एम 2 जैसे ट्यूमर से जुड़े मैक्रोफेज (टैम) कैंसर में ट्यूमर प्रगति और खराब पूर्वानुमान से जुड़े होते हैं। यह प्रोटोकॉल 14 दिनों के भीतर एम 2-जैसे मैक्रोफेज में टीएचपी-1 मोनोसाइट जैसी कोशिकाओं को पुन: अंतर और ध्रुवीकरण करने के लिए एक विस्तृत गाइड के रूप में कार्य करता है। यह मॉडल ट्यूमर माइक्रोएनवायरमेंट के भीतर टैम के विरोधी भड़काऊ प्रभावों की जांच करने का आधार है।
ट्यूमर से जुड़े मैक्रोफेज (टैम) बाहरी उत्तेजनाओं के अनुसार अपनी अभिव्यक्ति और साइटोकिन प्रोफाइल को स्विच कर सकते हैं। यह उल्लेखनीय प्लास्टिसिटी टैम को ट्यूमर माइक्रोएनवायरमेंट के भीतर चल रहे बदलावों के अनुकूल बनाने में सक्षम बनाता है। मैक्रोफेज में मुख्य रूप से प्रो-भड़काऊ (एम 1-लाइक) या एंटी-भड़काऊ (एम 2-जैसे) विशेषताएं हो सकती हैं और इन दो मुख्य राज्यों के बीच लगातार स्विच कर सकते हैं। ट्यूमर वातावरण के भीतर M2-जैसे मैक्रोफेज कैंसर की प्रगति और कैंसर के कई प्रकार में गरीब पूर्वानुमान के साथ जुड़े रहे हैं । THP-1 कोशिकाओं के भेदभाव और ध्रुवीकरण को प्रेरित करने के लिए कई अलग-अलग तरीकों का उपयोग सेलुलर और अंतरकोशिकीय तंत्र और ट्यूमर के माइक्रोएनवायरमेंट के भीतर टैम के प्रभावों की जांच करने के लिए किया जाता है। वर्तमान में, टीएचपी-1 सेल लाइन का उपयोग करके एम 2-जैसे मैक्रोफेज ध्रुवीकरण के लिए कोई स्थापित मॉडल नहीं है, और कुछ इन विट्रो स्टिमुली के कारण मैक्रोफेज की अभिव्यक्ति और साइटोकिन प्रोफाइल के परिणाम अध्ययनों के बीच भिन्न होते हैं। यह प्रोटोकॉल M0 मैक्रोफेज में THP-1 मोनोसाइट जैसी कोशिकाओं को अलग करने और 14 दिनों के भीतर M2-जैसे फेनोटाइप में कोशिकाओं को आगे ध्रुवीकृत करने के लिए विस्तृत मार्गदर्शन के रूप में कार्य करता है। हम हल्के माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके टीएचपी-1 मोनोसाइट जैसी कोशिकाओं, विभेदित मैक्रोफेज और ध्रुवीकृत एम 2-जैसे मैक्रोफेज के रूपात्मक परिवर्तनों को प्रदर्शित करते हैं। यह मॉडल टैम के विरोधी भड़काऊ प्रभावों और ट्यूमर माइक्रोएनवायरमेंट के अन्य सेल आबादी के साथ उनकी बातचीत की जांच करने वाले सेल लाइन मॉडल का आधार है।
ट्यूमर से जुड़े मैक्रोफेज (टैम) और पुरानी सूजन में उनकी भूमिका, कैंसर की शुरुआत, और ट्यूमर विकास हाल के शोध1,2में महत्वपूर्ण लक्ष्य हैं । परिधीय रक्त मोनोसाइट्स जो विकासशील ट्यूमर के ऊतक माइक्रोएनवायरमेंट में भर्ती होते हैं , मैक्रोफेज में अंतर करते हैं और उन्हें मैक्रोफेज3के दो मुख्य उपप्रकारों में ध्रुवीकृत किया जा सकता है। शास्त्रीय रूप से सक्रिय मैक्रोफेज मुख्य रूप से समर्थक भड़काऊ एम 1-जैसे फेनोटाइप का प्रतिनिधित्व करता है और वैकल्पिक रूप से सक्रिय M2-जैसे उपप्रकार मुख्य रूप से विरोधी भड़काऊ विशेषताओं को दर्शाता है4। मैक्रोफेज अपने सेलुलर मेटाबॉलिज्म के आधार पर इन दो मुख्य फेनोटाइप के बीच गतिशील रूप से स्विच कर सकते हैं, जिसमें मध्यवर्ती उपप्रकारों में भड़काऊ और विरोधी दोनों गुण होते हैं5। टैम दोनों फेनोटाइप की विषम आबादी का प्रतिनिधित्व करता है। हालांकि, विभिन्न प्रकार के कैंसर में ट्यूमर को बढ़ावा देने वाला कार्य और खराब पूर्वानुमान विशेष रूप से एम 2-जैसे मैक्रोफेज6,7,8से जुड़ा हुआ है।
मैक्रोफेज के कार्यात्मक प्रोफाइल और ट्यूमर माइक्रोएनवायरमेंट के भीतर अन्य कोशिकाओं के साथ उनकी बातचीत जटिल और चल रहे ट्यूमर विकास के दौरान लगातार बदलते वातावरण में कब्जा करने के लिए चुनौतीपूर्ण हैं। सेल लाइनें संस्कृति में स्थिर व्यवहार्यता के साथ एक समरूप सेल आबादी प्रदान कर सकती हैं, जो परिभाषित सेलुलर और अंतरकोशिकीय तंत्र का प्रदर्शन करने की प्रक्रिया को सुविधाजनक बना सकती है। मोनोसाइट की तरह टीएचपी-1 सेल लाइन प्राथमिक मानव मोनोसाइट्स9के लिए एक वैध मॉडल प्रणाली है। यह अनायास अमर कोशिका रेखा एक साल के शिशु के परिधीय रक्त से प्राप्त की गई हैजिसमेंतीव्र मोनोसाइटिक ल्यूकेमिया9,10है । टीएचपी -1 कोशिकाओं के विभेदन और ध्रुवीकरण की सूचना कई अध्ययनों द्वारा दी गई है और इसे कई अलग – अलग तरीकों से किया गया है11,12,13,14. सक्रियण और, इसलिए, एम 1-जैसे फेनोटाइप में मैक्रोफेज के ध्रुवीकरण के बाद एक प्रतिपूरक विरोधी भड़काऊ खुशहाली लौटने लगी तंत्र है, जो भड़काऊ मैक्रोफेज द्वारा उत्पादित साइटोकिन्स के माध्यम से एम 2-जैसे फेनोटाइप को बढ़ावा देता है, जैसे इंटरल्यूकिन 6 (आईएल-6) या इटाकोनेट15,16। यह सेल एक्टिवेशन17के बाद एक ओवरशूटिंग भड़काऊ प्रतिक्रिया को कम करने के लिए एक ब्रेक मैकेनिज्म के रूप में काम कर सकता है । मोनोसाइट्स और टीएचपी-1 मोनोसाइट जैसी कोशिकाओं को विरोधी भड़काऊ M2-जैसे फेनोटाइप में अंतर और ध्रुवीकरण करने की प्रक्रिया भी समर्थक भड़काऊ उत्तेजनाओं के साथ है जिसे दूर किया जाना चाहिए। एक भड़काऊ साइटोकिन प्रतिक्रिया यांत्रिक तनाव18के कारण हो सकती है, जैसे कि कोशिकाओं को फिर से स्तनपान कराने के लिए मीडिया बदलना, या टीएचपी-1 कोशिकाओं में अंतर करने के लिए रासायनिक यौगिकों को जोड़ना, जैसे कि फरबोल 12-myristate 13-एसीटेट (पीएमए), और ट्यूमर नेक्रोसिस फैक्टर α (TNFα), इंटरल्यूकिन 1ο (IL-1) या आईएल-619के उत्पादन को प्रेरित करता है। पीएमए की प्रतिक्रिया के रूप में यह परिवर्तित साइटोकिन अभिव्यक्ति प्रोफाइल बाद में मैक्रोफेज ध्रुवीकरणकोप्रभावित और रोक सकता है । पर्याप्त आराम अवधि, जैसा कि पीएमए उपचार के बाद पहले बताया गया है, इन भड़काऊ प्रतिक्रियाओं को कम करने और सेल ध्रुवीकरण को एक अलग M2-जैसे फेनोटाइप21में सुविधाजनक बनाने की अनुमति देता है।
यह प्रोटोकॉल 14 दिनों के भीतर मैक्रोफेज के M2-जैसे फेनोटाइप में टीएचपी-1 मोनोसाइट जैसी कोशिकाओं में अंतर और ध्रुवीकरण करने की एक विधि को दर्शाता है।
14 दिनों के भीतर टीएचपी-1 मोनोसाइट जैसी कोशिकाओं को अलग करने और ध्रुवीकरण करने पर यह प्रोटोकॉल चरणों के बीच पर्याप्त आराम अवधि के साथ कोशिकाओं के लंबे उपचार इनक्यूबेशन के कारण एक अलग M2-जैसे फेनोटाइप के स?…
The authors have nothing to disclose.
प्राइस इंस्टीट्यूट ऑफ सर्जिकल रिसर्च, यूनिवर्सिटी ऑफ लुइसविले को जॉन डब्ल्यू प्राइस और बारबरा थ्रस्टर एटवुड प्राइस ट्रस्ट द्वारा आर्थिक रूप से सपोर्ट किया जाता है । वित्तपोषण स्रोतों के डिजाइन और अध्ययन के संचालन के साथ ही संग्रह, प्रबंधन, विश्लेषण, और डेटा की व्याख्या में कोई भूमिका नहीं थी ।
0.4% trypan blue | VWR, Radnor, USA | 152-5061 | |
1.5 mL microcentrifuge tube | USA Scientific, Ocala, USA | 1615-5510 | |
10 mL serological pipet | VWR, Radnor, USA | 89130-898 | |
1000 μL TipOne pipet tips | USA Scientific, Ocala, USA | 1111-2821 | |
15 mL Centrifuge tube | VWR, Radnor, USA | 89039-664 | |
20 μL TipOne pipet tips | USA Scientific, Ocala, USA | 1120-1810 | |
200 μL TipOne pipet tips | USA Scientific, Ocala, USA | 1120-8810 | |
25 mL serological pipet | VWR, Radnor, USA | 89130-900 | |
5 mL serological pipet | VWR, Radnor, USA | 89130-896 | |
50 mL Centrifuge tube | VWR, Radnor, USA | 89039-662 | |
Accutase solution 500 mL | Sigma, St. Louis, USA | A6964 | |
Antibiotic Antimycotic Solution (100x), stabilized | Sigma, St. Louis, USA | A5955-100 mL | with 10,000 units penicillin, 10 mg of streptomycin and 25 μg of amphotericin B per mL, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture |
Binder CO2 Incubator | VWR, Radnor, USA | C170-ULE3 | |
CytoOne T-75cm flask with filter cap | USA Scientific, Ocala, USA | CC7682-4875 | |
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma, St. Louis, USA | D8537-500 mL | PBS without calcium chloride and magnesium chloride should be used, since both can alter macrophage polarization |
Eppendorf Centrifuge 5804 R (refrigerated) | Eppendorf, Enfield, USA | – | |
Ethyl alcohol (70%) | – | – | |
FACSCalibur flow cytometer | BD Biosciences, San Diego, USA | – | The flow cytometer operates with CellQuest software (BD Biosciences) |
Falcon 24-well plate | VWR, Radnor, USA | 353504 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | ATCC, Manassas, USA | 30-2020 | |
FITC Mouse Anti-Human CD14 | BD Biosciences, San Diego, USA | 555397 | Flow cytometry, myeloid cell marker (100 tests) |
FITC Mouse Anti-Human CD80 | BD Pharmingen, San Diego, USA | 557226 | Flow cytometry, M1 marker (100 tests) |
FITC Mouse IgG1 κ Isotype Control | BD Pharmingen, San Diego, USA | 555748 | Flow cytometry, isotype control for CD80 (100 tests) |
FITC Mouse IgG2a, κ Isotype Control | BD Biosciences, San Diego, USA | 553456 | Flow cytometry, isotype control for CD14 (100 tests) |
Human BD Fc Block | BD Biosciences, San Diego, USA | 564220 | Flow cytometry, Fc block (0.25 mg) |
Human interleukin 13 (IL-13) | R&D, Minneapolis, USA | IL-771-10 μg | |
Human interleukin 4 (IL-4) | R&D, Minneapolis, USA | SRP3093-20 μg | |
Labconco Biosafety Cabinet (Delta Series 36212/36213) | Labconco, Kansas City, USA | – | |
L-Glutamine Solution, 200 mM | ATCC, Manassas, USA | 30-2214 | |
Lipopolysaccharide (LPS) from E. coli 0111:B4 | Sigma, St. Louis, USA | L2630-100 mg | |
Mini Cell Scrapers | Biotium, Fremont, USA | 22003 | |
Neubauer hemocytometer | Fisher Scientific, Waltham, USA | 02-671-5 | |
Nikon Eclipse inverted microscope TS100 | Nikon, Melville, USA | – | |
Nuclease-free water | Invitrogen, Carlsbad, USA | AM9937 | |
Olympus Light Microscope RH-2 | Microscope Central, Feasterville, USA | 40888 | |
P10 variable pipet- Gilson | VWR, Radnor, USA | 76180-014 | |
P1000 variable pipet-Gilson | VWR, Radnor, USA | 76177-990 | |
P200 variable pipet- Gilson | VWR, Radnor, USA | 76177-988 | |
PE Mouse Anti-Human CD11b | BD Biosciences, San Diego, USA | 555388 | Flow cytometry, myeloid cell marker (100 tests) |
PE Mouse IgG1, κ Isotype Control | BD Biosciences, San Diego, USA | 555749 | Flow cytometry, isotype control for CD11b (100 tests) |
PE-Cy 5 Mouse Anti-Human CD206 | BD Pharmingen, San Diego, USA | 551136 | Flow cytometry, M2 marker (100 tests) |
PE-Cy 5 Mouse IgG1 κ Isotype Control | BD Pharmingen, San Diego, USA | 555750 | Flow cytometry, isotype control for CD206 (100 tests) |
Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma, St. Louis, USA | P8139 | |
Powerpette Plus pipettor | VWR, Radnor, USA | 75856-448 | |
Precision Water bath (model 183) | Precision Scientific, Chicago, USA | 66551 | |
RPMI-1640 Medium | ATCC, Manassas, USA | 30-2001 | |
THP-1 cell line, American Type Culture Collection (ATCC) | ATCC, Manassas, USA | TIB-202 |