Het bepalen van de toxiciteit van UV-straling en chemicaliën op primaire en onsterfelijke menselijke hoornvliesepitheelcellen
Summary
Dit artikel beschrijft de procedures die worden gebruikt om de toxiciteit van UV-straling en chemische toxines op een primaire en onsterfelijke cellijn te evalueren.
Abstract
Dit artikel beschrijft de methoden voor het meten van de toxiciteit van ultraviolette (UV) straling en oculaire toxines op primaire (pHCEC) en vereeuwigde (iHCEC) menselijke cornea-epitheelcelculturen. Cellen werden blootgesteld aan UV-straling en toxische doses benzalkoniumchloride (BAK), waterstofperoxide (H 2 O2) en natriumdodecylsulfaat (SDS). De metabole activiteit werd gemeten met behulp van een metabole test. De afgifte van inflammatoire cytokines werd gemeten met behulp van een multi-plex interleukine (IL)-1β, IL-6, IL-8 en tumornecrosefactor-alfa (TNF-α) assay, en cellen werden geëvalueerd op levensvatbaarheid met behulp van fluorescerende kleurstoffen.
De schadelijke effecten van UV op de metabole activiteit van cellen en de afgifte van cytokines traden op bij 5 minuten UV-blootstelling voor iHCEC en 20 minuten voor pHCEC. Vergelijkbare procentuele dalingen in metabole activiteit van de iHCEC en pHCEC traden op na blootstelling aan BAK, H 2 O2of SDS, en de meest significante veranderingen in cytokineafgifte traden op voor IL-6 en IL-8. Microscopie van fluorescerend gekleurde iHCEC- en pHCEC BAK-blootgestelde cellen toonde celdood bij 0,005% BAK-blootstelling, hoewel de mate van ethidiumkleuring groter was in de iHCECs dan pHCECs. Met behulp van meerdere methoden voor het beoordelen van toxische effecten met behulp van microscopie, beoordelingen van metabole activiteit en cytokineproductie, kon de toxiciteit van UV-straling en chemische toxines worden bepaald voor zowel primaire als onsterfelijke cellijnen.
Introduction
In vitro toxicologische studies worden uitgevoerd om de toxische effecten van chemicaliën en andere agentia te voorspellen die schade aan cellen kunnen veroorzaken. Bij de beoordeling van de toxiciteit voor het hoornvlies zijn menselijke cornea-epitheelcellen (HCEC’s) gebruikt in modellen voor het evalueren van deze effecten 1,2,3,4. Deze modellen evalueren meestal fysiologische effecten zoals veranderingen in de metabole activiteit van de cel, celproliferatie en andere celfuncties zoals de productie en afgifte van inflammatoire cytokines. Voor deze toxicologische studies zijn cellen uit verschillende bronnen geselecteerd om de schadelijke effecten van chemicaliën en UV-straling op HCECs 2,3 te beoordelen. pHCEC-lijnen zijn verkrijgbaar bij bedrijven die deze cellen leveren uit donorweefsels van volwassenen. Primaire cellen kunnen worden behandeld met dispase en voorzichtig van het hoornvlies worden geschraapt voor kweek5. De cellen worden vervolgens getest op virussen en besmetting en vervolgens gecryopreserveerd in 10% dimethylsulfoxide.
Het voordeel van primaire cellijnen is dat de cellen genetisch identiek zijn aan de cellen van de donor. Dit is ideaal, omdat een in vitro model het in vivo weefsel zoveel mogelijk moet nabootsen. Het nadeel van primaire cellijnen is dat ze een beperkt aantal celdelingen of passages hebben6. Het beperkte aantal beschikbare cellen beperkt het aantal experimenten dat kan worden uitgevoerd met een enkele primaire cultuur, waardoor de kosten van de experimenten stijgen.
Vereeuwigde cellijnen zijn ook gebruikt in celkweektoxiciteitsmodellen. In tegenstelling tot de primaire cellijn verkregen uit in vivo weefsel, is de vereeuwigde cellijn echter genetisch veranderd. Vereeuwigde cellen worden gemaakt door de genen van een virus op te nemen in het DNA van primaire cellen 6,7,8. Cellen met succesvolle virale genintegratie worden geselecteerd voor de vereeuwigde cellijn. Het voordeel van onsterfelijkheid is dat het onbeperkte snelle proliferatie mogelijk maakt, waardoor een onbeperkt aantal cellen meerdere experimenten kan uitvoeren met dezelfde cellijn. Dit zorgt voor consistentie tussen experimenten en verlaagt de kosten.
Naast veranderingen in de genen die de celproliferatie beperkten, konden ook veranderingen in de expressie van genen met kritische functionaliteit optreden9. Daarom is het nadeel van het gebruik van onsterfelijke cellen dat ze mogelijk niet langer de oorspronkelijke in vivo cellen vertegenwoordigen in termen van hun reactie op verschillende externe stimuli10. Vergelijkingen hebben betrekking op het observeren van de toxische effecten van chemicaliën op primaire en onsterfelijke menselijke corneale keratocyten11, evenals onsterfelijke HCECs en primaire cellen van konijnenhoornvliesepitheel12. De vergelijking tussen de effecten van toxines op primaire menselijke keratocyten en vereeuwigde keratocyten toonde geen significante verschillen11. Met behulp van de methoden die in dit artikel worden beschreven, zal de effectiviteit van deze testen om de toxiciteit van UV-straling en oculaire toxines op pHCECs en iHCECs te beoordelen, worden bepaald.
Drie oculaire toxines die vaak worden gebruikt in in vitro assays werden geselecteerd: BAK, H 2 O2en SDS. BAK is een kationisch conserveermiddel dat vaak wordt gebruikt in oogheelkundige oplossingen 13,14, H 2 O2wordt vaak gebruikt om contactlenzen te desinfecteren 15 en SDS is een anionogene oppervlakteactieve stof die wordt aangetroffen in detergentia en shampoos 14. Net als oculaire toxines kan UV-straling ook aanzienlijke schade aan HCECs3 veroorzaken. Bovendien kan overmatige blootstelling aan UV een oculaire aandoening veroorzaken die bekend staat als fotokeratitis en wordt gekenmerkt door symptomen van scheuren, lichtgevoeligheid en een gevoel van korreligheid16.
Er is een onbeperkt aantal primaire celculturen die kunnen worden gebruikt en verschillende vereeuwigde cellijnen die zijn ontwikkeld. Daarom werd een onderzoek uitgevoerd om primaire HCEC’s te vergelijken met een vereeuwigde HCEC-lijn om overeenkomsten en verschillen te bepalen tussen modellen die dit soort cellen bevatten.
Dit onderzoek gebruikte microscopie om mogelijke verschillen tussen pHCECs en iHCECs op celfysiologische respons op UV en toxines te beoordelen. De effecten van UV-straling en chemicaliën op de metabole activiteit van cellen en de inflammatoire cytokine-afgifte voor de twee cellijnen werden ook geëvalueerd. Het belang van het bepalen van de verschillen tussen de twee cellijnen is om het optimale gebruik van deze cellijnen te begrijpen voor het evalueren van: 1) het effect van UV-straling op cellen, 2) de effecten van toxines op cellen en 3) de resulterende veranderingen in metabolisme, levensvatbaarheid van cellen en celcytokine-afgifte voor toekomstige studies.
Protocol
Representative Results
Discussion
Potentiële verschillen in het gebruik van twee soorten HCEC’s werden beoordeeld. Cellen werden in hetzelfde medium (HOEM) geplaatst bij identieke concentraties cellen en vervolgens blootgesteld aan korte en lange perioden van UV-straling en drie oculaire toxines. Doses UV-straling en chemicaliën werden geselecteerd op basis van hun fysiologische effecten, die schadelijk genoeg waren voor de cellen om tussenliggende reacties te produceren die konden worden vergeleken. Blootstellingstijden van 5 en 20 min voor UV-stralin…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs ontvingen geen financiering voor dit werk.
Materials
| 75 cm2 Vented Flask | Corning | 354485 | This is the BioCoat brand, collagen-coated |
| 96 well plate | costar | 3370 | |
| alamarBlue | Fisher Scientific | dal 1025 | |
| Annexin Staining buffer solution | Invitrogen, Burlington, ON, Canada | ||
| Annexin V | Invitrogen, Burlington, ON, Canada | ||
| Axiovert 100 microscope with a Zeiss confocal laser scanning microscope 510 system | Carl Zeiss Inc., Germany | ||
| Corning 48 Well plates | Corning | 354505 | This is the BioCoat brand, collagen-coated |
| Cytation 5 | BioTek | CYT5MPV | Can read fluorescence from 280 – 700 nm (for assay 540/590) |
| Fetal Bovine Serum | Hycone | SH30396.03 | |
| glass bottom coverslips | MatTek Corporation, Ashland, MA, USA | ||
| Human Corneal Epithelial Cells | University of Ottawa | N/A | SV40-immortalized human corneal epithelial cells from Dr. M. Griffith (Ottawa Eye Research Institute, Ottawa, Canada) and have been characterized Griffith M, Osborne R, Munger R, Xiong X, Doillon CJ, Laycock NL, Hakim M, Song Y, Watsky MA. Functional human corneal equivalents constructed from cell lines. Science. 1999;286:2169-72. |
| Human Ocular Epithelia Media (HOEM) with the following supplements: | Millipore, Billerica, MA, USA | SCMC001 | Epigro base media supplemented with 6 mM L-Glutamine, 0.002% EpiFactor O (cell media supplement O in article) , 1.0 μM Epinephrine, 0.4% EpiFactor P (cell media supplement P in article), 5 μg/mL rh Insulin, 5 μg/mL Apo- Transferrin, and 100 ng/mL Hydrocortisone Hemisuccinate in Collagen-1 coated culture flasks (BioCoat, Corning, Tewksbury, MA, USA). |
| Live Dead calcien and ethidium homodimer | Invitrogen, Burlington, ON, Canada | ||
| MesoScale Discovery (MSD) QuickPlex SQ 120 instrument | Rockville, MD, USA | ||
| MSD Human Proinflammatory Panel II (4-Plex) V-Plex assay | Rockville, MD, USA | ||
| Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140-122 | 100x concentration so add 1 mL to each 99 mL of media |
| Primary Corneal Epithelial Cells | Millipore, Billerica, MA, USA | SCCE016 | |
| SpectraMax fluorescence multi-well plate reader | Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA | ||
| TrypLE Express (cell disassociation solution) | Fisher Scientific | 12605036 |
References
- McCanna, D. J., Harrington, K. L., Driot, J. Y., Ward, K. W., Tchao, R. Use of a human corneal epithelial cell line for screening the safety of contact lens care solutions in vitro. Eye & Contact Lens. 34 (1), 6-12 (2008).
- Xu, M., Sivak, J. G., McCanna, D. J. Comparison of the effects of ophthalmic solutions on human corneal epithelial cells using fluorescent dyes. Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics. 29 (9), 794-802 (2013).
- Youn, H. Y., McCanna, D. J., Sivak, J. G., Jones, L. W. In vitro ultraviolet-induced damage in human corneal, lens, and retinal pigment epithelial cells. Molecular Vision. 17, 237-246 (2011).
- Hakkarainen, J. J., et al. Acute cytotoxic effects of marketed ophthalmic formulations on human corneal epithelial cells. International Journal of Pharmaceutics. 511 (1), 73-78 (2016).
- Spurr, S. J., Gipson, I. K. Isolation of corneal epithelium with Dispase II or EDTA. Effects on the basement membrane zone. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 26 (6), 818-827 (1985).
- Kahn, C. R., Young, E., Lee, I. H., Rhim, J. S. Human corneal epithelial primary cultures and cell lines with extended life span: in vitro model for ocular studies. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 34 (12), 3429-3441 (1993).
- Araki-Sasaki, K., et al. An SV40-immortalized human corneal epithelial cell line and its characterization. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 36 (3), 614-621 (1995).
- Griffith, M., et al. Functional human corneal equivalents constructed from cell lines. Science. 286 (5447), 2169-2172 (1999).
- Toouli, C. D., et al. Comparison of human mammary epithelial cells immortalized by simian virus 40 T-Antigen or by the telomerase catalytic subunit. Oncogene. 21 (1), 128-139 (2002).
- Kaur, G., Dufour, J. M. Cell lines: Valuable tools or useless artifacts. Spermatogenesis. 2 (1), 1-5 (2012).
- Zorn-Kruppa, M., Tykhonova, S., Belge, G., Diehl, H. A., Engelke, M. Comparison of human corneal cell cultures in cytotoxicity testing. Altex. 21 (3), 129-134 (2004).
- Huhtala, A., et al. Comparison of an immortalized human corneal epithelial cell line and rabbit corneal epithelial cell culture in cytotoxicity testing. Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics. 18 (2), 163-175 (2002).
- Pisella, P. J., Fillacier, K., Elena, P. P., Debbasch, C., Baudouin, C. Comparison of the effects of preserved and unpreserved formulations of timolol on the ocular surface of albino rabbits. Ophthalmic Research. 32 (1), 3-8 (2000).
- Youn, H. Y., Moran, K. L., Oriowo, O. M., Bols, N. C., Sivak, J. G. Surfactant and UV-B-induced damage of the cultured bovine lens. Toxicology in vitro. 18 (6), 841-852 (2004).
- Hughes, R., Kilvington, S. Comparison of hydrogen peroxide contact lens disinfection systems and solutions against Acanthamoeba polyphaga. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 45 (7), 2038-2043 (2001).
- Delic, N. C., Lyons, J. G., Di Girolamo, N., Halliday, G. M. Damaging effects of ultraviolet radiation on the cornea. Photochemistry and Photobiology. 93 (4), 920-929 (2017).
- Ahuja, D., Saenz-Robles, M. T., Pipas, J. M. SV40 large T antigen targets multiple cellular pathways to elicit cellular transformation. Oncogene. 24 (52), 7729-7745 (2005).
- Tong, Y., et al. Pin1 inhibits PP2A-mediated Rb dephosphorylation in regulation of cell cycle and S-phase DNA damage. Cell Death & Disease. 6, 1640 (2015).
- Muller, P. A., Vousden, K. H. p53 mutations in cancer. Nature Cell Biology. 15 (1), 2-8 (2013).
- Seshacharyulu, P., Pandey, P., Datta, K., Batra, S. K. Phosphatase: PP2A structural importance, regulation and its aberrant expression in cancer. Cancer Letters. 335 (1), 9-18 (2013).
- Yang, D., Okamura, H., Morimoto, H., Teramachi, J., Haneji, T. Protein phosphatase 2A Calpha regulates proliferation, migration, and metastasis of osteosarcoma cells. Laboratory nvestigation; A Journal of Technical Methods and Pathology. 96 (10), 1050-1062 (2016).
- Xie, F., et al. Disruption and inactivation of the PP2A complex promotes the proliferation and angiogenesis of hemangioma endothelial cells through activating AKT and ERK. Oncotarget. 6 (28), 25660-25676 (2015).
- Mallet, J. D., Rochette, P. J. Wavelength-dependent ultraviolet induction of cyclobutane pyrimidine dimers in the human cornea. Photochemical & Photobiological Sciences. 12 (8), 1310-1318 (2013).
- Cejkova, J., Cejka, C. The role of oxidative stress in corneal diseases and injuries. Histology and Histopathology. 30 (8), 893-900 (2015).
- Wang, S. Q., Balagula, Y., Osterwalder, U. Photoprotection: a review of the current and future technologies. Dermatologic Therapy. 23 (1), 31-47 (2010).
- Svobodova, A. R., et al. DNA damage after acute exposure of mice skin to physiological doses of UVB and UVA light. Archives of Dermatological Research. 304 (5), 407-412 (2012).
- Kennedy, M., et al. Ultraviolet irradiation induces the production of multiple cytokines by human corneal cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 38 (12), 2483-2491 (1997).
- Kode, A., Yang, S. R., Rahman, I. Differential effects of cigarette smoke on oxidative stress and proinflammatory cytokine release in primary human airway epithelial cells and in a variety of transformed alveolar epithelial cells. Respiratory Research. 7, 132 (2006).
- Epstein, S. P., Chen, D., Asbell, P. A. Evaluation of biomarkers of inflammation in response to benzalkonium chloride on corneal and conjunctival epithelial cells. Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics. 25 (5), 415-424 (2009).
