Mesenchymal stamcelleregulering af makrofagagocytose; Kvantificering og billeddannelse
Summary
Præsenteret her er en protokol til at kvantificere og producere dynamiske billeder af mesenchymal stamcelle (MSC) medieret regulering af makrofag (MΦ) fagocytose af ikke-opsonized gær (zymosan) partikler, der er konjugeret til en pH-følsomme fluorescerende molekyle.
Abstract
Mesenchymal stamceller (MSC) er traditionelt blevet undersøgt for deres regenerative egenskaber, men for nylig har deres immunregulatoriske egenskaber været på forkant. De interagerer med og regulerer immuncelleaktivitet. Fokus for denne undersøgelse er MSC regulering af makrofags-phagocytisk aktivitet. Makrofag (MΦ) phagocytose er en vigtig del af det medfødte immunsystems reaktion på infektion, og de mekanismer, hvorigennem MSC modulerer dette svar, er under aktiv undersøgelse. Præsenteret her er en metode til at studere MΦ fagocytose af ikke-opsoniserede zymosanpartikler konjugeret til en pH-følsomme fluorescerende molekyle, mens i co-kultur med MSC. Efterhånden som fagocytisk aktivitet øges, og de mærkede zymosanpartikler omsluttes i det sure miljø i fagoclysomaet, øges fluorescensintensiteten af det pH-følsomme molekyle. Med passende excitation og emission bølgelængder måles fagocytisk aktivitet ved hjælp af et fluorescerende spektrofotometer, og kinetiske data præsenteres som ændringer i relative fluorescerende enheder over en 70 min periode. For at understøtte disse kvantitative data visualiseres ændringen i den fagocytiske aktivitet ved hjælp af dynamisk billeddannelse. Resultater ved hjælp af denne metode viser, at når MSC er i co-culture, forbedrer han MΦ-fagocytose af ikke-opsoniseret zymosan af både naiv og IFN-γ behandlet MΦ. Disse data bidrager til den nuværende viden om MSC-regulering af det medfødte immunsystem. Denne metode kan anvendes i fremtidige undersøgelser for fuldt ud at afgrænse de underliggende cellulære og molekylære mekanismer.
Introduction
Mesenchymale stamceller (MSC) er stamceller, der giver anledning til bindevævsceller. MSC er til stede i voksne pattedyr væv og kan isoleres fra knoglemarven1. På grund af deres immunmodulerende egenskaber studeres disse celler bredt2. Tidlige undersøgelser fokuseret på MSC regulering af T-celler3,4,5,6, men for nylig, deres regulering af makrofag celler (MΦ), en vigtig cellulær komponent i medfødt immunitet, har fået øget opmærksomhed7,8,9,10,11,12,13,14 . Betydningen af MSC-MΦ interaktion i behandlingen af inflammatorisk sygdom understreges af det faktum, at udtømning af monocytter / makrofager ophæver de terapeutiske virkninger af MSC i dyremodeller8. Her er fokus MSC’s cellekontaktinteraktion med MΦ. MSC har kapacitet til at regulere fænotypen af MΦ ved at fremme overgangen fra inflammatoriske til antiinflammatoriske reaktioner, hvilket fører til vævsreparationsaktiviteter8,9,10,11, og der er gjort meget for at demonstrere disse reguleringsmekanismer. Under andre omstændigheder kan MSC understøtte eller forværre et MΦ-drevet inflammatorisk respons12,13 og forbedre MΦ-fagocytisk aktivitet14,15. Der er imidlertid en kritisk mangel på eksisterende data, der identificerer de mekanismer, hvorved og de betingelser, hvorunder MSC regulerer MΦ-fagocytisk aktivitet.
MΦ har familier af receptorer, der genkender enten opsoniseret (antistof eller komplementbelagt) eller ikke-opsoniserede patogener, der fører til fagocytose16. Aktiveringen og aktiviteten af sidstnævnte er mindre godt undersøgt17. I et ikke-inflammatorisk in vitro-miljø forbedrer MSC MΦ-fagocytose af ikke-opsoniserede patogener13. Genkendelse af ikke-opsoniserede patogener ved MΦ kan dog reduceres efter eksponering for et inflammatorisk miljø produceret af lymfocytter under et adaptivt immunrespons. IFN-γ, udgivet af naturlige dræberceller og effektorlymfocytter, har en hæmmende virkning på MΦ-fagoccytose af ikke-opsoniserede partikler18. En co-kultur model blev udviklet til at studere mekanismerne i MSC direkte kontakt regulering af MΦ fagocytose. Målet med det eksperiment, der præsenteres her, er at afgøre, om MSC regulerer MΦ-fagocytose af ikke-opsoniserede patogener, efter at MΦ har været udsat for IFN-γ (Figur 1).
Protocol
Representative Results
Discussion
Analyse af fagocytose ved hjælp af biopartikler, der er konjugeret til et pH-følsomt farvestof, er et relativt nyt værktøj , der har vist sig fordelagtigt i forhold til traditionelle fluorescerende mærkede partikler12,19,20. Med traditionelle fluorescerende partikler er kun slutpunktsanalyse mulig. Detektionen sker med fluorescerende mikroskopi og/eller spektrofluorometri efter vask eller afkøling af partikler, der ikke er…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af NSF’s mekanisme for større forskningsinstrumenter under tilskudsnumre 1626093 og 1919583.
Materials
| 96 Well Black Polystyrene Microplate | MilliporeSigma | CLS3603-48EA | |
| 0.4% trypan blue solution | MilliporeSigma | T8154-20ML | |
| 15 mL and 50 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | ThermoFisher | 339653 | |
| 4-well Chambered Coverglass w/ non-removable wells | ThermoFisher | 155382PK | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) Gibco | ThermoFisher | 15240096 | |
| Axiobserver 7 Imaging System | Zeiss | ||
| Bovine Serum Albumin (BSA) | MilliporeSigma | A8806-1G | |
| Cell lifter | MilliporeSigma | CLS3008-100EA | |
| Culture flasks, tissue culture treated, surface area 75 cm2, canted neck, with cap, filtered | MilliporeSigma | C7231-120EA | |
| D1 ORL UVA [D1] | ATCC | CRL-12424 | Mouse MSC Cell Line |
| DMEM, High Glucose | ThermoFisher | 11965092 | |
| Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated | ThermoFisher | 16140071 | |
| Hemocytometer | FisherScientific | 02-671-51B | |
| I-11.15 | ATCC | CRL-2470 | Mouse MΦ Cell Line |
| LADMAC Cell Line | ATCC | CRL-2420 | LADMAC cells secrete the growth factor colony stimulating factor 1 (CSF-1). |
| Live-Cell Imaging solution | ThermoFisher | A14291DJ | |
| PBS, pH 7.4 | ThermoFisher | 10010031 | |
| pHrodo Green Zymosan Bioparticles Conjugate | ThermoFisher | P35365 | |
| Recombinant Murine IFN-γ | Preprotech | 315-05 | |
| Spectramax i3X | Molecular Devices | ||
| Sterile Single Use Vacuum Filter Units, 250 mL, 0.2 µm | ThermoFisher | 568-0020 | |
| Sterile syringe filters, 0.2 micrometer | ThermoFisher | 723-2520 | |
| Tissue-culture treated culture dishes, 100 mm x 20 mm | MilliporeSigma | CLS430167-100EA | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | ThermoFisher | 25300054 |
References
- Phinney, D. G., Prockop, D. J. Concise review: Mesenchymal stem/multipotent stromal cells: The state of transdifferentiation and modes of tissue repair–current views. Stem Cells. 25 (11), 2896-2902 (2007).
- Bernardo, M. E., Fibbe, W. E. Mesenchymal stromal cells: sensors and switchers of inflammation. Cell Stem Cell. 13 (4), 392-402 (2013).
- Tobin, L. M., Healy, M. E., English, K., Mahon, B. P. Human mesenchymal stem cells suppress donor CD4(+) T cell proliferation and reduce pathology in a humanized mouse model of acute graft-versus-host disease. Clinical and Experimental Immunology. 172 (2), 333-348 (2013).
- Giuliani, M., et al. Long-lasting inhibitory effects of fetal liver mesenchymal stem cells on T-lymphocyte proliferation. PLoS One. 6 (5), 19988 (2011).
- Plumas, J., Chaperot, L., Richard, M. J., Molens, J. P., Bensa, J. C., Favrot, M. C. Mesenchymal stem cells induce apoptosis of activated T cells. Leukemia. 19 (9), 1597-1604 (2005).
- Luz-Crawford, P., et al. Mesenchymal stem cells generate a CD4+CD25+Foxp3+ regulatory T cell population during the differentiation process of Th1 and Th17 cells. Stem Cell Research & Therapy. 4 (3), 65 (2013).
- Waterman, R. S., Tomchuck, S. L., Henkle, S. L., Betancourt, A. M. A new mesenchymal stem cell (MSC) paradigm: Polarization into a pro-inflammatory MSC1 or an Immunosuppressive MSC2 phenotype. PLoS One. 5 (4), 10088 (2010).
- Nemeth, K., et al. marrow stromal cells attenuate sepsis via prostaglandin E(2)-dependent reprogramming of host macrophages to increase their Interleukin-10 production. Nature Medicine. 15 (1), 42-49 (2009).
- Maggini, J., et al. Mouse Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stromal Cells Turn Activated Macrophages into a Regulatory-Like Profile. PLoS One. 5 (2), 9252 (2010).
- Takizawa, N., et al. marrow-derived mesenchymal stem cells propagate immunosuppressive/anti-inflammatory macrophages in cell-to-cell contact-independent and-dependent manners under hypoxic culture. Experimental Cell Research. 358 (2), 411-420 (2017).
- Kim, J., Hematti, P. Mesenchymal stem cell-educated macrophages: a novel type of alternatively activated macrophages. Experimental Hematology. 37 (12), 1445-1453 (2009).
- Evans, J. F., Salvador, V., George, S., Trevino-Gutierrez, C., Nunez, C. Mouse aorta-derived mesenchymal progenitor cells contribute to and enhance the immune response of macrophage cells under inflammatory conditions. Stem Cell Research & Therapy. 6 (1), 56 (2015).
- Cho, D. I., et al. Mesenchymal stem cells reciprocally regulate the M1/M2 balance in mouse bone marrow-derived macrophages. Experimental Molecular Medicine. 46, 70 (2014).
- Fernandez, N., et al. Mouse mesenchymal progenitor cells expressing adipogenic and osteogenic transcription factors suppress the macrophage inflammatory response. Stem Cells International. 2017, 5846257 (2017).
- Jackson, M. V., et al. Mitochondrial transfer via tunneling nanotubes is an important mechanism by which mesenchymal stem cells enhance macrophage phagocytosis in the in vitro and in vivo models of ARDS. Stem Cells. 34 (8), 2210-2223 (2016).
- Chaplin, D. D. Overview of the immune response. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 125 (2), 3-23 (2010).
- Lim, J., et al. Characterizing the mechanisms of nonopsonic uptake of cryptococci by macrophages. Journal of Immunology. 200 (10), 3539-3546 (2018).
- Wang, Z., et al. Interferon-γ inhibits nonopsonized phagocytosis of macrophages via an mTORC1-c/EBP pathway. Journal of Innate Immunity. 7 (2), 165-176 (2015).
- Lindner, B., Burkard, T., Schuler, M. Phagocytosis assays with different PH-sensitive fluorescent particles and various readouts. Biotechniques. 68, 245-250 (2020).
- Kapellos, T. S., et al. A novel real time imaging platform to quantify macrophage pahgocytosis. Biochemical Pharmacology. 116, 107-119 (2016).
- Takahashi, D., et al. Flow cytometric quantitation of platelet phagocytosis by monocytes using a pH-sensitive dye, pHrodo-SE. Journal of Immunological Methods. 447, 57-64 (2017).
