Mesenchymal stamcelleregulering av makrofag fagocytose; Kvantasjon og avbildning
Summary
Presentert her er en protokoll for å kvantifisere og produsere dynamiske bilder av mesenchymal stamcelle (MSC) mediert regulering av makrofag (MΦ) fagocytose av ikke-opsoniserte gjær (zymosan) partikler som er konjugert til et pH-følsomt fluorescerende molekyl.
Abstract
Mesenchymale stamceller (MSC) har tradisjonelt blitt studert for deres regenerative egenskaper, men nylig har deres immunregulatoriske egenskaper vært i forkant. De samhandler med og regulerer immuncelleaktivitet. Fokuset i denne studien er MSC-regulering av makrofagsfagsfaglig fagocytisk aktivitet. Makrofag (MΦ) fagocytose er en viktig del av den medfødte immunsystemresponsen på infeksjon, og mekanismene som MSC modulerer denne responsen gjennom, er under aktiv undersøkelse. Presentert her er en metode for å studere MΦ fagocytose av ikke-opsoniserte zymosan partikler konjugert til en pH-sensitiv fluorescerende molekyl mens i samkultur med MSC. Etter hvert som fagocytisk aktivitet øker og de merkede zymosiske partiklene er omsluttet av det sure miljøet i fagoclysosomet, øker fluorescensintensiteten til det pH-sensitive molekylet. Med passende eksitasjons- og utslippsbølgelengder måles fagocytisk aktivitet ved hjelp av et fluorescerende spektrofotometer og kinetiske data presenteres som endringer i relative fluorescerende enheter over en 70 minutters periode. For å støtte disse kvantitative dataene visualiseres endringen i fagocytisk aktivitet ved hjelp av dynamisk avbildning. Resultater ved hjelp av denne metoden viser at NÅR du er i samkultur, forbedrer MSC MΦ fagocytose av ikke-opsonisert zymosan av både naiv og IFN-γ behandlet MΦ. Disse dataene legger til den nåværende kunnskapen om MSC-regulering av det medfødte immunforsvaret. Denne metoden kan brukes i fremtidige undersøkelser for å avgrense de underliggende cellulære og molekylære mekanismene fullt ut.
Introduction
Mesenchymale stamceller (MSC) er stamceller som gir opphav til bindevevsceller. MSC er til stede i voksen pattedyrvev og kan isoleres fra benmargen1. På grunn av deres immunmodulerende egenskaper studeres disse cellene mye2. Tidlige studier fokusert på MSC regulering av T-celler3,4,5,6 men mer nylig, deres regulering av makrofagceller (MΦ), en viktig cellulær komponent av medfødt immunitet, har fått økt oppmerksomhet7,8,9,10,11,12,13,14 . Betydningen av MSC-MΦ interaksjon i behandlingen av inflammatorisk sykdom understrekes av det faktum at uttømming av monocytter / makrofager avviker de terapeutiske effektene av MSC i dyremodeller8. Her er fokuset cellekontaktinteraksjonen til MSC med MΦ. MSC har kapasitet til å regulere fenotypen til MΦ ved å fremme overgangen fra inflammatoriske til antiinflammatoriske responser, noe som fører til vevsreparasjonsaktiviteter8,9,10,11, og mye er gjort for å demonstrere disse regulatoriske mekanismene. Under andre omstendigheter kan MSC støtte eller forverre en MΦ-drevet inflammatorisk respons12,13 og forbedre MΦ fagocytisk aktivitet14,15. Det er imidlertid en kritisk mangel på eksisterende data som identifiserer mekanismene der og forholdene som MSC regulerer MΦ fagocytisk aktivitet under.
MΦ har familier av reseptorer som gjenkjenner enten opsonisert (antistoff eller komplementert belagt) eller ikke-opsoniserte patogener som fører til fagocytose16. Aktiveringen og aktiviteten til sistnevnte er mindre godt studert17. I et ikke-inflammatorisk in vitromiljø forbedrer MSC MΦ fagocytose av ikke-opsoniserte patogener13. Imidlertid kan anerkjennelse av ikke-opsoniserte patogener av MΦ reduseres etter eksponering for et inflammatorisk miljø produsert av lymfocytter under en adaptiv immunrespons. IFN-γ, utgitt av naturlige morderceller og effektorlymfocytter, har en hemmende effekt på MΦ fagocytose av ikke-opsoniserte partikler18. En samkulturmodell ble utviklet for å studere mekanismene for MSC direkte kontaktregulering av MΦ fagocytose. Målet med eksperimentet som presenteres her er å avgjøre om MSC regulerer MΦ fagocytose av ikke-opsoniserte patogener etter at MΦ har blitt utsatt for IFN-γ (Figur 1).
Protocol
Representative Results
Discussion
Analyse av fagocytose ved hjelp av biopartikler konjugert til en pH-sensitiv fargestoff er et relativt nytt verktøy som har vist seg fordelaktig i forhold til tradisjonelle fluorescerende merkede partikler12,19,20. Med tradisjonelle fluorescerende merkede partikler er bare sluttpunktanalyse mulig. Deteksjon utføres med fluorescerende mikroskopi og/eller spektrofluormetri etter vask eller slukking av partikler som ikke er tatt …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av NSF Major Research Instrument-mekanismen under tilskuddstall 1626093 og 1919583.
Materials
| 96 Well Black Polystyrene Microplate | MilliporeSigma | CLS3603-48EA | |
| 0.4% trypan blue solution | MilliporeSigma | T8154-20ML | |
| 15 mL and 50 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | ThermoFisher | 339653 | |
| 4-well Chambered Coverglass w/ non-removable wells | ThermoFisher | 155382PK | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) Gibco | ThermoFisher | 15240096 | |
| Axiobserver 7 Imaging System | Zeiss | ||
| Bovine Serum Albumin (BSA) | MilliporeSigma | A8806-1G | |
| Cell lifter | MilliporeSigma | CLS3008-100EA | |
| Culture flasks, tissue culture treated, surface area 75 cm2, canted neck, with cap, filtered | MilliporeSigma | C7231-120EA | |
| D1 ORL UVA [D1] | ATCC | CRL-12424 | Mouse MSC Cell Line |
| DMEM, High Glucose | ThermoFisher | 11965092 | |
| Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated | ThermoFisher | 16140071 | |
| Hemocytometer | FisherScientific | 02-671-51B | |
| I-11.15 | ATCC | CRL-2470 | Mouse MΦ Cell Line |
| LADMAC Cell Line | ATCC | CRL-2420 | LADMAC cells secrete the growth factor colony stimulating factor 1 (CSF-1). |
| Live-Cell Imaging solution | ThermoFisher | A14291DJ | |
| PBS, pH 7.4 | ThermoFisher | 10010031 | |
| pHrodo Green Zymosan Bioparticles Conjugate | ThermoFisher | P35365 | |
| Recombinant Murine IFN-γ | Preprotech | 315-05 | |
| Spectramax i3X | Molecular Devices | ||
| Sterile Single Use Vacuum Filter Units, 250 mL, 0.2 µm | ThermoFisher | 568-0020 | |
| Sterile syringe filters, 0.2 micrometer | ThermoFisher | 723-2520 | |
| Tissue-culture treated culture dishes, 100 mm x 20 mm | MilliporeSigma | CLS430167-100EA | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | ThermoFisher | 25300054 |
References
- Phinney, D. G., Prockop, D. J. Concise review: Mesenchymal stem/multipotent stromal cells: The state of transdifferentiation and modes of tissue repair–current views. Stem Cells. 25 (11), 2896-2902 (2007).
- Bernardo, M. E., Fibbe, W. E. Mesenchymal stromal cells: sensors and switchers of inflammation. Cell Stem Cell. 13 (4), 392-402 (2013).
- Tobin, L. M., Healy, M. E., English, K., Mahon, B. P. Human mesenchymal stem cells suppress donor CD4(+) T cell proliferation and reduce pathology in a humanized mouse model of acute graft-versus-host disease. Clinical and Experimental Immunology. 172 (2), 333-348 (2013).
- Giuliani, M., et al. Long-lasting inhibitory effects of fetal liver mesenchymal stem cells on T-lymphocyte proliferation. PLoS One. 6 (5), 19988 (2011).
- Plumas, J., Chaperot, L., Richard, M. J., Molens, J. P., Bensa, J. C., Favrot, M. C. Mesenchymal stem cells induce apoptosis of activated T cells. Leukemia. 19 (9), 1597-1604 (2005).
- Luz-Crawford, P., et al. Mesenchymal stem cells generate a CD4+CD25+Foxp3+ regulatory T cell population during the differentiation process of Th1 and Th17 cells. Stem Cell Research & Therapy. 4 (3), 65 (2013).
- Waterman, R. S., Tomchuck, S. L., Henkle, S. L., Betancourt, A. M. A new mesenchymal stem cell (MSC) paradigm: Polarization into a pro-inflammatory MSC1 or an Immunosuppressive MSC2 phenotype. PLoS One. 5 (4), 10088 (2010).
- Nemeth, K., et al. marrow stromal cells attenuate sepsis via prostaglandin E(2)-dependent reprogramming of host macrophages to increase their Interleukin-10 production. Nature Medicine. 15 (1), 42-49 (2009).
- Maggini, J., et al. Mouse Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stromal Cells Turn Activated Macrophages into a Regulatory-Like Profile. PLoS One. 5 (2), 9252 (2010).
- Takizawa, N., et al. marrow-derived mesenchymal stem cells propagate immunosuppressive/anti-inflammatory macrophages in cell-to-cell contact-independent and-dependent manners under hypoxic culture. Experimental Cell Research. 358 (2), 411-420 (2017).
- Kim, J., Hematti, P. Mesenchymal stem cell-educated macrophages: a novel type of alternatively activated macrophages. Experimental Hematology. 37 (12), 1445-1453 (2009).
- Evans, J. F., Salvador, V., George, S., Trevino-Gutierrez, C., Nunez, C. Mouse aorta-derived mesenchymal progenitor cells contribute to and enhance the immune response of macrophage cells under inflammatory conditions. Stem Cell Research & Therapy. 6 (1), 56 (2015).
- Cho, D. I., et al. Mesenchymal stem cells reciprocally regulate the M1/M2 balance in mouse bone marrow-derived macrophages. Experimental Molecular Medicine. 46, 70 (2014).
- Fernandez, N., et al. Mouse mesenchymal progenitor cells expressing adipogenic and osteogenic transcription factors suppress the macrophage inflammatory response. Stem Cells International. 2017, 5846257 (2017).
- Jackson, M. V., et al. Mitochondrial transfer via tunneling nanotubes is an important mechanism by which mesenchymal stem cells enhance macrophage phagocytosis in the in vitro and in vivo models of ARDS. Stem Cells. 34 (8), 2210-2223 (2016).
- Chaplin, D. D. Overview of the immune response. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 125 (2), 3-23 (2010).
- Lim, J., et al. Characterizing the mechanisms of nonopsonic uptake of cryptococci by macrophages. Journal of Immunology. 200 (10), 3539-3546 (2018).
- Wang, Z., et al. Interferon-γ inhibits nonopsonized phagocytosis of macrophages via an mTORC1-c/EBP pathway. Journal of Innate Immunity. 7 (2), 165-176 (2015).
- Lindner, B., Burkard, T., Schuler, M. Phagocytosis assays with different PH-sensitive fluorescent particles and various readouts. Biotechniques. 68, 245-250 (2020).
- Kapellos, T. S., et al. A novel real time imaging platform to quantify macrophage pahgocytosis. Biochemical Pharmacology. 116, 107-119 (2016).
- Takahashi, D., et al. Flow cytometric quantitation of platelet phagocytosis by monocytes using a pH-sensitive dye, pHrodo-SE. Journal of Immunological Methods. 447, 57-64 (2017).
