THP-1 monocytachtige cellen binnen 14 dagen te differentiëren en te polariseren tot een M2-achtig fenotype van macrofagen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit protocol voor het differentiëren en polariseren van THP-1 monocytachtige cellen binnen 14 dagen biedt een methode om macrofagen te verkrijgen met een duidelijk M2-achtig fenotype als gevolg van lange behandeling incubatie van cellen met voldoende rustperioden tussen stappen.
Bepaalde stappen zijn van cruciaal belang voor dit protocol. De verdubbelingstijd van THP-1 monocyten is ongeveer 26 uur. Cellen kunnen worden gesplitst met een celdichtheid van 9 x 105/ ml en moeten worden…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Het Price Institute of Surgical Research, University of Louisville, wordt financieel ondersteund door de John W. Price en Barbara Thruston Atwood Price Trust. De financieringsbronnen speelden geen rol in de opzet en uitvoering van het onderzoek en in het verzamelen, beheren, analyseren en interpreteren van de gegevens.
Materials
| 0.4% trypan blue | VWR, Radnor, USA | 152-5061 | |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | USA Scientific, Ocala, USA | 1615-5510 | |
| 10 mL serological pipet | VWR, Radnor, USA | 89130-898 | |
| 1000 μL TipOne pipet tips | USA Scientific, Ocala, USA | 1111-2821 | |
| 15 mL Centrifuge tube | VWR, Radnor, USA | 89039-664 | |
| 20 μL TipOne pipet tips | USA Scientific, Ocala, USA | 1120-1810 | |
| 200 μL TipOne pipet tips | USA Scientific, Ocala, USA | 1120-8810 | |
| 25 mL serological pipet | VWR, Radnor, USA | 89130-900 | |
| 5 mL serological pipet | VWR, Radnor, USA | 89130-896 | |
| 50 mL Centrifuge tube | VWR, Radnor, USA | 89039-662 | |
| Accutase solution 500 mL | Sigma, St. Louis, USA | A6964 | |
| Antibiotic Antimycotic Solution (100x), stabilized | Sigma, St. Louis, USA | A5955-100 mL | with 10,000 units penicillin, 10 mg of streptomycin and 25 μg of amphotericin B per mL, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture |
| Binder CO2 Incubator | VWR, Radnor, USA | C170-ULE3 | |
| CytoOne T-75cm flask with filter cap | USA Scientific, Ocala, USA | CC7682-4875 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma, St. Louis, USA | D8537-500 mL | PBS without calcium chloride and magnesium chloride should be used, since both can alter macrophage polarization |
| Eppendorf Centrifuge 5804 R (refrigerated) | Eppendorf, Enfield, USA | – | |
| Ethyl alcohol (70%) | – | – | |
| FACSCalibur flow cytometer | BD Biosciences, San Diego, USA | – | The flow cytometer operates with CellQuest software (BD Biosciences) |
| Falcon 24-well plate | VWR, Radnor, USA | 353504 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | ATCC, Manassas, USA | 30-2020 | |
| FITC Mouse Anti-Human CD14 | BD Biosciences, San Diego, USA | 555397 | Flow cytometry, myeloid cell marker (100 tests) |
| FITC Mouse Anti-Human CD80 | BD Pharmingen, San Diego, USA | 557226 | Flow cytometry, M1 marker (100 tests) |
| FITC Mouse IgG1 κ Isotype Control | BD Pharmingen, San Diego, USA | 555748 | Flow cytometry, isotype control for CD80 (100 tests) |
| FITC Mouse IgG2a, κ Isotype Control | BD Biosciences, San Diego, USA | 553456 | Flow cytometry, isotype control for CD14 (100 tests) |
| Human BD Fc Block | BD Biosciences, San Diego, USA | 564220 | Flow cytometry, Fc block (0.25 mg) |
| Human interleukin 13 (IL-13) | R&D, Minneapolis, USA | IL-771-10 μg | |
| Human interleukin 4 (IL-4) | R&D, Minneapolis, USA | SRP3093-20 μg | |
| Labconco Biosafety Cabinet (Delta Series 36212/36213) | Labconco, Kansas City, USA | – | |
| L-Glutamine Solution, 200 mM | ATCC, Manassas, USA | 30-2214 | |
| Lipopolysaccharide (LPS) from E. coli 0111:B4 | Sigma, St. Louis, USA | L2630-100 mg | |
| Mini Cell Scrapers | Biotium, Fremont, USA | 22003 | |
| Neubauer hemocytometer | Fisher Scientific, Waltham, USA | 02-671-5 | |
| Nikon Eclipse inverted microscope TS100 | Nikon, Melville, USA | – | |
| Nuclease-free water | Invitrogen, Carlsbad, USA | AM9937 | |
| Olympus Light Microscope RH-2 | Microscope Central, Feasterville, USA | 40888 | |
| P10 variable pipet- Gilson | VWR, Radnor, USA | 76180-014 | |
| P1000 variable pipet-Gilson | VWR, Radnor, USA | 76177-990 | |
| P200 variable pipet- Gilson | VWR, Radnor, USA | 76177-988 | |
| PE Mouse Anti-Human CD11b | BD Biosciences, San Diego, USA | 555388 | Flow cytometry, myeloid cell marker (100 tests) |
| PE Mouse IgG1, κ Isotype Control | BD Biosciences, San Diego, USA | 555749 | Flow cytometry, isotype control for CD11b (100 tests) |
| PE-Cy 5 Mouse Anti-Human CD206 | BD Pharmingen, San Diego, USA | 551136 | Flow cytometry, M2 marker (100 tests) |
| PE-Cy 5 Mouse IgG1 κ Isotype Control | BD Pharmingen, San Diego, USA | 555750 | Flow cytometry, isotype control for CD206 (100 tests) |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma, St. Louis, USA | P8139 | |
| Powerpette Plus pipettor | VWR, Radnor, USA | 75856-448 | |
| Precision Water bath (model 183) | Precision Scientific, Chicago, USA | 66551 | |
| RPMI-1640 Medium | ATCC, Manassas, USA | 30-2001 | |
| THP-1 cell line, American Type Culture Collection (ATCC) | ATCC, Manassas, USA | TIB-202 |
References
- Zhang, R., et al. Cancer-associated fibroblasts enhance tumor-associated macrophages enrichment and suppress NK cells function in colorectal cancer. Cell Death and Disease. 10 (4), 273 (2019).
- Wang, J., Li, D., Cang, H., Guo, B. Crosstalk between cancer and immune cells: Role of tumor-associated macrophages in the tumor microenvironment. Cancer Medicine. 8 (10), 4709-4721 (2019).
- Soncin, I., et al. The tumor microenvironment creates a niche for the self-renewal of tumor-promoting macrophages in colon adenoma. Nature Communications. 9 (1), 582 (2018).
- Mosser, D. M., Edwards, J. P. Exploring the full spectrum of macrophage activation. Nature Reviews Immunology. 8 (12), 958-969 (2008).
- Mazzone, M., Menga, A., Castegna, A. Metabolism and TAM functions-it takes two to tango. Federation of European Biochemical Societies Journal. 285 (4), 700-716 (2018).
- Eum, H. H., et al. Tumor-promoting macrophages prevail in malignant ascites of advanced gastric cancer. Experimental and Molecular Medicine. 52 (12), 1976-1988 (2020).
- Qian, B. Z., Pollard, J. W. Macrophage diversity enhances tumor progression and metastasis. Cell. 141 (1), 39-51 (2010).
- Scheurlen, K. M., Billeter, A. T., O’Brien, S. J., Galandiuk, S. Metabolic dysfunction and early-onset colorectal cancer – how macrophages build the bridge. Cancer Medicine. 9 (18), 6679-6693 (2020).
- Bosshart, H., Heinzelmann, M. THP-1 cells as a model for human monocytes. Annals of Translational Medicine. 4 (21), 438 (2016).
- . The American Type Culture Collection (ATCC) Available from: https://www.atcc.org/products/all/TIB-202.aspx#generalinformation (2021)
- Baxter, E. W., et al. Standardized protocols for differentiation of THP-1 cells to macrophages with distinct M(IFNgamma+LPS), M(IL-4), and M(IL-10) phenotypes. Journal of Immunological Methods. 478, 112721 (2020).
- Genin, M., Clement, F., Fattaccioli, A., Raes, M., Michiels, C. M1 and M2 macrophages derived from THP-1 cells differentially modulate the response of cancer cells to etoposide. BMC Cancer. 15, 577 (2015).
- Starr, T., Bauler, T. J., Malik-Kale, P., Steele-Mortimer, O. The phorbol 12-myristate-13-acetate differentiation protocol is critical to the interaction of THP-1 macrophages with Salmonella Typhimurium. PLoS One. 13 (3), 0193601 (2018).
- Lund, M. E., To, J., O’Brien, B. A., Donnelly, S. The choice of phorbol 12-myristate 13-acetate differentiation protocol influences the response of THP-1 macrophages to a pro-inflammatory stimulus. Journal of Immunological Methods. 430, 64-70 (2016).
- Yin, Z., et al. IL-6/STAT3 pathway intermediates M1/M2 macrophage polarization during the development of hepatocellular carcinoma. Journal of Cellular Biochemistry. 119 (11), 9419-9432 (2018).
- O’Neill, L. A. J., Artyomov, M. N. Itaconate: the poster child of metabolic reprogramming in macrophage function. Nature Reviews Immunology. 19 (5), 273-281 (2019).
- Luig, M., et al. Inflammation-induced IL-6 functions as a natural brake on macrophages and limits gn. Journal of the American Society of Nephrology. 26 (7), 1597-1607 (2015).
- Maruyama, K., Nemoto, E., Yamada, S. Mechanical regulation of macrophage function – cyclic tensile force inhibits NLRP3 inflammasome-dependent IL-1beta secretion in murine macrophages. Inflammation and Regeneration. 39, 3 (2019).
- Gatto, F., et al. PMA-Induced THP-1 Macrophage Differentiation is Not Impaired by Citrate-Coated Platinum Nanoparticles. Nanomaterials (Basel). 7 (10), (2017).
- Maess, M. B., Wittig, B., Cignarella, A., Lorkowski, S. Reduced PMA enhances the responsiveness of transfected THP-1 macrophages to polarizing stimuli. Journal of Immunological Methods. 402 (1-2), 76-81 (2014).
- Daigneault, M., Preston, J. A., Marriott, H. M., Whyte, M. K., Dockrell, D. H. The identification of markers of macrophage differentiation in PMA-stimulated THP-1 cells and monocyte-derived macrophages. PLoS One. 5 (1), 8668 (2010).
- Raggi, F., et al. Regulation of human macrophage M1-M2 polarization balance by hypoxia and the triggering receptor expressed on myeloid cells-1. Frontiers in Immunology. 8, 11097 (2017).
- Neutelings, T., Lambert, C. A., Nusgens, B. V., Colige, A. C. Effects of mild cold shock (25 degrees C) followed by warming up at 37 degrees C on the cellular stress response. PLoS One. 8 (7), 69687 (2013).
- Kurashina, Y., et al. Enzyme-free release of adhered cells from standard culture dishes using intermittent ultrasonic traveling waves. Communications Biology. 2, 393 (2019).
- Chen, S., So, E. C., Strome, S. E., Zhang, X. Impact of Detachment Methods on M2 Macrophage Phenotype and Function. Journal of Immunological Methods. 426, 56-61 (2015).
- Bailey, J. D., et al. Isolation and culture of murine bone marrow-derived macrophages for nitric oxide and redox biology. Nitric Oxide. 100-101, 17-29 (2020).
