일차 및 불멸화 된 인간 각막 상피 세포에 대한 UV 방사선 및 화학 물질의 독성 결정
Summary
이 기사에서는 1차 및 불멸화 세포주에서 UV 방사선 및 화학 독소의 독성을 평가하는 데 사용되는 절차를 설명합니다.
Abstract
이 기사에서는 일차(pHCEC) 및 불멸화(iHCEC) 인간 각막 상피 세포 배양에서 자외선(UV) 방사선 및 안구 독소의 독성을 측정하는 방법을 설명합니다. 세포는 UV 방사선 및 독성 용량의 염화벤잘코늄(BAK), 과산화수소(H2O2) 및 황산나트륨(SDS)에 노출되었습니다. 대사 활성은 대사 분석을 이용하여 측정하였다. 염증성 사이토카인의 방출은 multi-plex interleukin (IL)-1β, IL-6, IL-8 및 tumor necrosis factor-alpha (TNF-α) assay를 이용하여 측정하였으며, 형광 염료를 이용하여 세포 생존율을 평가하였다.
세포 대사 활성 및 사이토카인 방출에 대한 UV의 손상 효과는 iHCEC에 대한 UV 노출 5분 및 pHCEC에 대한 UV 노출 20분에서 발생했습니다. iHCEC 및 pHCEC의 대사 활성의 유사한 퍼센트 감소는 BAK,H2O2, 또는 SDS에 노출된 후에 발생하였고, 사이토카인 방출의 가장 유의한 변화는 IL-6 및 IL-8에 대해 발생하였다. 형광으로 염색된 iHCEC 및 pHCEC BAK에 노출된 세포의 현미경은 0.005% BAK 노출에서 세포 사멸을 나타내었지만, 에티듐 염색의 정도는 pHCEC보다 iHCEC에서 더 컸습니다. 현미경을 사용하여 독성 효과를 평가하는 여러 방법, 대사 활성 평가 및 사이토카인 생산을 활용하여 UV 방사선 및 화학 독소의 독성을 1차 및 불멸화 세포주 모두에 대해 측정할 수 있습니다.
Introduction
체외 독성학 연구는 세포에 손상을 줄 수있는 화학 물질 및 기타 물질의 독성 영향을 예측하기 위해 수행됩니다. 각막에 대한 독성의 평가에서, 인간 각막 상피 세포 (HCECs)는 이들 효과를 평가하기 위한 모델에 사용되었다 1,2,3,4. 이러한 모델은 일반적으로 세포의 대사 활동, 세포 증식 및 염증성 사이토카인의 생성 및 방출과 같은 기타 세포 기능의 변화와 같은 생리학적 효과를 평가합니다. 이러한 독성학 연구를 위해 HCEC에 대한 화학 물질 및 UV 방사선의 손상 효과를 평가하기 위해 다양한 출처의 세포가 선택되었습니다 2,3. pHCEC 라인은 성인의 공여자 조직으로부터 이들 세포를 제공하는 회사로부터 입수가능하다. 일차 세포는 디스파아제로 처리하고 배양을 위해 각막을 부드럽게 긁어낼 수 있다5. 그런 다음 세포는 바이러스 및 오염에 대해 테스트한 다음 10% 디메틸 설폭사이드에 냉동 보존된 상태로 배송됩니다.
일차 세포주의 장점은 세포가 기증자의 세포와 유전적으로 동일하다는 것입니다. 이는 시험관내 모델이 생체 내 조직을 가능한 한 많이 모방해야 하기 때문에 이상적입니다. 일차 세포주의 단점은 세포 분열 또는 계대 수가 제한되어 있다는 것이다6. 사용 가능한 세포 수가 제한되어 단일 1차 배양으로 수행할 수 있는 실험 수가 제한되어 실험 비용이 증가합니다.
불멸화된 세포주는 또한 세포 배양 독성 모델에 사용되었습니다. 그러나 생체 내 조직에서 얻은 일차 세포주와 달리 불멸화 된 세포주는 유 전적으로 변형되었습니다. 불멸화 된 세포는 바이러스의 유전자를 일차 세포 6,7,8의 DNA에 통합함으로써 생성됩니다. 바이러스 유전자 결합에 성공한 세포는 불멸화된 세포주를 위해 선택됩니다. 불멸화의 장점은 무기한의 빠른 증식을 허용하여 동일한 세포주를 사용하여 여러 실험을 수행할 수 있는 무제한의 세포를 제공한다는 것입니다. 이를 통해 실험 간의 일관성을 유지하고 비용을 절감할 수 있습니다.
세포 증식을 제한하는 유전자의 변화 외에도 중요한 기능을 가진 유전자의 발현 변화도 발생할 수 있다9. 그러므로, 불멸화된 세포를 사용하는 것의 단점은 다양한 외부 자극에 대한 반응의 관점에서 더 이상 원래의 생체 내 세포를 나타내지 않을 수 있다는 것이다(10). 비교에는 일차 및 불멸화된 인간 각막 각막세포(human corneal keratocytes)11, 불멸화된 HCECs(HCECs)와 토끼 각막 상피 일차 세포(rabbit corneal epithelial primary cell)12에 대한 화학물질의 독성 영향을 관찰하는 것이 포함되었다. 일차 인간 각질세포와 불멸화된 각질세포에 대한 독소의 효과 간의 비교는 유의미한 차이를 나타내지 않았다11. 이 기사에 설명된 방법을 사용하여 pHCEC 및 iHCEC에 대한 UV 방사선 및 안구 독소의 독성을 평가하기 위한 이러한 분석의 효과를 결정할 것입니다.
시험관내 분석에서 통상적으로 사용되는 3개의 안구 독소를 선택하였다: BAK,H2O2, 및 SDS. BAK는 안과용 용액에 통상적으로 사용되는 양이온성 방부제(13,14)이고,H2O2는 콘택트렌즈(15)를 소독하는데 통상적으로 사용되며, SDS는 세제와 샴푸(14)에서 발견되는 음이온성 계면활성제이다. 안구 독소와 마찬가지로 자외선도 HCEC에 심각한 손상을 줄 수 있습니다3. 또한, 자외선에 과다 노출되면 찢어짐, 빛에 대한 민감성, 거친 느낌 등의 증상을 특징으로 하는 광각막염(photokeratitis)으로 알려진 안구 질환이 발생할 수 있다16.
사용할 수 있는 일차 세포 배양액은 무제한이며 다양한 불멸화 세포주가 개발되었습니다. 따라서 이러한 유형의 세포를 통합하는 모델 간의 유사점과 차이점을 결정하기 위해 1차 HCEC를 불멸화된 HCEC 계통과 비교하기 위한 조사가 수행되었습니다.
이 조사는 현미경을 사용하여 UV 및 독소에 대한 세포 생리학적 반응에 대한 pHCEC와 iHCEC 간의 가능한 차이를 평가했습니다. 두 세포주에 대한 세포 대사 활동 및 염증성 사이토카인 방출에 대한 UV 방사선 및 화학 물질의 영향도 평가되었습니다. 두 세포주 간의 차이를 결정하는 것의 중요성은 1) 세포에 대한 UV 방사선의 영향, 2) 세포에 대한 독소의 영향, 3) 향후 연구를 위해 대사, 세포 생존율 및 세포 사이토카인 방출에 대한 결과적인 변화를 평가하기 위해 이러한 세포주의 최적 사용을 이해하는 것입니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
두 가지 유형의 HCEC 사용의 잠재적 차이를 평가했습니다. 세포를 동일한 농도의 세포로 동일한 배지(HOEM)에 배치한 다음 단기간 및 장기간의 UV 방사선과 3개의 안구 독소에 노출시켰습니다. UV 방사선 및 화학 물질의 선량은 생리학적 효과에 따라 선택되었으며, 이는 비교할 수 있는 중간 반응을 생성하기에 세포에 충분히 손상을 입혔습니다. UV 방사선에 대해 5 및 20 분의 노출 시간 및 BAK (0.001 %), SD…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 이 작업에 대한 자금을 받지 못했습니다.
Materials
| 75 cm2 Vented Flask | Corning | 354485 | This is the BioCoat brand, collagen-coated |
| 96 well plate | costar | 3370 | |
| alamarBlue | Fisher Scientific | dal 1025 | |
| Annexin Staining buffer solution | Invitrogen, Burlington, ON, Canada | ||
| Annexin V | Invitrogen, Burlington, ON, Canada | ||
| Axiovert 100 microscope with a Zeiss confocal laser scanning microscope 510 system | Carl Zeiss Inc., Germany | ||
| Corning 48 Well plates | Corning | 354505 | This is the BioCoat brand, collagen-coated |
| Cytation 5 | BioTek | CYT5MPV | Can read fluorescence from 280 – 700 nm (for assay 540/590) |
| Fetal Bovine Serum | Hycone | SH30396.03 | |
| glass bottom coverslips | MatTek Corporation, Ashland, MA, USA | ||
| Human Corneal Epithelial Cells | University of Ottawa | N/A | SV40-immortalized human corneal epithelial cells from Dr. M. Griffith (Ottawa Eye Research Institute, Ottawa, Canada) and have been characterized Griffith M, Osborne R, Munger R, Xiong X, Doillon CJ, Laycock NL, Hakim M, Song Y, Watsky MA. Functional human corneal equivalents constructed from cell lines. Science. 1999;286:2169-72. |
| Human Ocular Epithelia Media (HOEM) with the following supplements: | Millipore, Billerica, MA, USA | SCMC001 | Epigro base media supplemented with 6 mM L-Glutamine, 0.002% EpiFactor O (cell media supplement O in article) , 1.0 μM Epinephrine, 0.4% EpiFactor P (cell media supplement P in article), 5 μg/mL rh Insulin, 5 μg/mL Apo- Transferrin, and 100 ng/mL Hydrocortisone Hemisuccinate in Collagen-1 coated culture flasks (BioCoat, Corning, Tewksbury, MA, USA). |
| Live Dead calcien and ethidium homodimer | Invitrogen, Burlington, ON, Canada | ||
| MesoScale Discovery (MSD) QuickPlex SQ 120 instrument | Rockville, MD, USA | ||
| MSD Human Proinflammatory Panel II (4-Plex) V-Plex assay | Rockville, MD, USA | ||
| Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140-122 | 100x concentration so add 1 mL to each 99 mL of media |
| Primary Corneal Epithelial Cells | Millipore, Billerica, MA, USA | SCCE016 | |
| SpectraMax fluorescence multi-well plate reader | Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA | ||
| TrypLE Express (cell disassociation solution) | Fisher Scientific | 12605036 |
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