Summary
ここで提示されるプロトコルは、pH感受性蛍光分子に結合された非オプゾン化酵母(zymosan)粒子のマクロファージ(MΦ)食作用の間葉幹細胞(MSC)媒介性調節の動的画像を定量化し、生成するプロトコルです。
Abstract
間葉系幹細胞(MSC)は、伝統的に再生特性について研究されてきましたが、最近では免疫調節特性が最前線に位置しています。彼らは免疫細胞の活性と相互作用し、調節します。.本研究の焦点は、マクロファージ貪食活動のMSC調節である。マクロファージ(MΦ)貪食症は、感染に対する自然免疫系の反応の重要な部分であり、MSCがこの応答を調節するメカニズムは積極的に調査中である。本明細書に提示される非オプソ化ザイモサン粒子のMΦ食細胞化を研究する方法であり、MSCと共培養中にpH感受性蛍光分子に結合する。食作用活性が増加し、標識されたザイモサン粒子がファゴリソームの酸性環境内に封入されると、pH感受性分子の蛍光強度が高くなる。適切な励起波長と発光波長により、蛍光分光光度計を用いて貪食活性を測定し、70分の間に相対的な蛍光単位の変化として運動データを提示します。この定量的データをサポートするために、食作用活性の変化を動的イメージングを用いて可視化する。この方法を用いた結果は、共培養時に、MSCがナイーブとIFN γの両方の非オプソナイズザイモサンのMΦ貪食症を増強することを示γ MΦを治療した。これらのデータは、自然免疫系のMSC調節の現在の知識に追加されます。この方法は、将来の調査で、基礎となる細胞および分子機構を完全に引き出すために適用することができます。
Introduction
間葉系幹細胞(MSC)は、結合組織細胞を生み出す前駆細胞です。MSCは、哺乳動物の成人組織に存在し、骨髄1から単離することができる。それらの免疫調節特性のために、これらの細胞は広く研究されている2.初期の研究は、T細胞3、4、5、6のMSC調節に焦点を当てたが、最近では、自然免疫の主要な細胞成分であるマクロファージ細胞(MΦ)の調節が、7、8、9、10、11、12、13、14の注目を集めている.炎症性疾患の治療におけるMSC-MΦ相互作用の重要性は、単球/マクロファージの枯渇が動物モデル8におけるMSCの治療効果を損なうという事実によって強調される。ここで、焦点はMΦとMSCの細胞接触相互作用である。MSCは、炎症反応から抗炎症反応への切り替えを促進することによってMΦの表現型を調節する能力を有し、組織修復活動8、9、10、11に至り、これらの調節メカニズムを実証するために多くが行われている。他の状況下では、MSCはMΦ駆動の炎症反応12、13を支持または悪化させ、MΦ貪食活性14、15を増強することができる。しかし、MSCがMΦ貪食活性を調節するメカニズムと条件を特定する既存のデータが欠けています。
MΦは、オプゾン化(抗体または補体被覆)または食作用に至る非オプソン化病原体のいずれかを認識する受容体のファミリーを有する16。後者の活性化と活動はあまりよく研究されていない17.非炎症性インビトロ環境において、MSCは非オプソン化病原体13のMΦ貪食症を増強する。しかし、MΦによる非オプソナイズ病原体の認識は、適応免疫応答中にリンパ球によって産生される炎症環境への曝露後に減少し得る。天然キラー細胞およびエフェクターリンパ球によって放出されるIFN-γは、非オプソン化粒子18のMΦ貪食症に対して阻害効果を有する。MΦ貪食症のMSC直接接触調節機構を研究するために、共培養モデルが開発された。ここで提示する実験の目的は、MΦがIFN-γにさらされた後にMSCが非オプス化病原体のMΦ貪食症を調節するかどうかを決定することです(図1)。
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Protocol
注:すべての培地製剤および細胞培養技術は、層流を有するバイオセーフティキャビネットを使用して無菌条件下で行われます。記載されたすべての培養工程は、37°C、5%CO2、および95%湿度の雰囲気を維持するように設計されたインキュベーターを使用して行われる。
1. 細胞培養
- 成長培地の調製
- MSCとLADMACの場合は、50mLのFBSと100倍の抗生物質/抗ミキティックミックスの5mLを高グルコースDMEMの500 mLに加えます。
- MΦの場合は、FBSの50 mL、LADMACコンディション培地の100 mL(セクション1.2のステップに従って調製)、および高グルコースDMEMの500 mLに100倍の抗生物質ミックスの5 mLを加えます。
注:LADMAC細胞は、MΦ細胞の増殖をサポートするために必要なコロニー刺激因子(CSF-1)を産生する。
- LADMAC コンディショム培地の調製
- 凍結ストックからLADMAC細胞を播種するには、5つのT75 cm2 細胞培養フラスコのそれぞれでセクション1.1から19mLの増殖培地を加え、細胞培養インキュベーターに15分間配置し、37°Cに平衡化する。
- 一方、37°Cの水浴中で2〜3分間、または解凍されるまでインキュベートすることにより、106個 の凍結細胞のアリコートを1つ迅速に解凍する。15 mL または 50 mL の無菌の円錐形チューブに 9 mL の新鮮な MSC 成長培地を加え、5 分間のスイング バケットローターに 125 x g の遠心分離機を加えます。
- 上清を吸引またはデカントし、5 mLの新鮮な成長培地を加え、ピペットを上下に軽く加え、細胞ペレットを再懸濁させます。
- 滅菌血清ピペットを用いて5つのT75cm2 フラスコのそれぞれに細胞懸濁液1mLを加え、細胞培養インキュベーターに入れる。
- 2~3日ごとに、7~10日間に10mLの培地を追加します。次いで、無菌血清ピペットと遠心分離機を125 x g で5分間使用して、細胞および上清を滅菌50 mL円錐管に集める。
- 上清を細胞ペレットと滅菌フィルターから分離し、0.2 μmの滅菌式の使用用真空フィルターユニットを使用して上清をフィルターします。
- パッケージからアスピレーターアセンブリを取り外し、真空管を使用して吸引器ポンプに接続します。上清を上部コンパートメントに注ぎ、カバーを交換します。吸引ポンプをオンにして、下のコンパートメントにフィルターを入れます。
- 50 mLの無菌の円錐形の管にピペットを入れ、-20°Cで保存してアリコートを準備します。
- 細胞ペレットを凍結するには、106 細胞/mLの凍結培地で再懸濁し、凍結容器に入れ、-80°Cの冷凍庫に入れます。24 時間後に、LN2 ストレージに転送します。
- 共培養の準備として細胞を伝播する
- 凍結ストックからMSCおよびMΦ細胞を播種するには、各細胞種に対して処理した4つの100mm細胞培養物のそれぞれにおいて、セクション1.1で調製した適切な増殖培地の9mLを平衡化し、細胞培養インキュベーターに15分間配置する。
- 一方、37°Cの水浴で2〜3分間、または解凍するまでにインキュベートして、10個の6個 の凍結細胞のアリコートを素早く解凍する。次に、解凍したMSC細胞を9mLの新鮮なMSC増殖培地に加え、解凍したMΦ細胞を15または50mLの新鮮なMΦ成長培地に加え、125 x gの125 x g で5分間バケットローターを振り回します。
- 上清を吸引またはデカントし、上下に軽くピペット処理することにより、適切な新鮮な成長培地の4mLに各ペレットを再懸濁する。ステップ1.3.1で平衡化された各細胞タイプごとに、セルサスペンションの1mLを各100mmの各々に加えます。
- 細胞を含む料理をインキュベーターに戻します。70%-80%コンフルエントまで2〜3日ごとに培地を変更します。
2. 実験料理のシードMSC、 1日目
注:MSCを播種する前に、蛍光分光測定用の実験用96ウェルプレートレイアウトと、動的イメージング用のチャンバースライドを設計してください。96ウェルプレートの場合、細胞を含む井戸を含む実験井戸を横に並べますが、アッセイでは使用しないでください。試薬ブランク(RBL)に使用するウェルを少なくとも4つマークします。4 ウェルチャンバー スライド テンプレートの例については、96 ウェル テンプレートの例の 表 1 および 表 2 を参照してください。黒または白の96ウェルプレートとクリアボトムが推奨されます。1.5 mmのホウケイ酸ガラス室のスライドは最適であるが、チャンバーの数は、研究の設計に応じて調整することができます。以下の方法の要約フローチャートは図2に示 されています。
- 70%〜80%合流で、培養液から成長培地を100mm皿に吸引し、5mLのPBSを加えてMSCを単離する。
- PBSを吸引し、0.05%トリプシン/EDTAの2mLを加え、3〜5分間培養インキュベーターに入れる。
- 3分後、逆顕微鏡で細胞剥離を確認します。セルが切り離されている場合は、次の手順に進みます。そうでなければ、さらに1〜2分間インキュベーションを続けます。5~6分以上のインキュベートは行わない。
- 取り外された細胞で皿に新鮮な成長培地の5 mLを追加します。トリプシン/培地混合物を使用して皿を洗い流し、無菌血清ピペットを使用して清潔な、無菌50 mL円錐管に細胞を集めます。
- 125 x gで 5 分間の遠心分離機.上清を吸引し、上下に軽くピペット処理して10mLの新鮮な成長培地で細胞ペレットを再懸濁する。
- 細胞を数えるには、細胞懸濁液の10 μLを0.4%のトリパンブルー溶液の1.5 mLマイクロ遠心チューブに加えます。次いで、ヘモサイトメーター計の被覆板下の混合物のピペット10μLを計数チャンバーにする。
- 反転または明視野顕微鏡を使用して、10xの目的で、1mm2 の四方の4つの染色されていない(生存可能な)細胞を数えます。セル/mL = セル数/# 1 mm2 平方 x 希釈係数 x 104を使用してセル数を計算します。
注: この例では、1 mm2 の平方数は 4、希釈係数は 4 です。 - 式C1V1 =C2V2 を使用して、1 x 105 セル/mLサスペンションを計算し、調製します。充填される96ウェルプレートの各カラムに対して1mLのセル/mLサスペンションを準備し、プレート設計に従って充填される4ウェルチャンバースライドのすべてのチャンバーに0.75 mLを準備します。
注: C1 = セル数、V1 = 計算対象、C2 = 1 x 105、V2 = 5.50 mL。 - V1を決定し、合計容積の所望の 5.50 mL から差し引き、懸濁液の準備に必要な新鮮な媒体の容積を決定します。元の懸濁液のセル(V1)の体積を、1 x 105 細胞/mLで合計5.50 mLの新鮮な培地の体積に加えます。
- マルチチャンネルマイクロピペットを使用したプレート設計に従って、96ウェルプレートの各ウェルに1x 105 セル/mLサスペンションの100 μLを加え、プレート設計に従ったマイクロピペットを使用してチャンバースライドの各ウェルに530 μLを追加します。一晩インキュベート。
注: この実験では、MSC は 96 ウェルプレートの列1、2、3、および 6 にメッキされ、4 ウェルチャンバー スライドのウェル 1 とウェル 2 (表 2)が示されています。そのため、1 x 10 5セル/mL懸濁液の少なくとも5.50mL が調製される。80%合流でMΦは、MSCが実験プレートに播種された同じ日に炎症性メディエーターで処理される。
3. IFN-γ 1 日目で MΦ を有効にします。
- アクティベーション媒体およびIFN γ在庫を準備します。
- 200 mLの活性化媒体については、0.2 μmの無菌の単一使用真空フィルター装置を使用して、200mLの無血清高グルコースDMEMおよび無菌フィルターの40mgを加えます。
- 0.1%BSA/PBSを調製するには、20mgのBSAを20mLのPBSに加えます。溶解する渦。0.2 μmの滅菌シリンジフィルターを使用して、清潔な滅菌50 mL円錐管にフィルターします。
- 100 μg/mLのストック溶液を得るために、凍結乾燥したIFN-γの100 μgに無菌0.1%BSA/PBS溶液を1 mL加えます。50 μL のアリコートを-20 °Cで保管してください。
- IFN-γで MΦ をアクティブにする
- 必要な培地の1 mLごとに、IFN-γストックの2.5 μLを100 μg/mL加えます。100mmの皿が活性化されるたびに、IFN-γを含む活性化培地を250ng/mLの濃度で調製します。
- MΦ培養物から成長培地を吸引し、5mLの活性化培地に交換し、IFN-γを行わずにすすいす。
- リンスに使用する培地を吸引し、10mLのIFN-γの添加活性化培地を実験用の活性化培地に、10mLの非補充活性化培地でコントロールします。培養物を16〜24時間培養する。
4. MΦを分離し、共同文化を準備する、2日目
- MΦ細胞から活性化培地を取り出し、5mLの新鮮な増殖培地に交換します。セルリフターで優しく削り、50 mLの円錐管に細胞を集めます。
- ステップ 2.6-2.7 で MSC の説明に従ってトリパンブルー排除とヘモサイトメトリーを使用してセルをカウントします。
- ステップ2.8-2.9の式を使用して、2 x 105 細胞/mLの2つの別々の懸濁液を調製し、1つはコントロールからの細胞と、1つは処理されたMΦ培養物の細胞を含む。
注:充填される96ウェルプレートのすべての列に対して1mLのセル/mLサスペンションを準備し、プレート設計に従って充填される4ウェルチャンバースライドのすべてのチャンバーに0.75 mLを準備します。 - MSCを含む96ウェルプレートの実験井戸から培地を軽く吸引する。マルチチャンネルマイクロピペットを使用して、100 μLの処理を加え、コントロールMΦ細胞懸濁液をプレート設計に従ってMSCの有無にかかわらず適切な実験井戸に加えます。一晩インキュベート。
- MSCを含む4ウェルチャンバースライドから培地を軽く吸引し、マイクロピペットを使用して、530μLのMΦセルサスペンションを適切なウェルに追加します。一晩インキュベート。
5. 食細胞症アッセイ、運動蛍光96ウェルプレート読み取り、3日目
- アッセイパラメータの設定
- アッセイの日に、蛍光プレートリーダーをオンにし、システムの温度を37°Cに設定します。
- システムProソフトウェアを開き、左上隅にある機器アイコンをチェックして、機器がコンピュータに接続されているかどうかを確認します。線のある赤い円が表示されている場合は、音源アイコンをクリックし、ポップアップウィンドウでインストゥルメントを選択して接続を行います。
- [ 新規実験]を 選択して、 プレート設定ヘルパー ポップアップウィンドウにアクセスします。プレート 設定ヘルパー メニューから、 集録設定の構成 を選択します。
- 光学式構成の設定メニューから「 モノクロータ 」を選択します。読み取りモードには FL (蛍光) を、読み取りタイプには キネティック を選択します。
- 同じ設定ウィンドウで、[ カテゴリ]の [ 波長] をクリックし、励振の場合は帯域幅を 9 nm、放出に 15 nm に設定します。
- 波長ペアの数を1に設定します。励起の波長LM1を 510 nm に、放出に対して 540 nm に設定します。
- カテゴリを通して続行し、次に プレートタイプを 選択します。使用するプレートタイプに一致するオプションを選択します。
注: 選択がプレートタイプと一致することが重要です。読み取り高さは、選択に従ってシステムによって設定されます。 - 次に、「 領域を読み取る 」を選択し、実験計画に含まれる 96 ウェルプレートの領域をハイライトします。
- PMT と光学を選択し、PMT ゲインを高に設定し、読み取りごとに点滅を6に設定します。平底プレートを使用する場合は、[下から読み取る]の横にあるチェックボックスをオンにします。
- [ タイミング] を選択し、70 分間隔で 10 分間間隔を設定します。
- [ シェイク] を選択し、[ 最初に読む前 ] ボックスをオンにして、5 s に設定します。[ 読み取りの間隔 ] チェックボックスをオンにして、3 s に設定します。 [低 ]と[ 線形]の両方に振れ強度を設定します。
- ウィンドウを閉じます。 [プレート設定ヘルパー ] ウィンドウがポップアップ表示されたら、[ プレート レイアウトの構成] を選択します。プレート設計の BL ウェルをハイライトし、 プレートブランクをクリックします。
- 実験行を選択し、[ 追加] をクリックしてグループ名を指定し、色を選択します。
- プレートデザインの下の [割り当てオプション] で [ シリーズ] を選択し、ウィンドウで系列を定義して [OK]をクリックします。各グループに対して繰り返します。
- ザイモサンサスペンションを準備する
- システム温度が37°Cに達するのを待つ間、生細胞イメージング媒体の5mLに1mgのザイモサン粒子を再懸濁する。
- 粒子を含むバイアルに1mLの生細胞イメージング培地を加え、ガラス培養管に集めます。さらに1 mLのイメージング溶液でバイアルをリンスし、同じガラス管に移して、すべての粒子が確実に転写されるようにします。3 mLの追加イメージングソリューションを追加して、0.2 mg/mLの粒子懸濁液を達成します。
- 30-60 sのための速い脈拍が付く渦。次に、プローブ超音波処理器を使用して、60個のクイックパルスで超音波処理します。
注:粒子の均質な懸濁液を作成し、実験井戸に追加する前にサスペンションをあまり長く座らせないようにすることは非常に重要です。束は急速に再発します。細胞密度あたりの粒子は、使用するMΦのソース、処理、密度に応じて最適化する必要があります。提示された研究では、共役したザイモサン粒子が使用された。しかし、共役した 大腸菌 および S.アウレウス も利用可能である。
- システム温度が37°Cに達するのを待つ間、生細胞イメージング媒体の5mLに1mgのザイモサン粒子を再懸濁する。
- zymosanを追加し、プレートを読む
- 実験井戸から培地を吸引し、1xを生細胞イメージング溶液の100 μLでリンスします。ライブセルイメージングソリューションでRBLウェルをリンスします。
- 実験およびRBLウェルから生細胞イメージング溶液を吸引し、セクション5.2で調製したzymosan粒子懸濁液の100 μLに置き換えます。
- タッチパッドインターフェイスを使用して、蛍光リーダーのプレートトレイを開きます。左上隅にA1ウェルを備えたトレイに蓋をせずにプレートをセットします。タッチパッドを使用してトレイを閉じ、上部メニューの緑色の 読み取り ボタンをクリックします。
- 読み取りが完了したら、ファイルを適切なフォルダに保存し、[ ファイル ] をクリックして [エクスポート] を選択して、データをスプレッドシート形式で エクスポートします。
- スプレッドシート(補足ファイル1)で各反復群の平均±SEM相対蛍光を各時点(10分、20分、30分など)で計算し、グラフソフトにデータを転送します。
- 折れ線グラフ形式を使用してデータを表示し、双方向の ANOVA (時間 x 処理/MSC を因子として) 適用し、続いて Tukey の複数比較テストを使用して個々のグループ間の違いを判別します。
メモ:96ウェルプレートの読み取りが進行中の間に、タイムラプス画像取得のためにダイナミックイメージングプレートを準備します。動的イメージングが一度に1つの実験井戸の分析を進めます。
6. 食道細胞症アッセイ、動的イメージング、3日目
- イメージングシステムとコンピュータの電源を入れます。ソフトウェアをダブルクリックして開きます。 Pro プログラムモードを選択します。
- ステージ領域をチェックして、サンプルが存在しないか、ステージの動きを妨げるものは何もないようにします。次に、[ 今すぐ調整] をクリックします。
- 右側のサイドバーの インキュベーション メニューで 、HユニットXL の横にあるチェックボックスをオンにして、37°Cに設定します。
メモ:インキュベートされた段階がほぼ温度になるまで待ってから、サンプルをイメージング用に準備してください。 - 750 μLのイメージング媒体で最初の実験をよくリンスし、セクション5.2で調製したzymosan粒子懸濁液の400 μLに置き換えます。成長培地に残りの井戸を残します。
注:15分以上落ち着いた場合は、粒子懸濁液を再び短時間で渦を発生させ、超音波処理する必要があります。 - スライドを撮像システムのインキュベート段階に置きます。10分間タイマーを設定します。
- イメージングソフトウェアを使用し、[場所検索]タブで[ブライトフィールド]を選択し、下のシステム設定ウィンドウで接眼用のアイコンをクリックします。10xの目的を所定の位置に、接眼レンズとフォーカスノブを使用して細胞に焦点を当てます。
- [ 取得 ]タブを選択し、[ 実験 ]ドロップダウン メニューを使用して、PH感度染料の509 nm励起533 nmの発光波長に対応するように 設定されたEGFP フィルタを含む波長セットを選択します。
- タイマーに約2分残っている場合は、目的メニューの20xアイコンをクリックして、ソフトウェアを使用して目的を20倍に変更します。
- チャンネルメニューをクリックし、EGFPフィルタを選択し、露出メニューを使用して、pH感受性の緑色蛍光素を検出するために、pH感受性の緑色蛍光素を検出するために、ファゴリソームに閉じ込められたら、露出時間を400 msに設定します。
- ライブをクリックし、フォーカスノブを使用してフォーカスを調整します。
- [停止]をクリックしてライトをオフにし、上部にある「タイムラプス実験」の横にあるチェックボックスをオンにします。
- [フォーカス戦略]メニューで、[ソフトウェアオートフォーカス]を選択します。オートフォーカスメニューのドロップダウンから「スマート設定と粗い設定」を選択し、オートフォーカスの実行中の光への露出時間を短縮します。
- タイムラプスメニューで、必要な取得回数を30~60に、間隔を1分に設定します。
- タイムラプスパラメータが設定された後、10分後にパーティクルを最初のウェルに追加した後、[ 実験の開始 ]ボタンをクリックして取得を開始します。
- 最初の実験井戸を使用して取得が完了したら、残りの実験井戸ごとにステップ6.4~6.12を繰り返します。
- タイトル内の日付とパラメーターを含むすべての実験ファイルを適切なフォルダーに保存します。
- ソフトウェアを閉じます。 処理 モードでソフトウェアを再度開き、エクスポートメニューを使用してMP4形式でファイルを エクスポート します。
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Representative Results
すべての時間ポイントで各グループの平均±SEMを計算した後、データはY軸を相対蛍光強度、X軸を時間として折れ線グラフ形式で表示します。 補足ファイル 1 は、96 ウェルプレートのキネティック読み取りからスプレッドシート形式での生データの例を提供します。
本研究では、図3Aおよび表3に示す最適な結果は、1)MSCとの共培養がマクロファージの貪食活性を高めることを示し、2)IFN-y治療はマクロファージの活性を低下させ、3)MSCとの共培養はMΦ貪食活性を部分的に救う。これらの研究では最適な細胞密度が重要であり、MΦが低密度でメッキされると、蛍光強度の変化は検出できない(図3B)。図3Cは、MΦが高すぎる密度でメッキされ、蛍光強度が全群で急速に上昇し、差異を識別できない研究のデータを表している。動的イメージングビデオは、蛍光強度の変化が、培地の酸性化ではなく貪食に起因することを確認します。また、質的データと、食作用の速度と程度を視覚的に表現することもできます(図4)。
図1:提示されたデータの中心的な問題である「MΦを扱ったIFN-γの貪食活性を回復できるか」という、提示されたデータの中心的な問題を描いた図。
図2:共培養と貪食アッセイのワークフローの概要 MSCとの共培養におけるMΦ貪食活性の定量的および定性的分析のワークフローの概要 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3: 最適および最適以下の結果を示す運動読み取りからの代表的な定量データ(A)では、データは最適なMΦ細胞密度を有する実験を代表し、(B)データは、MΦ細胞密度が低すぎる最適な低すぎる実験を代表するものであり、(C)では、データは、最適で高すぎるMΦ細胞密度の実験を代表する。相対蛍光単位(RFU)で測定された相対蛍光強度はY軸にプロットされ、時間はX軸にプロットされます。最適な実験と最適でない実験の間でRFUの範囲の違いに注意してください。Aでは、70分の間にIFN-γ抑制の設定でMΦ貪食活性を部分的に救い出す。RFU は SEM ±平均値として表示されます( n = 6)。この解析は、有意な双方向ANOVA、相互作用効果P = 0.0001、時間効果P = 0.0001、治療/MSC効果P = 0.0001の後に、Tukeyの多重比較検定を使用して行われた。記号は、複数の比較テストの結果を示します。* = MSC/MΦ + IFN- γ対 MΦ + IFN-γの間の有意差, Ŧ = MΦ対MΦ + IFN-γの間の有意差, および† = MSC/Mφ対MΦ間の有意差.複数比較テストの詳細な結果については、表 3を参照してください。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:MΦ食突合体に組み込んだ後の標識ザイモサン粒子の酸性活性化による蛍光の細胞特異的増加を視覚的に確認する動的イメージングビデオ。 タイムラプス設定は、400msの露光時間とEGFPフィルタセットを用いて30分間隔で1分毎に取得した。(A)単培養中のMΦ、 (B) MSCとの共培養における MΦ、(C)MΦを IFN-γ (250 ng/mL) で処理し、 (D) MΦを MSC との共培養において IFN-γ (250 ng/mL) で処理した。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | |
| ある | CBL | MSC/MΦ | MSC/MΦ+ | MΦ | MΦ+ | CBL | RBL | |||||
| B | CBL | MSC/MΦ | MSC/MΦ+ | MΦ | MΦ+ | CBL | RBL | |||||
| C | CBL | MSC/MΦ | MSC/MΦ+ | MΦ | MΦ+ | CBL | RBL | |||||
| D | CBL | MSC/MΦ | MSC/MΦ+ | MΦ | MΦ+ | CBL | RBL | |||||
| E | CBL | MSC/MΦ | MSC/MΦ+ | MΦ | MΦ+ | CBL | RBL | |||||
| F | CBL | MSC/MΦ | MSC/MΦ+ | MΦ | MΦ+ | CBL | RBL | |||||
| G | CBL | MSC/MΦ | MSC/MΦ+ | MΦ | MΦ+ | CBL | RBL | |||||
| H | CBL | MSC/MΦ | MSC/MΦ+ | MΦ | MΦ+ | CBL | RBL |
表1:96ウェルプレート設計の例 CBL - セルブランク。MSC - シード 1 日目。MΦ+処理され、MΦ未処理の種子第2日;RBL試薬ブランクはアッセイ3日目に添加した。
| 1 | 2 | 3 | 4 |
| MSC/MΦ | MSC/MΦ+ | MΦ | MΦ+ |
表2:4ウェルチャンバースライド設計の例。 MSC - メッキ1日目。MΦ+処理され、MΦ未処理メッキ2日目。
| Tukeyの多重比較テスト | 平均差分。 | 95.00% DIFF の CI. | しきい値を下回る? | 概要 | 調整済みP値 |
| 0分 | |||||
| MSC/MΦ vs. MΦ | -3871 | -9495~1754 | いいえ | ns | 0.2836 |
| MSC/MΦ + IFN-γ対MΦ +IFN-γ | 720.3 | -4904 から 6345 | いいえ | ns | 0.9873 |
| MΦ 対 MΦ + IFN-γ | -77.17 | -5702~5548 | いいえ | ns | >0.9999 |
| 10分 | |||||
| MSC/MΦ vs. MΦ | -3466 | -9091~2159 | いいえ | ns | 0.3817 |
| MSC/MΦ + IFN-γ対MΦ +IFN-γ | 2326 | -3299~7950 | いいえ | ns | 0.7062 |
| MΦ 対 MΦ + IFN-γ | 992 | -4633 から 6617 | いいえ | ns | 0.968 |
| 20分 | |||||
| MSC/MΦ vs. MΦ | -1311 | -6936 から 4314 | いいえ | ns | 0.9303 |
| MSC/MΦ + IFN-γ対MΦ +IFN-γ | 3315 | -2310~8940 | いいえ | ns | 0.422 |
| MΦ 対 MΦ + IFN-γ | 3146 | -2478 から 8771 | いいえ | ns | 0.4689 |
| 30分 | |||||
| MSC/MΦ vs. MΦ | 384.8 | -5240~6010 | いいえ | ns | 0.998 |
| MSC/MΦ + IFN-γ対MΦ +IFN-γ | 2313 | -3312 から 7937 | いいえ | ns | 0.7098 |
| MΦ 対 MΦ + IFN-γ | 8726 | 3101から14350まで | はい | *** | 0.0005 |
| 40分 | |||||
| MSC/MΦ vs. MΦ | 2247 | -3377~7872 | いいえ | ns | 0.7278 |
| MSC/MΦ + IFN-γ対MΦ +IFN-γ | 4913 | -712.2 から 10537 | いいえ | ns | 0.1101 |
| MΦ 対 MΦ + IFN-γ | 16521 | 10896から22145 | はい | **** | <0.0001 |
| 50分 | |||||
| MSC/MΦ vs. MΦ | 5657 | 32.12 から 11282 | はい | * | 0.0481 |
| MSC/MΦ + IFN-γ対MΦ +IFN-γ | 4932 | -692.9 から 10557 | いいえ | ns | 0.1079 |
| MΦ 対 MΦ + IFN-γ | 19083 | 13458から24708 | はい | **** | <0.0001 |
| 60分 | |||||
| MSC/MΦ vs. MΦ | 12376 | 6752年~18001年 | はい | **** | <0.0001 |
| MSC/MΦ + IFN-γ対MΦ +IFN-γ | 9361 | 3736年~14986年 | はい | *** | 0.0002 |
| MΦ 対 MΦ + IFN-γ | 24748 | 19123年から30373年まで | はい | **** | <0.0001 |
| 70分 | |||||
| MSC/MΦ vs. MΦ | 13770 | 8145年から19395年まで | はい | **** | <0.0001 |
| MSC/MΦ + IFN-γ対MΦ +IFN-γ | 11987 | 6362 から 17612 | はい | **** | <0.0001 |
| MΦ 対 MΦ + IFN-γ | 27264 | 21639 から 32888 | はい | **** | <0.0001 |
表3:図3Aに示すデータの詳細な統計分析図 3Aに示されたデータの有意な双方向 ANOVA 後の Tukey の多重比較テストの結果。
補足ファイル1:最適な実験からの生の運動データの代表的なスプレッドシートファイル。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
pH感受性色素に結合した生体粒子を用いた貪食の分析は、従来の蛍光標識粒子12、19、20よりも有利であることが証明された比較的新しいツールである。従来の蛍光標識粒子では、エンドポイント分析のみが可能です。検出は、食細胞によって取り込まれていない粒子を洗浄または消毒した後、蛍光顕微鏡および/または分光蛍光法で行われます。分光フルオロメトリーから得られた定量的データは、非巻き込み粒子を検出する可能性を有し、そして細胞内粒子のみを定量する画像解析は、従来の蛍光顕微鏡システム14を用いて、退屈で時間のかかる。pH感受性染料に結合した生体粒子は、食道体などの酸性環境でのみ蛍光を発し、したがって、退屈な洗浄および焼入工程は不要である14。さらに、pH感受性標識化されたバイオ粒子は、FITCや他の蛍光圏共役生物粒子では容易に取得できない運動データを提供するという利点を提供します。
この新しいツールを用いた研究では、フローサイトメトリーおよび/またはイメージングプラットフォームを用いて、食細胞活性19、20、21の定量的および運動的測定を生成した。フローサイトメトリーは、限られた食細胞集団がある場合、または遺伝的スクリーン19のような下流の分析のためのソートに興味がある場合に有利である。MSCは、直接接触と可溶性因子の両方を通じてMΦ表現型を調節することが知られている。予備的研究は、MSCからのコンディショム培地がMΦ貪食を抑制したことを示しており、したがって、このプロトコルは、MSCと直接共培養中にMΦ貪食活性の変化を決定するように設計された。これらの条件下では、分光フルオロメトリーは、貪食活性を可視化および確認するために定量および動的イメージングすることが最も適切である。
これらの方法の成功に不可欠なのは、細胞密度の最適化です。MSCは、MΦ細胞との最適な細胞接触を可能にする密度でメッキする必要があります。MΦは、最適な接触を可能にするだけでなく、最適な蛍光検出を可能にする密度でモノおよび共培養にシードされる必要があります。密度が低すぎると、食道に低く組み込まれ、相対的な蛍光単位の小さなまたは平坦な変化が生じる(図3B)。MΦが高密度で播種されると、貪食が急速に増加し、グループ間の差異の検出がマスクされます(図3C)。細胞数あたりのザイモサン粒子を標識したpH感受性色素の濃度を最適化することも重要である。MSCとMΦの細胞密度、およびMΦ細胞あたりの粒子数を最適化するための予備実験を行う必要があります。さらに、これらの最適化手順は、 大腸菌 や S.アウレウスなどの他の標識されたバイオ粒子が使用される場合に行われるべきです。
適切なイメージング媒体も重要です。両方の方法の媒体は、緩衝媒体であるべきであり、フェノールレッドを含んではなりません.フェノール赤色は蛍光発光の検出をミュートします。また、培地を酸性化できる添加剤または条件は、標識粒子を早期に活性化し、高い背景を導入する。試薬ブランクは、培地の酸性化の可能性を特定するために重要です。
これらのプロトコルは、様々なpH感受性生体粒子のMΦ貪食症のMSC調節を調べるだけでなく、好中球および他の食細胞を含む様々な共培養モデルにも適用することができる。さらに、このモデルを用いることで、マクロファージ貪食活性の細胞接触媒介調節に関与していると疑われる分子および経路を、siRNAまたはCRISPR媒介ダウンレギュレーションを介して、疑わしい分子標的を検証または反論することができる。潜在的な標的には、接着分子、貪食受容体、およびインテグリン分子が含まれる。
これらの方法を用いた研究は、MSCとの細胞接触相互作用後のMΦの貪食応答の増加の基礎となるシグナル伝達メカニズムに関する新しい情報を明らかにし、MSCが自然免疫を調節する役割を理解する。このような研究は、研究対象領域に対処し、MSCがマクロファージ活動に与える影響の全体像を生み出し、免疫における彼らの役割を完全に理解するために必要である。
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Disclosures
著者は宣言する利害の対立を持っていません。
Acknowledgments
この研究は、NSFの主要な研究機器メカニズムによって、1626093および1919583の助成金の下で支えられた。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96 Well Black Polystyrene Microplate | MilliporeSigma | CLS3603-48EA | |
| 0.4% trypan blue solution | MilliporeSigma | T8154-20ML | |
| 15 mL and 50 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | ThermoFisher | 339653 | |
| 4-well Chambered Coverglass w/ non-removable wells | ThermoFisher | 155382PK | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) Gibco | ThermoFisher | 15240096 | |
| Axiobserver 7 Imaging System | Zeiss | ||
| Bovine Serum Albumin (BSA) | MilliporeSigma | A8806-1G | |
| Cell lifter | MilliporeSigma | CLS3008-100EA | |
| Culture flasks, tissue culture treated, surface area 75 cm2, canted neck, with cap, filtered | MilliporeSigma | C7231-120EA | |
| D1 ORL UVA [D1] | ATCC | CRL-12424 | Mouse MSC Cell Line |
| DMEM, High Glucose | ThermoFisher | 11965092 | |
| Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated | ThermoFisher | 16140071 | |
| Hemocytometer | FisherScientific | 02-671-51B | |
| I-11.15 | ATCC | CRL-2470 | Mouse MΦ Cell Line |
| LADMAC Cell Line | ATCC | CRL-2420 | LADMAC cells secrete the growth factor colony stimulating factor 1 (CSF-1). |
| Live-Cell Imaging solution | ThermoFisher | A14291DJ | |
| PBS, pH 7.4 | ThermoFisher | 10010031 | |
| pHrodo Green Zymosan Bioparticles Conjugate | ThermoFisher | P35365 | |
| Recombinant Murine IFN-γ | Preprotech | 315-05 | |
| Spectramax i3X | Molecular Devices | ||
| Sterile Single Use Vacuum Filter Units, 250 mL, 0.2 µm | ThermoFisher | 568-0020 | |
| Sterile syringe filters, 0.2 micrometer | ThermoFisher | 723-2520 | |
| Tissue-culture treated culture dishes, 100 mm x 20 mm | MilliporeSigma | CLS430167-100EA | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | ThermoFisher | 25300054 |
References
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