Regulación de células madre mesenquimales de la fagocitosis de macrófagos; Cuantificación e imágenes
Summary
Aquí se presenta un protocolo para cuantificar y producir imágenes dinámicas de la regulación mediada por células madre mesenquimales (MSC) de la fagocitosis de macrófagos (MΦ) de partículas de levadura no opsonizada (zymosan) que se conjugan con una molécula fluorescente sensible al pH.
Abstract
Las células madre mesenquimales (MSC) se han estudiado tradicionalmente por sus propiedades regenerativas, pero más recientemente, sus características inmunorreguladoras han estado a la vanguardia. Interactúan y regulan la actividad de las células inmunes. El enfoque de este estudio es la regulación MSC de la actividad fagocítica de los macrófagos. La fagocitosis de macrófagos (MΦ) es una parte importante de la respuesta del sistema inmune innato a la infección, y los mecanismos a través de los cuales msc modulan esta respuesta están bajo investigación activa. Aquí se presenta un método para estudiar la fagocitosis MΦ de partículas de zymosan no opsonizadas conjugadas a una molécula fluorescente sensible al pH mientras están en coculto con MSC. A medida que aumenta la actividad fagocítica y las partículas de zymosan etiquetadas están encerradas dentro del ambiente ácido del faglisosoma, la intensidad de fluorescencia de la molécula sensible al pH aumenta. Con las longitudes de onda de excitación y emisión apropiadas, la actividad fagocítica se mide utilizando un espectrofotómetro fluorescente y los datos cinéticos se presentan como cambios en las unidades fluorescentes relativas durante un período de 70 minutos. Para apoyar estos datos cuantitativos, el cambio en la actividad fagocítica se visualiza utilizando imágenes dinámicas. Los resultados que utilizan este método demuestran que cuando se está en coculto, msc mejora la fagocitosis MΦ de la zymosan no opsonizada de MΦ tanto naïve como IFN-γ tratada. Estos datos se suman al conocimiento actual de la regulación MSC del sistema inmune innato. Este método se puede aplicar en futuras investigaciones para delinear completamente los mecanismos celulares y moleculares subyacentes.
Introduction
Las células madre mesenquimales (MSC) son células progenitoras que dan lugar a células de tejido conectivo. Los MSC están presentes en tejidos de mamíferos adultos y se pueden aislar de la médula ósea1. Debido a sus propiedades inmunomoduladoras, estas células son ampliamente estudiadas2. Los primeros estudios se centraron en la regulación MSC de las células T3,4,5,6, pero más recientemente, su regulación de las células macrófagos (MΦ), un componente celular importante de la inmunidad innata, ha recibido una mayor atención7,8,9,10,11,12,13,14 . La importancia de la interacción MSC-MΦ en el tratamiento de la enfermedad inflamatoria se ve subrayada por el hecho de que el agotamiento de monocitos/macrófagos abroga los efectos terapéuticos de MSC en modelos animales8. Aquí, el foco es la interacción de contacto celular del MSC con MΦ. Los MSC tienen la capacidad de regular el fenotipo de MΦ promoviendo el cambio de respuestas inflamatorias a antiinflamatorias, lo que lleva a actividades de reparación de tejidos8,9,10,11,y se ha hecho mucho para demostrar estos mecanismos reguladores. En otras circunstancias, MSC puede apoyar o exacerbar una respuesta inflamatoria impulsada por MΦ12,13 y mejorar la actividad fagocítica de MΦ14,15. Sin embargo, existe una falta crítica de datos existentes que identifiquen los mecanismos y las condiciones bajo las cuales MSC regula la actividad fagocítica MΦ.
Los MΦ tienen familias de receptores que reconocen patógenos opsonizados (recubiertos de anticuerpos o complemento) o no opsonizados que conducen a la fagocitosis16. La activación y actividad de este último está menos estudiada17. En un ambiente in vitro no inflamatorio, los MSC mejoran la fagocitosis MΦ de patógenos no opsonizados13. Sin embargo, el reconocimiento de patógenos no opsonizados por MΦ puede reducirse después de la exposición a un ambiente inflamatorio producido por linfocitos durante una respuesta inmune adaptativa. El IFN-γ, liberado por las células asesinas naturales y los linfocitos efectores, tiene un efecto inhibidor sobre la fagocitosis MΦ de partículas no opsonizadas18. Se desarrolló un modelo de coculto para estudiar los mecanismos de regulación del contacto directo MSC de la fagocitosis MΦ. El objetivo del experimento presentado aquí es determinar si los MSC regulan la fagocitosis MΦ de patógenos no opsonizados después de que MΦ haya sido expuesto al IFN-γ(Figura 1).
Protocol
Representative Results
Discussion
El análisis de la fagocitosis utilizando biopartículas conjugadas a un colorante sensible al pH es una herramienta relativamente nueva que ha demostrado ser ventajosa sobre las partículas tradicionales etiquetadas con fluorescentes12,19,20. Con las partículas tradicionales etiquetadas con fluorescentes, solo es factible el análisis de punto final. La detección se realiza con microscopía fluorescente y/o espectrofluorometr…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por el mecanismo del Instrumento Principal de Investigación de la NSF bajo los números de subvención 1626093 y 1919583.
Materials
| 96 Well Black Polystyrene Microplate | MilliporeSigma | CLS3603-48EA | |
| 0.4% trypan blue solution | MilliporeSigma | T8154-20ML | |
| 15 mL and 50 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | ThermoFisher | 339653 | |
| 4-well Chambered Coverglass w/ non-removable wells | ThermoFisher | 155382PK | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) Gibco | ThermoFisher | 15240096 | |
| Axiobserver 7 Imaging System | Zeiss | ||
| Bovine Serum Albumin (BSA) | MilliporeSigma | A8806-1G | |
| Cell lifter | MilliporeSigma | CLS3008-100EA | |
| Culture flasks, tissue culture treated, surface area 75 cm2, canted neck, with cap, filtered | MilliporeSigma | C7231-120EA | |
| D1 ORL UVA [D1] | ATCC | CRL-12424 | Mouse MSC Cell Line |
| DMEM, High Glucose | ThermoFisher | 11965092 | |
| Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated | ThermoFisher | 16140071 | |
| Hemocytometer | FisherScientific | 02-671-51B | |
| I-11.15 | ATCC | CRL-2470 | Mouse MΦ Cell Line |
| LADMAC Cell Line | ATCC | CRL-2420 | LADMAC cells secrete the growth factor colony stimulating factor 1 (CSF-1). |
| Live-Cell Imaging solution | ThermoFisher | A14291DJ | |
| PBS, pH 7.4 | ThermoFisher | 10010031 | |
| pHrodo Green Zymosan Bioparticles Conjugate | ThermoFisher | P35365 | |
| Recombinant Murine IFN-γ | Preprotech | 315-05 | |
| Spectramax i3X | Molecular Devices | ||
| Sterile Single Use Vacuum Filter Units, 250 mL, 0.2 µm | ThermoFisher | 568-0020 | |
| Sterile syringe filters, 0.2 micrometer | ThermoFisher | 723-2520 | |
| Tissue-culture treated culture dishes, 100 mm x 20 mm | MilliporeSigma | CLS430167-100EA | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | ThermoFisher | 25300054 |
References
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