Différenciation et polarisation des macrophages en un phénotype de type M2 à l’aide d’une lignée cellulaire de leucémie THP-1 semblable à un monocyte humain
Summary
Les macrophages associés aux tumeurs de type M2 (TAM) sont associés à la progression tumorale et à un mauvais pronostic dans le cancer. Ce protocole sert de guide détaillé pour différencier et polariser de manière reproductible les cellules monocytaires THP-1 en macrophages de type M2 dans les 14 jours. Ce modèle est la base pour étudier les effets anti-inflammatoires du TAM dans le microenvironnement tumoral.
Abstract
Les macrophages associés aux tumeurs (TAM) peuvent changer leur expression et leur profil de cytokines en fonction de stimuli externes. Cette plasticité remarquable permet à TAM de s’adapter aux changements en cours dans le microenvironnement tumoral. Les macrophages peuvent avoir des attributs principalement pro-inflammatoires (de type M1) ou anti-inflammatoires (de type M2) et peuvent basculer continuellement entre ces deux états principaux. Les macrophages de type M2 dans l’environnement tumoral sont associés à la progression du cancer et à un mauvais pronostic dans plusieurs types de cancer. De nombreuses méthodes différentes pour induire la différenciation et la polarisation des cellules THP-1 sont utilisées pour étudier les mécanismes cellulaires et intercellulaires et les effets du TAM dans le microenvironnement des tumeurs. À l’heure actuelle, il n’existe aucun modèle établi pour la polarisation des macrophages de type M2 utilisant la lignée cellulaire THP-1, et les résultats de l’expression et des profils de cytokines des macrophages dus à certains stimuli in vitro varient d’une étude à l’autre. Ce protocole sert de guide détaillé pour différencier les cellules de type monocyte THP-1 en macrophages M0 et pour polariser davantage les cellules en un phénotype de type M2 dans les 14 jours. Nous démontrons les changements morphologiques des cellules de type monocytaire THP-1, des macrophages différenciés et des macrophages polarisés de type M2 à l’aide de la microscopie optique. Ce modèle est à la base de modèles de lignées cellulaires étudiant les effets anti-inflammatoires du TAM et leurs interactions avec d’autres populations cellulaires du microenvironnement tumoral.
Introduction
Les macrophages associés aux tumeurs (TAM) et leur rôle dans l’inflammation chronique, l’apparition du cancer et le développement de tumeurs sont des cibles importantes dans les recherches récentes1,2. Les monocytes du sang périphérique qui sont recrutés dans le microenvironnement tissulaire de la tumeur en développement se différencient en macrophages et peuvent être polarisés en deux sous-types principaux de macrophages3. Le macrophage activé classiquement représente le phénotype de type M1 principalement pro-inflammatoire et le sous-type de type M2 activé alternativement présente principalement des caractéristiques anti-inflammatoires4. Les macrophages peuvent basculer dynamiquement entre ces deux phénotypes principaux en fonction de leur métabolisme cellulaire, les sous-types intermédiaires ayant à la fois des attributs inflammatoires et anti-inflammatoires5. TAM représente une population hétérogène des deux phénotypes. Une fonction favorisant la tumeur et un mauvais pronostic dans différents types de cancers sont cependant particulièrement associés aux macrophages de type M26,7,8.
Les profils fonctionnels des macrophages et leur interaction avec d’autres cellules dans le microenvironnement tumoral sont complexes et difficiles à capturer dans un environnement en constante évolution pendant le développement continu de la tumeur. Les lignées cellulaires peuvent fournir une population cellulaire homogène avec une viabilité stable en culture, ce qui peut faciliter le processus de démonstration de mécanismes cellulaires et intercellulaires définis. La lignée cellulaire THP-1 de type monocyte est un système modèle légitime pour les monocytes humains primaires9. Cette lignée cellulaire spontanément immortalisée a été obtenue à partir du sang périphérique d’un nourrisson d’un an atteint de leucémie monocytaire aiguë9,10. La différenciation et la polarisation des cellules THP-1 ont été rapportées par plusieurs études et ont été réalisées de multiples manières différentes11,12,13,14. L’activation et, par conséquent, la polarisation des macrophages en un phénotype de type M1 est suivie d’un mécanisme de rebond anti-inflammatoire compensatoire, favorisant un phénotype de type M2 à travers des cytokines produites par des macrophages inflammatoires, tels que l’interleukine 6 (IL-6) ou l’itaconate15,16. Cela pourrait servir de mécanisme de rupture pour atténuer une réponse inflammatoire de dépassement après l’activation cellulaire17. Le processus de différenciation et de polarisation des monocytes et des cellules de type monocyte THP-1 en un phénotype anti-inflammatoire de type M2 s’accompagne lui-même de stimuli pro-inflammatoires qui doivent être surmontés. Une réponse inflammatoire aux cytokines peut être causée par un stress mécanique18, tel que le changement de milieu pour réalimenter les cellules, ou l’ajout de composés chimiques pour différencier les cellules THP-1, tels que le phorbol 12-myristate 13-acétate (PMA), et induire la production de facteur de nécrose tumorale α (TNFα), interleukine 1β (IL-1β) ou IL-619. Cette altération du profil d’expression des cytokines en réponse à la PMA peut affecter et prévenir la polarisation ultérieure des macrophages20. Des périodes de repos adéquates, comme indiqué précédemment après le traitement par PMA, permettent à ces réponses inflammatoires de diminuer et facilitent la polarisation cellulaire en un phénotype 21 distinct de typeM2.
Ce protocole démontre une méthode pour différencier et polariser les cellules de type monocytaire THP-1 en un phénotype de macrophages de type M2 dans les 14 jours.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ce protocole sur la différenciation et la polarisation des cellules monocytaires THP-1 dans les 14 jours fournit une méthode pour obtenir des macrophages avec un phénotype distinct de type M2 en raison d’une longue incubation de cellules avec des périodes de repos adéquates entre les étapes.
Certaines étapes sont essentielles à ce protocole. Le temps de doublement des monocytes THP-1 est d’environ 26 h. Les cellules peuvent être divisées à une densité cellulaire de 9 x 105…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Le Price Institute of Surgical Research de l’Université de Louisville est soutenu financièrement par le John W. Price and Barbara Thruston Atwood Price Trust. Les sources de financement n’ont joué aucun rôle dans la conception et la réalisation de l’étude ainsi que dans la collecte, la gestion, l’analyse et l’interprétation des données.
Materials
| 0.4% trypan blue | VWR, Radnor, USA | 152-5061 | |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | USA Scientific, Ocala, USA | 1615-5510 | |
| 10 mL serological pipet | VWR, Radnor, USA | 89130-898 | |
| 1000 μL TipOne pipet tips | USA Scientific, Ocala, USA | 1111-2821 | |
| 15 mL Centrifuge tube | VWR, Radnor, USA | 89039-664 | |
| 20 μL TipOne pipet tips | USA Scientific, Ocala, USA | 1120-1810 | |
| 200 μL TipOne pipet tips | USA Scientific, Ocala, USA | 1120-8810 | |
| 25 mL serological pipet | VWR, Radnor, USA | 89130-900 | |
| 5 mL serological pipet | VWR, Radnor, USA | 89130-896 | |
| 50 mL Centrifuge tube | VWR, Radnor, USA | 89039-662 | |
| Accutase solution 500 mL | Sigma, St. Louis, USA | A6964 | |
| Antibiotic Antimycotic Solution (100x), stabilized | Sigma, St. Louis, USA | A5955-100 mL | with 10,000 units penicillin, 10 mg of streptomycin and 25 μg of amphotericin B per mL, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture |
| Binder CO2 Incubator | VWR, Radnor, USA | C170-ULE3 | |
| CytoOne T-75cm flask with filter cap | USA Scientific, Ocala, USA | CC7682-4875 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma, St. Louis, USA | D8537-500 mL | PBS without calcium chloride and magnesium chloride should be used, since both can alter macrophage polarization |
| Eppendorf Centrifuge 5804 R (refrigerated) | Eppendorf, Enfield, USA | – | |
| Ethyl alcohol (70%) | – | – | |
| FACSCalibur flow cytometer | BD Biosciences, San Diego, USA | – | The flow cytometer operates with CellQuest software (BD Biosciences) |
| Falcon 24-well plate | VWR, Radnor, USA | 353504 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | ATCC, Manassas, USA | 30-2020 | |
| FITC Mouse Anti-Human CD14 | BD Biosciences, San Diego, USA | 555397 | Flow cytometry, myeloid cell marker (100 tests) |
| FITC Mouse Anti-Human CD80 | BD Pharmingen, San Diego, USA | 557226 | Flow cytometry, M1 marker (100 tests) |
| FITC Mouse IgG1 κ Isotype Control | BD Pharmingen, San Diego, USA | 555748 | Flow cytometry, isotype control for CD80 (100 tests) |
| FITC Mouse IgG2a, κ Isotype Control | BD Biosciences, San Diego, USA | 553456 | Flow cytometry, isotype control for CD14 (100 tests) |
| Human BD Fc Block | BD Biosciences, San Diego, USA | 564220 | Flow cytometry, Fc block (0.25 mg) |
| Human interleukin 13 (IL-13) | R&D, Minneapolis, USA | IL-771-10 μg | |
| Human interleukin 4 (IL-4) | R&D, Minneapolis, USA | SRP3093-20 μg | |
| Labconco Biosafety Cabinet (Delta Series 36212/36213) | Labconco, Kansas City, USA | – | |
| L-Glutamine Solution, 200 mM | ATCC, Manassas, USA | 30-2214 | |
| Lipopolysaccharide (LPS) from E. coli 0111:B4 | Sigma, St. Louis, USA | L2630-100 mg | |
| Mini Cell Scrapers | Biotium, Fremont, USA | 22003 | |
| Neubauer hemocytometer | Fisher Scientific, Waltham, USA | 02-671-5 | |
| Nikon Eclipse inverted microscope TS100 | Nikon, Melville, USA | – | |
| Nuclease-free water | Invitrogen, Carlsbad, USA | AM9937 | |
| Olympus Light Microscope RH-2 | Microscope Central, Feasterville, USA | 40888 | |
| P10 variable pipet- Gilson | VWR, Radnor, USA | 76180-014 | |
| P1000 variable pipet-Gilson | VWR, Radnor, USA | 76177-990 | |
| P200 variable pipet- Gilson | VWR, Radnor, USA | 76177-988 | |
| PE Mouse Anti-Human CD11b | BD Biosciences, San Diego, USA | 555388 | Flow cytometry, myeloid cell marker (100 tests) |
| PE Mouse IgG1, κ Isotype Control | BD Biosciences, San Diego, USA | 555749 | Flow cytometry, isotype control for CD11b (100 tests) |
| PE-Cy 5 Mouse Anti-Human CD206 | BD Pharmingen, San Diego, USA | 551136 | Flow cytometry, M2 marker (100 tests) |
| PE-Cy 5 Mouse IgG1 κ Isotype Control | BD Pharmingen, San Diego, USA | 555750 | Flow cytometry, isotype control for CD206 (100 tests) |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma, St. Louis, USA | P8139 | |
| Powerpette Plus pipettor | VWR, Radnor, USA | 75856-448 | |
| Precision Water bath (model 183) | Precision Scientific, Chicago, USA | 66551 | |
| RPMI-1640 Medium | ATCC, Manassas, USA | 30-2001 | |
| THP-1 cell line, American Type Culture Collection (ATCC) | ATCC, Manassas, USA | TIB-202 |
References
- Zhang, R., et al. Cancer-associated fibroblasts enhance tumor-associated macrophages enrichment and suppress NK cells function in colorectal cancer. Cell Death and Disease. 10 (4), 273 (2019).
- Wang, J., Li, D., Cang, H., Guo, B. Crosstalk between cancer and immune cells: Role of tumor-associated macrophages in the tumor microenvironment. Cancer Medicine. 8 (10), 4709-4721 (2019).
- Soncin, I., et al. The tumor microenvironment creates a niche for the self-renewal of tumor-promoting macrophages in colon adenoma. Nature Communications. 9 (1), 582 (2018).
- Mosser, D. M., Edwards, J. P. Exploring the full spectrum of macrophage activation. Nature Reviews Immunology. 8 (12), 958-969 (2008).
- Mazzone, M., Menga, A., Castegna, A. Metabolism and TAM functions-it takes two to tango. Federation of European Biochemical Societies Journal. 285 (4), 700-716 (2018).
- Eum, H. H., et al. Tumor-promoting macrophages prevail in malignant ascites of advanced gastric cancer. Experimental and Molecular Medicine. 52 (12), 1976-1988 (2020).
- Qian, B. Z., Pollard, J. W. Macrophage diversity enhances tumor progression and metastasis. Cell. 141 (1), 39-51 (2010).
- Scheurlen, K. M., Billeter, A. T., O’Brien, S. J., Galandiuk, S. Metabolic dysfunction and early-onset colorectal cancer – how macrophages build the bridge. Cancer Medicine. 9 (18), 6679-6693 (2020).
- Bosshart, H., Heinzelmann, M. THP-1 cells as a model for human monocytes. Annals of Translational Medicine. 4 (21), 438 (2016).
- . The American Type Culture Collection (ATCC) Available from: https://www.atcc.org/products/all/TIB-202.aspx#generalinformation (2021)
- Baxter, E. W., et al. Standardized protocols for differentiation of THP-1 cells to macrophages with distinct M(IFNgamma+LPS), M(IL-4), and M(IL-10) phenotypes. Journal of Immunological Methods. 478, 112721 (2020).
- Genin, M., Clement, F., Fattaccioli, A., Raes, M., Michiels, C. M1 and M2 macrophages derived from THP-1 cells differentially modulate the response of cancer cells to etoposide. BMC Cancer. 15, 577 (2015).
- Starr, T., Bauler, T. J., Malik-Kale, P., Steele-Mortimer, O. The phorbol 12-myristate-13-acetate differentiation protocol is critical to the interaction of THP-1 macrophages with Salmonella Typhimurium. PLoS One. 13 (3), 0193601 (2018).
- Lund, M. E., To, J., O’Brien, B. A., Donnelly, S. The choice of phorbol 12-myristate 13-acetate differentiation protocol influences the response of THP-1 macrophages to a pro-inflammatory stimulus. Journal of Immunological Methods. 430, 64-70 (2016).
- Yin, Z., et al. IL-6/STAT3 pathway intermediates M1/M2 macrophage polarization during the development of hepatocellular carcinoma. Journal of Cellular Biochemistry. 119 (11), 9419-9432 (2018).
- O’Neill, L. A. J., Artyomov, M. N. Itaconate: the poster child of metabolic reprogramming in macrophage function. Nature Reviews Immunology. 19 (5), 273-281 (2019).
- Luig, M., et al. Inflammation-induced IL-6 functions as a natural brake on macrophages and limits gn. Journal of the American Society of Nephrology. 26 (7), 1597-1607 (2015).
- Maruyama, K., Nemoto, E., Yamada, S. Mechanical regulation of macrophage function – cyclic tensile force inhibits NLRP3 inflammasome-dependent IL-1beta secretion in murine macrophages. Inflammation and Regeneration. 39, 3 (2019).
- Gatto, F., et al. PMA-Induced THP-1 Macrophage Differentiation is Not Impaired by Citrate-Coated Platinum Nanoparticles. Nanomaterials (Basel). 7 (10), (2017).
- Maess, M. B., Wittig, B., Cignarella, A., Lorkowski, S. Reduced PMA enhances the responsiveness of transfected THP-1 macrophages to polarizing stimuli. Journal of Immunological Methods. 402 (1-2), 76-81 (2014).
- Daigneault, M., Preston, J. A., Marriott, H. M., Whyte, M. K., Dockrell, D. H. The identification of markers of macrophage differentiation in PMA-stimulated THP-1 cells and monocyte-derived macrophages. PLoS One. 5 (1), 8668 (2010).
- Raggi, F., et al. Regulation of human macrophage M1-M2 polarization balance by hypoxia and the triggering receptor expressed on myeloid cells-1. Frontiers in Immunology. 8, 11097 (2017).
- Neutelings, T., Lambert, C. A., Nusgens, B. V., Colige, A. C. Effects of mild cold shock (25 degrees C) followed by warming up at 37 degrees C on the cellular stress response. PLoS One. 8 (7), 69687 (2013).
- Kurashina, Y., et al. Enzyme-free release of adhered cells from standard culture dishes using intermittent ultrasonic traveling waves. Communications Biology. 2, 393 (2019).
- Chen, S., So, E. C., Strome, S. E., Zhang, X. Impact of Detachment Methods on M2 Macrophage Phenotype and Function. Journal of Immunological Methods. 426, 56-61 (2015).
- Bailey, J. D., et al. Isolation and culture of murine bone marrow-derived macrophages for nitric oxide and redox biology. Nitric Oxide. 100-101, 17-29 (2020).
