Automatiserad, hög genomströmningsdetektering av bakteriell efterlevnad av värdceller
Summary
Detektion av värd-bakteriell patogen interaktioner baserat på fenotypisk vidhäftning med hjälp av hög genomströmning fluorescens märkning märkning imaging tillsammans med automatiserade statistiska analys metoder möjliggör snabb utvärdering av potentiella bakteriella interaktioner med värdceller.
Abstract
Identifiering av framväxande bakteriella patogener är avgörande för människors hälsa och säkerhet. Bakteriell följsamhet till värdceller är ett viktigt steg i bakteriella infektioner och utgör ett kännetecken för potentiellt hot. Därför kan undersökning av vidhäftningen av bakterier till värdceller användas som en komponent i bakteriell hotbedömning. En standardmetod för att räkna upp bakteriell vidhäftning till värdceller är att samtidigt inkubera bakterier med värdceller, skörda de vidhäftande bakterierna, plätera de skördade cellerna på fasta medier och sedan räkna de resulterande kolonibildande enheterna (CFU). Alternativt kan bakteriell vidhäftning till värdceller utvärderas med hjälp av immunofluorescensmikroskopibaserade metoder. Konventionella strategier för att genomföra dessa metoder är dock tidskrävande och ineffektiva. Här beskrivs en nyligen utvecklad automatiserad fluorescensmikroskopibaserad avbildningsmetod. I kombination med bildbehandling med hög genomströmning och statistisk analys möjliggör metoden snabb kvantifiering av bakterier som håller sig till värdceller. Två bakteriearter, gramnegativa Pseudomonas aeruginosa och grampositiva Listeria monocytogenes och motsvarande negativa kontroller, testades för att påvisa protokollet. Resultaten visar att detta tillvägagångssätt snabbt och exakt räknar upp vidhäftande bakterier och avsevärt minskar experimentella arbetsbelastningar och tidslinjer.
Introduction
Bakteriell vidhäftning är en process där bakterier fäster vid andra celler eller ytor. Framgångsrik etablering av infektion av bakteriella patogener kräver vidhäftning för att vara värdceller, kolonisering av vävnader och i vissa fall invasion av värdceller1,2,3. Nya infektionssjukdomar utgör stora hot mot folkhälsan, vilket framgår av den senaste covid-19-pandemin4,5,6. Viktigt är att nya eller framväxande patogener inte lätt kan urskiljas med hjälp av genomiska metoder, särskilt i fall där patogenen har konstruerats för att undvika upptäckt eller inte innehåller genomiska signaturer som identifierar den som patogen. Därför kan identifiering av potentiella patogener med metoder som direkt bedömer kännetecken för patogenicitet, som bakteriell vidhäftning till värdceller, spela en avgörande roll i patogenidentifiering.
Bakteriell vidhäftning till värdceller har använts för att utvärdera mekanismer för bakteriell patogenes i årtionden1,7. Mikroskopisk avbildning8,9 och uppräkning av bakteriell kolonibildande enhet (CFU)10,11,12,13 genom plätering efter infektion är två välutvecklade laboratoriemetoder för testning av mikrobiell vidhäftning och/eller infektion i värdceller14. Med tanke på bakteriecellernas mikrometerskala kräver uppräkningen av de vidhäftande bakteriecellerna i allmänhet användning av avancerade mikroskopitekniker med hög förstoring, liksom högupplösta avbildningsmetoder, inklusive elektronmikroskopi, expansionsmikroskopi (ExM)15,16och tredimensionell avbildning17 . Alternativt kan uppräkning av bakterier som är bundna till eller internaliserade i värdceller utföras genom att plätera utspädningsserien av skördade bakterier på fast agar och räkna de resulterande CFUs10,12,13. Denna metod är mödosam och innehåller många manuella steg, vilket introducerar svårigheter att upprätta en standardiserad eller automatiserad procedur som krävs för analyser med hög genomströmning18,19. Därför skulle utvecklingen av nya metoder för utvärdering av värdcellbilaga ta itu med aktuella begränsningar i fältet.
En sådan metod beskrivs här som använder automatiserad hög genomströmningsmikroskopi, kombinerat med bildbehandling med högt genomströmning och statistisk analys. För att demonstrera tillvägagångssättet utfördes experiment med flera bakteriella patogener, inklusive Pseudomonas aeruginosa, en opportunistisk gramnegativ bakteriell patogen hos människor, djur och växter14,20, som ofta finns för att kolonisera andningsorganen hos patienter med nedsatt värdförsvarsfunktioner. Detta tillvägagångssätt optimerade den mikroskopiska avbildningsprocessen som beskrivs i tidigare studier14,20. Bildframställningsdetekteringen förenklades av fluorescensmärkta värdceller och bakterier för att snabbt spåra närheten till dem, vilket dramatiskt minskade mikroskopibelastningen för att få högupplösta bilder för att särskilja bakterier. Dessutom ersatte den automatiserade statistiska analysen av bilder vid räkning av värdceller och bakterier det hand-on experimentet med bakteriell CFU-plätering för att uppskatta förhållandet mellan vidhäftande bakterieantal per värdcell. För att bekräfta kompatibiliteten hos denna metod har flera bakteriestammar och värdcelltyper också testats, som Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus, Bacillus cereus och Klebsiella pneumoniae, liksom mänskliga navelvensendotelceller (HUVECs), och resultaten stöder metodens mångfald och effektivitet.
Protocol
Representative Results
Discussion
Protokollet beskriver en automatiserad metod för att räkna upp bakteriell bilaga till värdceller. Det beskrivna tillvägagångssättet har flera attraktiva fördelar jämfört med konventionella metoder. För det första möjliggör detta tillvägagångssätt exakt kvantifiering av antalet mikrobiella patogenceller som är kopplade till enskilda värdceller. Viktigt är att denna kvantifiering kan utföras utan behov av mödosam bakteriell skörd, seriella utspädningar, plätering på fasta medier och bestämning av …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi är tacksamma mot Dr. Kaite Zlotkowski på Biotek Inc. för deras tekniska support. Detta arbete stöddes av försvarsdepartementet under kontraktsnummer W911NF1920013 till PdF, Defense Advanced Research Projects Agency (DARPA) och inrikesdepartementet under kontrakt nr 140D6319C0029 till PdF. Innehållet i informationen återspeglar inte nödvändigtvis regeringens ståndpunkt eller politik, och inget officiellt godkännande bör härledas.
Materials
| 10x PBS | VWR | 45001-130 | |
| 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Thermo Fisher | 62248 | Host cell staining dye |
| 96 well plate | Corning | 3882 | Half area well, flat clear bottom |
| A549 cells | ATCC | CCL 185 | Mammalian cell line |
| BactoView Live Red | Biotium | 40101 | Bacteria staning dye |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| CFSE cell division tracker | BioLegend | 423801 | |
| Cytation 5 | BioTek | Cytation 5 | Cell imaging multi-mode reader |
| E. coli | Laboratory stock | ||
| EGM bulletKit | Lonza | CC-3124 | HUVEC cell culture medium |
| EHEC | NIST collections | ||
| F-12k medium | ATCC | 302004 | A549 cell culture medium |
| Fetal bovine serum | Corning | 35-016-CV | |
| HUVEC | Laboratory stock | ||
| L. monocytogenes | NIST collections | ||
| OD600 DiluPhotometer | IMPLEN | ||
| P. aeruginosa | Dr. Lori Burrows laboratory stock | ||
| P. aeruginosa ΔpilA | Dr. Lori Burrows laboratory stock | ||
| S. agalactiae | NIST collections | ||
| S. aureus | BEI | NR-46543 | |
| S. aureus ΔsaeR | BEI | NR-48164 | |
| S. rubidaea | NIST collections | ||
| Typical soy broth | Growcells | MBPE-4040 |
References
- Pizarro-Cerda, J., Cossart, P. Bacterial adhesion and entry into host cells. Cell. 124, 715-727 (2006).
- Kipnis, E., Sawa, T., Wiener-Kronish, J. Targeting mechanisms of Pseudomonas aeruginosa pathogenesis. Médecine et Maladies Infectieuses. 36 (2), 78-91 (2006).
- Josse, J., Laurent, F., Diot, A. Staphylococcal adhesion and host cell invasion: Fibronectin-binding and other mechanisms. Frontiers in Microbiology. 8, 2433 (2017).
- Cabibbo, G., Rizzo, G. E. M., Stornello, C., Craxì, A. SARS-CoV-2 infection in patients with a normal or abnormal liver. Journal of Viral Hepatitis. 28 (1), 4-11 (2021).
- Ortiz-Prado, E., et al. Clinical, molecular, and epidemiological characterization of the SARS-CoV-2 virus and the Coronavirus Disease 2019 (COVID-19), a comprehensive literature review. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 98 (1), 115094 (2020).
- Chang, C. C., Senining, R., Kim, J., Goyal, R. An acute pulmonary coccidioidomycosis coinfection in a patient presenting with multifocal pneumonia with COVID-19. Journal of Investigative Medicine High Impact Case Reports. 8, (2020).
- Woo, V., et al. Microbiota inhibit epithelial pathogen adherence by epigenetically regulating C-type lectin expression. Frontiers in Immunology. 10, 928 (2019).
- Pandey, A., et al. Global reprogramming of host kinase signaling in response to fungal infection. Cell Host Microbe. 21 (5), 637-649 (2017).
- Ding, S., et al. Interactions between fungal hyaluronic acid and host CD44 promote internalization by recruiting host autophagy proteins to forming phagosomes. iScience. 24 (3), 102192 (2021).
- Qin, Q. M., et al. RNAi screen of endoplasmic reticulum-associated host factors reveals a role for IRE1alpha in supporting Brucella replication. PLoS Pathogens. 4 (7), 1000110 (2008).
- Qin, Q. M., et al. Functional analysis of host factors that mediate the intracellular lifestyle of Cryptococcus neoformans. PLoS Pathogens. 7 (6), 1002078 (2011).
- Qin, Q. M., et al. A tractable Drosophila cell system enables rapid identification of Acinetobacter baumannii host factors. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 240 (2020).
- Pandey, A., et al. Activation of host IRE1α-dependent signaling axis contributes the intracellular parasitism of Brucella melitensis. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 8, 103 (2018).
- Chi, E., Mehl, T., Nunn, D., Lory, S. Interaction of Pseudomonas aeruginosa with A549 pneumocyte cells. Infection and Immunity. 59 (3), 822-828 (1990).
- Götz, R., et al. Nanoscale imaging of bacterial infections by sphingolipid expansion microscopy. Nature Communications. 11, 6173 (2020).
- Lim, Y., et al. Mechanically resolved imaging of bacteria using expansion microscopy. PLOS Biology. 17 (10), 3000268 (2019).
- Bratton, B. P., Barton, B., Morgenstein, R. M. Three-dimensional Imaging of bacterial cells for accurate cellular representations and precise protein localization. Journal of Visualized Experiments. (152), e60350 (2019).
- Hoffmann, S., et al. High-throughput quantification of bacterial-cell interactions using virtual colony counts. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 8, 43 (2018).
- Hazan, R., Que, Y. -. A., Maura, D., Rahme, L. G. A method for high throughput determination of viable bacteria cell counts in 96-well plates. BMC Microbiology. 12 (1), 259 (2012).
- Gellatly, S. L., Hancock, R. E. W. Pseudomonas aeruginosa: new insights into pathogenesis and host defenses. Pathogens and Disease. 67, 159-173 (2013).
- Jiang, R. D., Shen, H., Piao, Y. J. The morphometrical analysis on the ultrastructure of A549 cells. Romanian Journal of Morphology and Embryology. 51 (4), 663-667 (2010).
- Farinha, M. A., et al. Alteration of the pilin adhesin of Pseudomonas aeruginosa PAO results in normal pilus biogenesis but a loss of adherence to human pneumocyte cells and decreased virulence in mice. Infection and Immunity. 62 (10), 4118-4123 (1994).
- Réglier-Poupet, H., Pellegrini, E., Charbit, A., Berche, P. Identification of LpeA, a PsaA-Like membrane protein that promotes cell entry by Listeria monocytogenes. Infection and immunity. 71 (1), 474-482 (2003).
- Ortega, F. E., et al. Adhesion to the host cell surface is sufficient to mediate Listeria monocytogenes entry into epithelial cells. Molecular Biology of the Cell. 28 (22), 2945-2957 (2017).
