Дифференцировка и поляризация макрофагов в M2-подобный фенотип с использованием клеточной линии лейкемии лейкемии человека, подобной THP-1
Summary
M2-подобные опухолеациоцировые макрофаги (TAM) связаны с прогрессированием опухоли и плохим прогнозом при раке. Этот протокол служит подробным руководством для воспроизводимой дифференцировки и поляризации моноцитоподобных клеток THP-1 в M2-подобные макрофаги в течение 14 дней. Эта модель является основой для исследования противовоспалительных эффектов ТАМ в микроокружении опухоли.
Abstract
Опухолеассоциированная макрофаги (ТАМ) может переключать свою экспрессию и профиль цитокинов в соответствии с внешними раздражителями. Эта замечательная пластичность позволяет TAM адаптироваться к текущим изменениям в микроокружении опухоли. Макрофаги могут иметь в основном провоспалительные (M1-подобные) или противовоспалительные (M2-подобные) атрибуты и могут постоянно переключаться между этими двумя основными состояниями. M2-подобные макрофаги в опухолевой среде связаны с прогрессированием рака и плохим прогнозом при нескольких типах рака. Многие различные методы индуцирования дифференцировки и поляризации клеток THP-1 используются для исследования клеточных и межклеточных механизмов и эффектов ТАМ в микроокружении опухолей. В настоящее время не существует установленной модели поляризации М2-подобных макрофагов с использованием клеточной линии THP-1, а результаты экспрессии и профилей цитокинов макрофагов из-за определенных стимулов in vitro варьируются между исследованиями. Этот протокол служит подробным руководством для дифференцировки моноцитоподобных клеток THP-1 в макрофаги M0 и дальнейшей поляризации клеток в M2-подобный фенотип в течение 14 дней. Мы демонстрируем морфологические изменения моноцитоподобных клеток THP-1, дифференцированных макрофагов и поляризованных M2-подобных макрофагов с помощью световой микроскопии. Эта модель является основой для моделей клеточных линий, исследующих противовоспалительные эффекты ТАМ и их взаимодействия с другими клеточными популяциями микроокружения опухоли.
Introduction
Опухолеассеоциированные макрофаги (TAM) и их роль в хроническом воспалении, возникновении рака и развитии опухоли являются важными целями в недавних исследованиях1,2. Моноциты периферической крови, которые рекрутируются в тканевую микросреду развивающейся опухоли, дифференцируются в макрофаги и могут быть поляризованы в два основных подтипа макрофагов3. Классически активированный макрофаг представляет собой преимущественно провоспалительный М1-подобный фенотип, а альтернативно активированный М2-подобный подтип проявляет преимущественно противовоспалительные характеристики4. Макрофаги могут динамически переключаться между этими двумя основными фенотипами в зависимости от их клеточного метаболизма, причем промежуточные подтипы имеют как воспалительные, так и противовоспалительные свойства5. TAM представляет собой гетерогенную популяцию обоих фенотипов. Опухоле-продуцирующие функции и плохой прогноз при различных видах рака, однако, особенно связаны с М2-подобными макрофагами6,7,8.
Функциональные профили макрофагов и их взаимодействие с другими клетками в микроокружении опухоли сложны и сложны для захвата в постоянно меняющейся среде во время продолжающегося развития опухоли. Клеточные линии могут обеспечить однородную клеточную популяцию со стабильной жизнеспособностью в культуре, что может облегчить процесс демонстрации определенных клеточных и межклеточных механизмов. Моноцито-подобная клеточная линия THP-1 является законной модельной системой для первичных моноцитов человека9. Эта спонтанно увековеченная клеточная линия была получена из периферической крови годовалого младенца с острым моноцитарным лейкозом9,10. Дифференцировка и поляризация клеток THP-1 были зарегистрированы в нескольких исследованиях и были выполнены несколькими различными способами11, 12,13,14. Активация и, следовательно, поляризация макрофагов в М1-подобный фенотип сопровождается компенсаторным противовоспалительным механизмом отскока, способствующим М2-подобному фенотипу через цитокины, продуцируемые воспалительными макрофагами, такими как интерлейкин 6 (IL-6) или итаконат15,16. Это может служить механизмом разрыва для ослабления чрезмерной воспалительной реакции после активации клеток17. Процесс дифференцировки и поляризации моноцитов и моноцитоподобных клеток THP-1 в противовоспалительный М2-подобный фенотип сам по себе также сопровождается провоспалительными раздражителями, которые необходимо преодолеть. Воспалительный цитокиновый ответ может быть вызван механическим напряжением18,таким как изменение среды для повторного наполнения клеток или добавление химических соединений для дифференцировки клеток THP-1, таких как форбол 12-миристат 13-ацетат (PMA), и индуцировать выработку фактора некроза опухоли α (TNFα), интерлейкина 1β (IL-1β) или IL-619. Этот измененный профиль экспрессии цитокинов в ответ на PMA может влиять и предотвращать последующую поляризацию макрофагов20. Адекватные периоды покоя, как сообщалось ранее после лечения ПМА, позволяют этим воспалительным реакциям уменьшаться и облегчают поляризацию клеток в отдельный M2-подобный фенотип21.
Этот протокол демонстрирует метод дифференцировки и поляризации моноцитоподобных клеток THP-1 в M2-подобный фенотип макрофагов в течение 14 дней.
Protocol
Representative Results
Discussion
Этот протокол дифференцировки и поляризации моноцитоподобных клеток THP-1 в течение 14 дней обеспечивает метод получения макрофагов с отчетливым М2-подобным фенотипом за счет длительной инкубации клеток с адекватными периодами покоя между этапами.
Определенные шаги имею?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Институт хирургических исследований Прайса, Университет Луисвилля, финансово поддерживается Фондом Джона У. Прайса и Барбары Трастон Этвуд Прайс. Источники финансирования не играют никакой роли в разработке и проведении исследования, а также в сборе, управлении, анализе и интерпретации данных.
Materials
| 0.4% trypan blue | VWR, Radnor, USA | 152-5061 | |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | USA Scientific, Ocala, USA | 1615-5510 | |
| 10 mL serological pipet | VWR, Radnor, USA | 89130-898 | |
| 1000 μL TipOne pipet tips | USA Scientific, Ocala, USA | 1111-2821 | |
| 15 mL Centrifuge tube | VWR, Radnor, USA | 89039-664 | |
| 20 μL TipOne pipet tips | USA Scientific, Ocala, USA | 1120-1810 | |
| 200 μL TipOne pipet tips | USA Scientific, Ocala, USA | 1120-8810 | |
| 25 mL serological pipet | VWR, Radnor, USA | 89130-900 | |
| 5 mL serological pipet | VWR, Radnor, USA | 89130-896 | |
| 50 mL Centrifuge tube | VWR, Radnor, USA | 89039-662 | |
| Accutase solution 500 mL | Sigma, St. Louis, USA | A6964 | |
| Antibiotic Antimycotic Solution (100x), stabilized | Sigma, St. Louis, USA | A5955-100 mL | with 10,000 units penicillin, 10 mg of streptomycin and 25 μg of amphotericin B per mL, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture |
| Binder CO2 Incubator | VWR, Radnor, USA | C170-ULE3 | |
| CytoOne T-75cm flask with filter cap | USA Scientific, Ocala, USA | CC7682-4875 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma, St. Louis, USA | D8537-500 mL | PBS without calcium chloride and magnesium chloride should be used, since both can alter macrophage polarization |
| Eppendorf Centrifuge 5804 R (refrigerated) | Eppendorf, Enfield, USA | – | |
| Ethyl alcohol (70%) | – | – | |
| FACSCalibur flow cytometer | BD Biosciences, San Diego, USA | – | The flow cytometer operates with CellQuest software (BD Biosciences) |
| Falcon 24-well plate | VWR, Radnor, USA | 353504 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | ATCC, Manassas, USA | 30-2020 | |
| FITC Mouse Anti-Human CD14 | BD Biosciences, San Diego, USA | 555397 | Flow cytometry, myeloid cell marker (100 tests) |
| FITC Mouse Anti-Human CD80 | BD Pharmingen, San Diego, USA | 557226 | Flow cytometry, M1 marker (100 tests) |
| FITC Mouse IgG1 κ Isotype Control | BD Pharmingen, San Diego, USA | 555748 | Flow cytometry, isotype control for CD80 (100 tests) |
| FITC Mouse IgG2a, κ Isotype Control | BD Biosciences, San Diego, USA | 553456 | Flow cytometry, isotype control for CD14 (100 tests) |
| Human BD Fc Block | BD Biosciences, San Diego, USA | 564220 | Flow cytometry, Fc block (0.25 mg) |
| Human interleukin 13 (IL-13) | R&D, Minneapolis, USA | IL-771-10 μg | |
| Human interleukin 4 (IL-4) | R&D, Minneapolis, USA | SRP3093-20 μg | |
| Labconco Biosafety Cabinet (Delta Series 36212/36213) | Labconco, Kansas City, USA | – | |
| L-Glutamine Solution, 200 mM | ATCC, Manassas, USA | 30-2214 | |
| Lipopolysaccharide (LPS) from E. coli 0111:B4 | Sigma, St. Louis, USA | L2630-100 mg | |
| Mini Cell Scrapers | Biotium, Fremont, USA | 22003 | |
| Neubauer hemocytometer | Fisher Scientific, Waltham, USA | 02-671-5 | |
| Nikon Eclipse inverted microscope TS100 | Nikon, Melville, USA | – | |
| Nuclease-free water | Invitrogen, Carlsbad, USA | AM9937 | |
| Olympus Light Microscope RH-2 | Microscope Central, Feasterville, USA | 40888 | |
| P10 variable pipet- Gilson | VWR, Radnor, USA | 76180-014 | |
| P1000 variable pipet-Gilson | VWR, Radnor, USA | 76177-990 | |
| P200 variable pipet- Gilson | VWR, Radnor, USA | 76177-988 | |
| PE Mouse Anti-Human CD11b | BD Biosciences, San Diego, USA | 555388 | Flow cytometry, myeloid cell marker (100 tests) |
| PE Mouse IgG1, κ Isotype Control | BD Biosciences, San Diego, USA | 555749 | Flow cytometry, isotype control for CD11b (100 tests) |
| PE-Cy 5 Mouse Anti-Human CD206 | BD Pharmingen, San Diego, USA | 551136 | Flow cytometry, M2 marker (100 tests) |
| PE-Cy 5 Mouse IgG1 κ Isotype Control | BD Pharmingen, San Diego, USA | 555750 | Flow cytometry, isotype control for CD206 (100 tests) |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma, St. Louis, USA | P8139 | |
| Powerpette Plus pipettor | VWR, Radnor, USA | 75856-448 | |
| Precision Water bath (model 183) | Precision Scientific, Chicago, USA | 66551 | |
| RPMI-1640 Medium | ATCC, Manassas, USA | 30-2001 | |
| THP-1 cell line, American Type Culture Collection (ATCC) | ATCC, Manassas, USA | TIB-202 |
References
- Zhang, R., et al. Cancer-associated fibroblasts enhance tumor-associated macrophages enrichment and suppress NK cells function in colorectal cancer. Cell Death and Disease. 10 (4), 273 (2019).
- Wang, J., Li, D., Cang, H., Guo, B. Crosstalk between cancer and immune cells: Role of tumor-associated macrophages in the tumor microenvironment. Cancer Medicine. 8 (10), 4709-4721 (2019).
- Soncin, I., et al. The tumor microenvironment creates a niche for the self-renewal of tumor-promoting macrophages in colon adenoma. Nature Communications. 9 (1), 582 (2018).
- Mosser, D. M., Edwards, J. P. Exploring the full spectrum of macrophage activation. Nature Reviews Immunology. 8 (12), 958-969 (2008).
- Mazzone, M., Menga, A., Castegna, A. Metabolism and TAM functions-it takes two to tango. Federation of European Biochemical Societies Journal. 285 (4), 700-716 (2018).
- Eum, H. H., et al. Tumor-promoting macrophages prevail in malignant ascites of advanced gastric cancer. Experimental and Molecular Medicine. 52 (12), 1976-1988 (2020).
- Qian, B. Z., Pollard, J. W. Macrophage diversity enhances tumor progression and metastasis. Cell. 141 (1), 39-51 (2010).
- Scheurlen, K. M., Billeter, A. T., O’Brien, S. J., Galandiuk, S. Metabolic dysfunction and early-onset colorectal cancer – how macrophages build the bridge. Cancer Medicine. 9 (18), 6679-6693 (2020).
- Bosshart, H., Heinzelmann, M. THP-1 cells as a model for human monocytes. Annals of Translational Medicine. 4 (21), 438 (2016).
- . The American Type Culture Collection (ATCC) Available from: https://www.atcc.org/products/all/TIB-202.aspx#generalinformation (2021)
- Baxter, E. W., et al. Standardized protocols for differentiation of THP-1 cells to macrophages with distinct M(IFNgamma+LPS), M(IL-4), and M(IL-10) phenotypes. Journal of Immunological Methods. 478, 112721 (2020).
- Genin, M., Clement, F., Fattaccioli, A., Raes, M., Michiels, C. M1 and M2 macrophages derived from THP-1 cells differentially modulate the response of cancer cells to etoposide. BMC Cancer. 15, 577 (2015).
- Starr, T., Bauler, T. J., Malik-Kale, P., Steele-Mortimer, O. The phorbol 12-myristate-13-acetate differentiation protocol is critical to the interaction of THP-1 macrophages with Salmonella Typhimurium. PLoS One. 13 (3), 0193601 (2018).
- Lund, M. E., To, J., O’Brien, B. A., Donnelly, S. The choice of phorbol 12-myristate 13-acetate differentiation protocol influences the response of THP-1 macrophages to a pro-inflammatory stimulus. Journal of Immunological Methods. 430, 64-70 (2016).
- Yin, Z., et al. IL-6/STAT3 pathway intermediates M1/M2 macrophage polarization during the development of hepatocellular carcinoma. Journal of Cellular Biochemistry. 119 (11), 9419-9432 (2018).
- O’Neill, L. A. J., Artyomov, M. N. Itaconate: the poster child of metabolic reprogramming in macrophage function. Nature Reviews Immunology. 19 (5), 273-281 (2019).
- Luig, M., et al. Inflammation-induced IL-6 functions as a natural brake on macrophages and limits gn. Journal of the American Society of Nephrology. 26 (7), 1597-1607 (2015).
- Maruyama, K., Nemoto, E., Yamada, S. Mechanical regulation of macrophage function – cyclic tensile force inhibits NLRP3 inflammasome-dependent IL-1beta secretion in murine macrophages. Inflammation and Regeneration. 39, 3 (2019).
- Gatto, F., et al. PMA-Induced THP-1 Macrophage Differentiation is Not Impaired by Citrate-Coated Platinum Nanoparticles. Nanomaterials (Basel). 7 (10), (2017).
- Maess, M. B., Wittig, B., Cignarella, A., Lorkowski, S. Reduced PMA enhances the responsiveness of transfected THP-1 macrophages to polarizing stimuli. Journal of Immunological Methods. 402 (1-2), 76-81 (2014).
- Daigneault, M., Preston, J. A., Marriott, H. M., Whyte, M. K., Dockrell, D. H. The identification of markers of macrophage differentiation in PMA-stimulated THP-1 cells and monocyte-derived macrophages. PLoS One. 5 (1), 8668 (2010).
- Raggi, F., et al. Regulation of human macrophage M1-M2 polarization balance by hypoxia and the triggering receptor expressed on myeloid cells-1. Frontiers in Immunology. 8, 11097 (2017).
- Neutelings, T., Lambert, C. A., Nusgens, B. V., Colige, A. C. Effects of mild cold shock (25 degrees C) followed by warming up at 37 degrees C on the cellular stress response. PLoS One. 8 (7), 69687 (2013).
- Kurashina, Y., et al. Enzyme-free release of adhered cells from standard culture dishes using intermittent ultrasonic traveling waves. Communications Biology. 2, 393 (2019).
- Chen, S., So, E. C., Strome, S. E., Zhang, X. Impact of Detachment Methods on M2 Macrophage Phenotype and Function. Journal of Immunological Methods. 426, 56-61 (2015).
- Bailey, J. D., et al. Isolation and culture of murine bone marrow-derived macrophages for nitric oxide and redox biology. Nitric Oxide. 100-101, 17-29 (2020).
