الكشف الآلي عالي الإنتاجية عن الالتزام البكتيري بالخلايا المضيفة
Summary
الكشف عن التفاعلات الممرضة البكتيرية المضيفة على أساس الالتزام phenotypic باستخدام عالية الإنتاجية التصوير الوسم الفلوري جنبا إلى جنب مع أساليب التحليل الإحصائي الآلي تمكن التقييم السريع للتفاعلات البكتيرية المحتملة مع الخلايا المضيفة.
Abstract
تحديد مسببات الأمراض البكتيرية الناشئة أمر بالغ الأهمية لصحة الإنسان وأمنه. يعد الالتزام البكتيري بالخلايا المضيفة خطوة أساسية في العدوى البكتيرية ويشكل سمة مميزة للتهديد المحتمل. لذلك ، يمكن استخدام فحص التزام البكتيريا بالخلايا المضيفة كعنصر من عناصر تقييم التهديد البكتيري. وهناك طريقة قياسية لتعداد الالتزام البكتيري للخلايا المضيفة هو المشاركة في احتضان البكتيريا مع الخلايا المضيفة، وحصاد البكتيريا الملتصقة، ولوحة الخلايا المحصودة على وسائل الإعلام الصلبة، ومن ثم عد وحدات تشكيل مستعمرة الناتجة (CFU). بدلا من ذلك، يمكن تقييم الالتزام البكتيري بالخلايا المضيفة باستخدام النهج القائمة على المجهر المناعي. بيد أن الاستراتيجيات التقليدية لتنفيذ هذه النهج تستغرق وقتا طويلا ولا تتسم بالكفاءة. هنا، يتم وصف طريقة التصوير الآلي المضروبة القائمة على الفلورسينس التي تم تطويرها مؤخرا. عند دمجها مع معالجة الصور عالية الإنتاجية والتحليل الإحصائي ، تمكن الطريقة من التحديد الكمي السريع للبكتيريا التي تلتزم بالخلايا المضيفة. تم اختبار نوعين بكتيريين ، السودوموناس aeruginosa سلبية الغرام والليستيريا monocytogenes إيجابية الغرام والضوابط السلبية المقابلة ، لإثبات البروتوكول. وتبين النتائج أن هذا النهج يعدد بسرعة ودقة البكتيريا الملتصقة ويقلل بشكل كبير من أعباء العمل التجريبية والجداول الزمنية.
Introduction
الالتصاق البكتيري هو عملية حيث ترتبط البكتيريا بالخلايا أو الأسطح الأخرى. النجاح في إنشاء العدوى من قبل مسببات الأمراض البكتيرية يتطلب التصاق الخلايا المضيفة، والاستعمار من الأنسجة، وفي بعض الحالات، غزو الخلايا المضيفة1،2،3. تشكل الأمراض المعدية الناشئة تهديدات رئيسية للصحة العامة، كما يتضح من جائحة COVID-19 الأخيرة4و5و6. والأهم من ذلك، قد لا يمكن تمييز مسببات الأمراض الجديدة أو الناشئة بسهولة باستخدام النهج القائمة على الجينوم، لا سيما في الحالات التي تم فيها تصميم العامل الممرض للتهرب من الكشف أو لا يحتوي على توقيعات جينومية تحدده على أنه مسبب للأمراض. لذلك ، فإن تحديد مسببات الأمراض المحتملة باستخدام الطرق التي تقيم مباشرة السمات المميزة للتسبب في المرض ، مثل الالتزام البكتيري بالخلايا المضيفة ، يمكن أن يلعب دورا حاسما في تحديد مسببات الأمراض.
وقد استخدم الالتزام البكتيري للخلايا المضيفة لتقييم آليات الإمراض البكتيري لعقود1،7. التصوير المجهري8،9 وعدد وحدة تشكيل المستعمرة البكتيرية (CFU)10،11،12،13 عن طريق طلاء ما بعد العدوى هما طريقتان مختبريتان متطورتان لاختبار الالتزام الميكروبي و / أو عدوى الخلايا المضيفة14. بالنظر إلى حجم مقياس ميكرومتر للخلايا البكتيرية ، فإن تعداد الخلايا البكتيرية الملتصقة يتطلب بشكل عام استخدام تقنيات المجهر المتقدمة عالية التكبير ، وكذلك نهج التصوير عالي الدقة ، بما في ذلك المجهر الإلكتروني ، والتنظير المجهري التوسعي (ExM)15،16، والتصوير ثلاثي الأبعاد17 . بدلا من ذلك ، يمكن إجراء تعداد البكتيريا المرتبطة أو المستوعبة داخل الخلايا المضيفة عن طريق طلاء سلسلة التخفيف من البكتيريا المحصودة على أجار صلب وحساب CFUsالناتجة 10،12،13. هذه الطريقة شاقة وتتضمن العديد من الخطوات اليدوية ، والتي تقدم صعوبات في إنشاء إجراء موحد أو آلي مطلوب للتحليلات عالية الإنتاجية18،19. ولذلك، فإن تطوير أساليب جديدة لتقييم مرفق الخلية المضيفة سيعالج القيود الحالية في الحقل.
ويرد وصف إحدى هذه الطرق هنا التي تستخدم المجهر الآلي عالية الإنتاجية، جنبا إلى جنب مع معالجة الصور ذات الإنتاجية العالية والتحليل الإحصائي. لإثبات هذا النهج ، تم إجراء تجارب مع العديد من مسببات الأمراض البكتيرية ، بما في ذلك Pseudomonas aeruginosa، وهو ممرض بكتيري انتهازي سلبي الغرام من البشر والحيوانات والنباتات14،20، والذي غالبا ما يتم العثور عليه لاستعمار الجهاز التنفسي للمرضى الذين يعانون من ضعف وظائف الدفاع المضيف. هذا النهج الأمثل لعملية التصوير المجهرية الموصوفة في الدراسات السابقة14،20. تم تبسيط الكشف عن التصوير من خلال الخلايا المضيفة والبكتيريا ذات العلامات الفلورية لتتبع قربها بسرعة ، مما قلل بشكل كبير من عبء عمل المجهر للحصول على صور عالية الدقة لتمييز البكتيريا. بالإضافة إلى ذلك ، حل التحليل الإحصائي الآلي للصور في عد الخلايا المضيفة والبكتيريا محل التجربة اليدوية للطلاء البكتيري CFU لتقدير نسبة العد البكتيري الملتصق لكل خلية مضيفة. لتأكيد توافق هذه الطريقة ، تم اختبار العديد من السلالات البكتيرية وأنواع الخلايا المضيفة ، مثل الليستيريا أحادية الخلايا، المكورات العنقودية، عصيات cereus ، والالتهاب الرئوي Klebsiella ، وكذلك الخلايا البطانية الوريدية البشرية (HUVECs) ، وتدعم النتائج تنوع وفعالية الطريقة.
Protocol
Representative Results
Discussion
يصف البروتوكول أسلوب تلقائي لتعداد المرفق البكتيري بالخلايا المضيفة. 10- والنهج الموصوف له عدة مزايا جذابة على الأساليب التقليدية. أولا، يمكن هذا النهج من التحديد الكمي الدقيق لعدد الخلايا المسببة للأمراض الميكروبية المرتبطة بالخلايا المضيفة الفردية. الأهم من ذلك، يمكن إجراء هذا القياس ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونحن ممتنون للدكتور كايت زلوتكوفسكي من شركة بيوتيك لدعمهم التقني. وقد تم دعم هذا العمل من قبل وزارة الدفاع بموجب رقم العقد W911NF1920013 إلى PdF ووكالة مشاريع البحوث المتقدمة الدفاعية (DARPA) ووزارة الداخلية بموجب العقد رقم 140D6319C0029 إلى PdF. ولا يعكس محتوى المعلومات بالضرورة موقف الحكومة أو سياستها، ولا ينبغي الاستدلال على أي تأييد رسمي.
Materials
| 10x PBS | VWR | 45001-130 | |
| 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Thermo Fisher | 62248 | Host cell staining dye |
| 96 well plate | Corning | 3882 | Half area well, flat clear bottom |
| A549 cells | ATCC | CCL 185 | Mammalian cell line |
| BactoView Live Red | Biotium | 40101 | Bacteria staning dye |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| CFSE cell division tracker | BioLegend | 423801 | |
| Cytation 5 | BioTek | Cytation 5 | Cell imaging multi-mode reader |
| E. coli | Laboratory stock | ||
| EGM bulletKit | Lonza | CC-3124 | HUVEC cell culture medium |
| EHEC | NIST collections | ||
| F-12k medium | ATCC | 302004 | A549 cell culture medium |
| Fetal bovine serum | Corning | 35-016-CV | |
| HUVEC | Laboratory stock | ||
| L. monocytogenes | NIST collections | ||
| OD600 DiluPhotometer | IMPLEN | ||
| P. aeruginosa | Dr. Lori Burrows laboratory stock | ||
| P. aeruginosa ΔpilA | Dr. Lori Burrows laboratory stock | ||
| S. agalactiae | NIST collections | ||
| S. aureus | BEI | NR-46543 | |
| S. aureus ΔsaeR | BEI | NR-48164 | |
| S. rubidaea | NIST collections | ||
| Typical soy broth | Growcells | MBPE-4040 |
References
- Pizarro-Cerda, J., Cossart, P. Bacterial adhesion and entry into host cells. Cell. 124, 715-727 (2006).
- Kipnis, E., Sawa, T., Wiener-Kronish, J. Targeting mechanisms of Pseudomonas aeruginosa pathogenesis. Médecine et Maladies Infectieuses. 36 (2), 78-91 (2006).
- Josse, J., Laurent, F., Diot, A. Staphylococcal adhesion and host cell invasion: Fibronectin-binding and other mechanisms. Frontiers in Microbiology. 8, 2433 (2017).
- Cabibbo, G., Rizzo, G. E. M., Stornello, C., Craxì, A. SARS-CoV-2 infection in patients with a normal or abnormal liver. Journal of Viral Hepatitis. 28 (1), 4-11 (2021).
- Ortiz-Prado, E., et al. Clinical, molecular, and epidemiological characterization of the SARS-CoV-2 virus and the Coronavirus Disease 2019 (COVID-19), a comprehensive literature review. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 98 (1), 115094 (2020).
- Chang, C. C., Senining, R., Kim, J., Goyal, R. An acute pulmonary coccidioidomycosis coinfection in a patient presenting with multifocal pneumonia with COVID-19. Journal of Investigative Medicine High Impact Case Reports. 8, (2020).
- Woo, V., et al. Microbiota inhibit epithelial pathogen adherence by epigenetically regulating C-type lectin expression. Frontiers in Immunology. 10, 928 (2019).
- Pandey, A., et al. Global reprogramming of host kinase signaling in response to fungal infection. Cell Host Microbe. 21 (5), 637-649 (2017).
- Ding, S., et al. Interactions between fungal hyaluronic acid and host CD44 promote internalization by recruiting host autophagy proteins to forming phagosomes. iScience. 24 (3), 102192 (2021).
- Qin, Q. M., et al. RNAi screen of endoplasmic reticulum-associated host factors reveals a role for IRE1alpha in supporting Brucella replication. PLoS Pathogens. 4 (7), 1000110 (2008).
- Qin, Q. M., et al. Functional analysis of host factors that mediate the intracellular lifestyle of Cryptococcus neoformans. PLoS Pathogens. 7 (6), 1002078 (2011).
- Qin, Q. M., et al. A tractable Drosophila cell system enables rapid identification of Acinetobacter baumannii host factors. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 240 (2020).
- Pandey, A., et al. Activation of host IRE1α-dependent signaling axis contributes the intracellular parasitism of Brucella melitensis. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 8, 103 (2018).
- Chi, E., Mehl, T., Nunn, D., Lory, S. Interaction of Pseudomonas aeruginosa with A549 pneumocyte cells. Infection and Immunity. 59 (3), 822-828 (1990).
- Götz, R., et al. Nanoscale imaging of bacterial infections by sphingolipid expansion microscopy. Nature Communications. 11, 6173 (2020).
- Lim, Y., et al. Mechanically resolved imaging of bacteria using expansion microscopy. PLOS Biology. 17 (10), 3000268 (2019).
- Bratton, B. P., Barton, B., Morgenstein, R. M. Three-dimensional Imaging of bacterial cells for accurate cellular representations and precise protein localization. Journal of Visualized Experiments. (152), e60350 (2019).
- Hoffmann, S., et al. High-throughput quantification of bacterial-cell interactions using virtual colony counts. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 8, 43 (2018).
- Hazan, R., Que, Y. -. A., Maura, D., Rahme, L. G. A method for high throughput determination of viable bacteria cell counts in 96-well plates. BMC Microbiology. 12 (1), 259 (2012).
- Gellatly, S. L., Hancock, R. E. W. Pseudomonas aeruginosa: new insights into pathogenesis and host defenses. Pathogens and Disease. 67, 159-173 (2013).
- Jiang, R. D., Shen, H., Piao, Y. J. The morphometrical analysis on the ultrastructure of A549 cells. Romanian Journal of Morphology and Embryology. 51 (4), 663-667 (2010).
- Farinha, M. A., et al. Alteration of the pilin adhesin of Pseudomonas aeruginosa PAO results in normal pilus biogenesis but a loss of adherence to human pneumocyte cells and decreased virulence in mice. Infection and Immunity. 62 (10), 4118-4123 (1994).
- Réglier-Poupet, H., Pellegrini, E., Charbit, A., Berche, P. Identification of LpeA, a PsaA-Like membrane protein that promotes cell entry by Listeria monocytogenes. Infection and immunity. 71 (1), 474-482 (2003).
- Ortega, F. E., et al. Adhesion to the host cell surface is sufficient to mediate Listeria monocytogenes entry into epithelial cells. Molecular Biology of the Cell. 28 (22), 2945-2957 (2017).
