دليل لطخة والغطس تجميد العينات البيولوجية للجسيمات المفردة المجهر الإلكترون المبردة
Summary
تحدد هذه المخطوطة طريقة النشاف والغطس لتجميد العينات البيولوجية يدويا للفحص المجهري الإلكتروني المبرد بجسيمات واحدة.
Abstract
تصوير العينات البيولوجية مع الإلكترونات لتحديد هيكل عالية الدقة عن طريق المجهر الإلكتروني المبردة جسيمات واحدة (cryoEM) يتطلب طبقة رقيقة من الجليد الزجاجي التي تحتوي على الجزيئات الحيوية ذات الأهمية. على الرغم من التقدم التكنولوجي العديد في السنوات الأخيرة التي دفعت cryoEM جسيم واحد إلى طليعة البيولوجيا الهيكلية، والأساليب التي يتم بها تهتز العينات للتصوير عالية الدقة غالبا ما تبقى الخطوة التي تحد من معدل. على الرغم من أن العديد من الجهود الأخيرة وفرت وسائل للتغلب على العقبات التي كثيرا ما تواجه خلال تزجيج العينة ، بما في ذلك تطوير دعامات عينة جديدة وأجهزة التزجيج المبتكرة ، فإن المكبس التقليدي الذي يتم تشغيله يدويا لا يزال عنصرا أساسيا في مجتمع cryoEM بسبب انخفاض تكلفة الشراء وسهولة التشغيل. هنا، نقدم أساليب مفصلة لاستخدام معيار، على غرار المقصلة تعمل يدويا جهاز لطخة والغطس لتزجيج العينات البيولوجية للتصوير عالية الدقة من قبل cryoEM جسيم واحد. بالإضافة إلى ذلك، عادة ما تواجه مشكلات وتوصيات استكشاف الأخطاء وإصلاحها عندما يفشل إعداد قياسي في إنتاج عينة مناسبة يتم وصفها أيضا.
Introduction
المجهر الإلكتروني المبرد أحادي الجسيمات (cryoEM) هو تقنية هيكلية قوية يمكن استخدامها لحل هياكل العينات البيولوجية الديناميكية إلى الدقة شبه الذرية1،2،3،4. في الواقع ، التطورات الأخيرة في تقنيات كشف الإلكترونات المباشرة4،5،6،7،8،9،10 ، والتحسينات في مصادر الإلكترونات4،11،12،13،14 ، واستقرار العدسة الكهرومغناطيسية15 ، إلى جانب التطوير المستمر للحصول على البيانات 16,17 وحزم برامج التحليل18,19, مكنت الباحثين من تحديد هياكل العينات حسنة السلوك بشكل روتيني الآن إلى 3 دقة Å أو أفضل4,11,13,14,20,21,22,23 . على الرغم من هذه القدرات المحسنة للتصوير ومعالجة البيانات ، لا يزال إعداد شبكة cryoEM أكبر عائق أمام تحديد الهيكل عالي الدقة الناجح وغالبا ما يكون بمثابة اختناق كبير في سير عمل EM24،25،26،27.
تعتمد CryoEM على تصوير العينات البيولوجية في المحاليل المائية المجمدة لتشكيل فيلم رقيق من الجليد “الشبيه بالزجاج” – وهي عملية تعرف باسم التزجيج – تحافظ على الحالة الكيميائية الحيوية الأصلية. يعود تاريخ تزجيج العينات البيولوجية للكريويم إلى أكثر من 40 عاما28,29,30 وتعتمد العديد من التقنيات والمعدات التي تم تطويرها لهذه العملية على طريقة النشاف والغطس المفصلة في الأصل31,32,33,34,35 ، حيث يتم تطبيق حجم صغير من العينة (على سبيل المثال، 1-5 ميكرولتر) على شبكة EM متخصصة قبل إزالة المحلول الزائد باستخدام التفاعل المادي للشبكة مع ورق النشاف. عادة ما يتم تحديد توقيت هذه العملية تجريبيا لكل عينة كمكون حاسم لعينات التجميد هو سمك فيلم الجليد الزجاجي – إذا كان الجليد سميكا جدا ، فإن جودة التصوير تتدهور بشكل كبير بسبب زيادة تشتت شعاع الإلكترون في حين أن الجليد الرقيق جدا يمكن أن يحد من اتجاهات البروتين و / أو يستبعد الجسيمات من وسط ثقوب رقائق الشبكة36 . وقد أدى هذا الاعتماد على سمك الجليد المثالي لالتبريد أحادي الجسيمات إلى مجموعة واسعة من التقنيات والمعدات التي يمكن تجميد العينات، بما في ذلك الروبوتات37،38، microfluidics42، وأجهزة الموجات فوق الصوتية أو الرش27،39،40،41،42،43،44 . في السنوات الأخيرة ، تعتمد بعض أجهزة إعداد العينات الأكثر شعبية على استخدام الروبوتات للتجميد الآلي للعينات باستخدام تقنية النشاف والغطس45. في حين تم تصميم هذه الأجهزة لخلق سمك الجليد بشكل مستنسخ مناسب للتصوير ، إلا أنها غالبا ما تظل مكلفة للغاية بالنسبة للمختبرات الفردية للشراء والتشغيل وتوجد بشكل عام داخل مرافق cryoEM بأسعار الساعة للاستخدام. في السنوات الأخيرة، عادت تقنية النشاف والغطس اليدوية الأصلية إلى الاستخدام المتزايد3,47,48,49,50,51,52. في الواقع ، يمكن لجهاز النشاف والغطس الذي يتم تشغيله يدويا تحقيق شبكات cryoEM عالية الجودة بجزء صغير من تكلفة النظراء الروبوتيين. وعلاوة على ذلك ، فإن النشاف اليدوي يوفر أيضا المزيد من المستخدمين التحكم في النشاف حيث يمكن للباحثين ضبط نوع النشاف (أي النشاف الخلفي للشبكة ، والنشاف الأمامي للشبكة ، وما إلى ذلك) ، ووقت النشاف استنادا إلى كل عينة على حدة وأسئلة البحث.
في هذه المقالة، نقدم تفاصيل حول كيفية تجميد العينات البيولوجية بشكل فعال باستخدام جهاز التزجيج اليدوي التقليدي إلى جانب منصة dewar مصممة خصيصا53. وتقدم أفضل الممارسات، بما في ذلك إعداد cryogen، والتعامل مع الشبكة، وتطبيق العينة، والنشاف، فضلا عن المزالق المشتركة والتوصيات حول كيفية التغلب على هذه العقبات. وتناقش المشورة بشأن كيفية زيادة سمك الجليد استنساخ بين الاستعدادات الشبكة وكيفية تعديل النشاف عينة على أساس نوع العينة البيولوجية. نظرا لانخفاض التكلفة المرتبطة بشراء وتشغيل المكبس اليدوي الموصوف في هذه المخطوطة، يمكن للمختبرات في جميع أنحاء العالم إعداد عينات بيولوجية للكريويم بطريقة فعالة من حيث التكلفة وقابلة للاستنساخ.
Protocol
Representative Results
Discussion
لا يزال تزجيج العينات البيولوجية للتصوير عن طريق المجهر الإلكتروني المبرد أحادي الجسيمات (cryoEM) خطوة بالغة الأهمية لتحديد الهيكل الناجح. تمثل طريقة النشاف والغطس اليدوية الموصوفة في هذا البروتوكول طريقة فعالة من حيث التكلفة وموثوقة وقوية لتجميد العينات البيولوجية بسرعة في أفلام رقيقة من…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر أعضاء مختبر هيرزيك على التفكير النقدي وتقديم الملاحظات حول هذه المخطوطة ومحتوى الفيديو. M.A.H.Jr. مدعوم من قبل NIH R35 GM138206 وكباحث سيرل. H.P.M.N مدعوم بمنحة التدريب على الفيزياء الحيوية الجزيئية (NIH T32 GM008326). كما نود أن نشكر بيل أندرسون وتشارلز بومان والدكتور غابرييل لاندر في معهد سكريبس للأبحاث للمساعدة في تصميم وتجميع واختبار المكبس اليدوي المعروض في الفيديو.
Materials
| 4 slot grid storage box | Ted Pella | 160-40 | |
| 14 gauge flat metal dispensing tip | Amazon | B07M7YWWLT | |
| 22×22 mm square glass coverslip | Sigma | C9802-1PAK | |
| 60 mm glass Petri dish to store grids | Fisher | 08-747A | |
| 100 mm glass Petri dish to store Whatman paper | Fisher | 08-747D | |
| 150 mm glass Petri dish to store Whatman paper | Fisher | 08-747F | |
| 250 mL beaker | Fisher | 02-555-25B | |
| Blue styrofoam dewar | Spear Lab | FD-500 | |
| Brass ethane vessel | Lasco | 17-4075 | |
| Clamping tweezers | Ted Pella | 38825 | |
| Delicate task wipes | Fisher | 06-666 | |
| Dual-stage regulator with control valve | Airgas | Y12N245D580-AG | |
| Dewer grid base | UCSD | ||
| Ethane platform | UCSD | ||
| Ethane propane tank | Praxair | ET PR50ZU-G | ethane (50%) : propane (50%) in a high-pressure tank |
| Ethane tank | Praxair | UN1035 | ethane (100%) |
| Flexible arm task light | Amscope | LED-11CR | |
| Grids (UltrAufoil R 1.2/1.3 300 mesh) | Electron Microscopy Sciences | Q325AR1.3 | |
| Humidifier | Target | 719438 | |
| Hygrometer | ThermoPro | B01H1R0K68 | |
| Lab coat | UCSD | ||
| Liquid Nitrogen dewar | Worthington | LD4 | |
| Liquid Nitrogen gloves | Fisher | 19-059-925 | |
| Manual plunger stand (black stand + foot pedal) | UCSD | ||
| Mark 5 (plunging platform) | UCSD | ||
| Nitrile gloves | VWR | 82026-424 | |
| P20 pipette | Eppendorf | 13-690-029 | |
| PCR tubes | Eppendorf | E0030124286 | |
| Pipette tips | ibis scientific | 63300005 | |
| Ring lamp | Amazon | B07HMR4H8G | |
| Safety glasses | UCSD | ||
| Scissors | Amazon | Fiskars 01-004761J | |
| Screw driver | Ironside | 354711 | |
| Tape | Fisher | 15-901-10R | |
| Tweezer to transfer grid box | Amazon | LTS-3 | |
| Tygon tubing | Fisher | 14-171-130 | |
| Whatman blotting paper | Fisher | 1001-090 |
References
- Hofmann, S., et al. Conformation Space of a Heterodimeric ABC Exporter under Turnover Conditions. Nature. 571 (7766), 580-583 (2019).
- Fica, S. M., Nagai, K. Cryo-Electron Microscopy Snapshots of the Spliceosome: Structural Insights into a Dynamic Ribonucleoprotein Machine. Nature Structural & Molecular Biology. 24 (10), 791-799 (2017).
- Hirschi, M., et al. Cryo-Electron Microscopy Structure of the Lysosomal Calcium-Permeable Channel TRPML3. Nature. 550 (7676), 411-414 (2017).
- Nakane, T., et al. Single-Particle Cryo-EM at Atomic Resolution. Nature. 587 (7832), 152-156 (2020).
- Li, X., Zheng, S. Q., Egami, K., Agard, D. A., Cheng, Y. Influence of Electron Dose Rate on Electron Counting Images Recorded with the K2 Camera. Journal of Structural Biology. 184 (2), 251-260 (2013).
- Campbell, M. G., et al. Movies of Ice-Embedded Particles Enhance Resolution in Electron Cryo-Microscopy. Structure. 20 (11), 1823-1828 (2012).
- Brilot, A. F., et al. Beam-Induced Motion of Vitrified Specimen on Holey Carbon Film. Journal of Structural Biology. 177 (3), 630-637 (2012).
- McMullan, G., et al. Experimental Observation of the Improvement in MTF from Backthinning a CMOS Direct Electron Detector. Ultramicroscopy. 109 (9), 1144-1147 (2009).
- Feathers, J. R., Spoth, K. A., Fromme, J. C. Experimental evaluation of super-resolution imaging and magnification choice in single-particle cryo-EM. Journal of Structural Biology: X. 5, 100047 (2021).
- Zheng, S. Q., et al. MotionCor2: Anisotropic Correction of Beam-Induced Motion for Improved Cryo-Electron Microscopy. Nature Methods. 14 (4), 331-332 (2017).
- Yip, K. M., Fischer, N., Paknia, E., Chari, A., Stark, H. Atomic-Resolution Protein Structure Determination by Cryo-EM. Nature. 587 (7832), 157-161 (2020).
- Fislage, M., Shkumatov, A. V., Stroobants, A., Efremov, R. G. Assessing the JEOL CRYO ARM 300 for High-Throughput Automated Single-Particle Cryo-EM in a Multiuser Environment. IUCrJ. 7 (4), 707-718 (2020).
- Zhang, K., Pintilie, G. D., Li, S., Schmid, M. F., Chiu, W. Resolving Individual Atoms of Protein Complex by Cryo-Electron Microscopy. Cell Research. 30 (12), 1136-1139 (2020).
- Danev, R., Yanagisawa, H., Kikkawa, M. Cryo-Electron Microscopy Methodology: Current Aspects and Future Directions. Trends in Biochemical Sciences. 44 (10), 837-848 (2019).
- Herzik, M. A. Cryo-Electron Microscopy Reaches Atomic Resolution. Nature. 587 (7832), 39-40 (2020).
- Cheng, A., et al. Leginon: New Features and Applications. Protein Science. 30 (1), 136-150 (2021).
- Suloway, C., et al. Automated Molecular Microscopy: The New Leginon System. Journal of Structural Biology. 151 (1), 41-60 (2005).
- de la Rosa-Trevín, J. M., et al. Scipion: A Software Framework toward Integration, Reproducibility and Validation in 3D Electron Microscopy. Journal of Structural Biology. 195 (1), 93-99 (2016).
- Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. CryoSPARC: Algorithms for Rapid Unsupervised Cryo-EM Structure Determination. Nature Methods. 14 (3), 290-296 (2017).
- Danev, R., Tegunov, D., Baumeister, W. Using the Volta Phase Plate with Defocus for Cryo-EM Single Particle Analysis. eLife. 6, 23006 (2017).
- Naydenova, K., Jia, P., Russo, C. J. Cryo-EM with Sub-1 Å Specimen Movement. Science. 370 (6513), 223-226 (2020).
- Watson, Z. L., et al. Structure of the Bacterial Ribosome at 2 Å Resolution. eLife. 9, 60482 (2020).
- Josephs, T. M., et al. Structure and Dynamics of the CGRP Receptor in Apo and Peptide-Bound Forms. Science. 372 (6538), (2021).
- Tan, Y. Z., et al. Addressing Preferred Specimen Orientation in Single-Particle Cryo-EM through Tilting. Nature Methods. 14 (8), 793-796 (2017).
- D’Imprima, E., Floris, D., Joppe, M., Sánchez, R., Grininger, M., Kühlbrandt, W. Protein Denaturation at the Air-Water Interface and How to Prevent It. eLife. 8, 42747 (2019).
- Han, Y., et al. High-Yield Monolayer Graphene Grids for near-Atomic Resolution Cryoelectron Microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (2), 1009-1014 (2020).
- Dandey, V. P., et al. Time-Resolved Cryo-EM Using Spotiton. Nature Methods. 17 (9), 897-900 (2020).
- McDowall, A. W., et al. Electron Microscopy of Frozen Hydrated Sections of Vitreous Ice and Vitrified Biological Samples. Journal of Microscopy. 131 (1), 1-9 (1983).
- Dubochet, J., McDowall, A. W. Vitrification of pure water for electron microscopy. Journal of Microscopy. 124 (3), 3-4 (1981).
- Dubochet, J., McDowall, A. W., Menge, B., Schmid, E. N., Lickfeld, K. G. Electron Microscopy of Frozen-Hydrated Bacteria. Journal of Bacteriology. 155 (1), 381-390 (1983).
- Depelteau, J. S., Koning, G., Yang, W., Briegel, A. An Economical, Portable Manual Cryogenic Plunge Freezer for the Preparation of Vitrified Biological Samples for Cryogenic Electron Microscopy. Microscopy and Microanalysis. 26 (3), 413-418 (2020).
- Dobro, M. J., Melanson, L. A., Jensen, G. J., McDowall, A. W. Plunge Freezing for Electron Cryomicroscopy. Methods in Enzymology. 481, 63-82 (2010).
- Cavalier, A., Spehner, D., Humbel, B. M. Handbook of Cryo-Preparation Methods for Electron Microscopy. Microscopy and Microanalysis. 15 (5), 469-470 (2009).
- Grassucci, R. A., Taylor, D. J., Frank, J. Preparation of Macromolecular Complexes for Cryo-Electron Microscopy. Nat. Protoc. 2 (12), 3239-3246 (2007).
- Carragher, B., et al. Current Outcomes When Optimizing ‘Standard’ Sample Preparation for Single-particle Cryo-EM. Journal of Microscopy. 276 (1), 39-45 (2019).
- Noble, A. J., et al. Routine Single Particle CryoEM Sample and Grid Characterization by Tomography. eLife. 7, 34257 (2018).
- Resch, G. P., Brandstetter, M., Konigsmaier, L., Urban, E., Pickl-Herk, A. M. Immersion Freezing of Suspended Particles and Cells for Cryo-Electron Microscopy. Cold Spring Harbor Protocols. 7, 803-814 (2011).
- Resch, G. P., et al. Immersion Freezing of Biological Specimens: Rationale, Principles, and Instrumentation. Cold Spring Harbor Protocols. 7, 778-782 (2011).
- Jain, T., Sheehan, P., Crum, J., Carragher, B., Potter, C. S. Spotiton: A Prototype for an Integrated Inkjet Dispense and Vitrification System for Cryo-TEM. Journal of Structural Biology. 179 (1), 68-75 (2012).
- Razinkov, I., et al. A New Method for Vitrifying Samples for CryoEM. Journal of Structural Biology. 195 (2), 190-198 (2016).
- Dandey, V. P., et al. Spotiton: New Features and Applications. Journal of Structural Biology. 202 (2), 161-169 (2018).
- Lu, Z., et al. Monolithic Microfluidic Mixing-Spraying Devices for Time-Resolved Cryo-Electron Microscopy. Journal of Structural Biology. 168 (3), 388-395 (2009).
- Feng, X., et al. A Fast and Effective Microfluidic Spraying-Plunging Method for High-Resolution Single-Particle Cryo-EM. Structure. 25 (4), 663-670 (2017).
- Rubinstein, J. L., et al. Shake-It-off: A Simple Ultrasonic Cryo-EM Specimen-Preparation Device. Acta Crystallographica Section D. 75 (12), 1063-1070 (2019).
- Lawson, C. L., et al. EMDataBank.Org: Unified Data Resource for CryoEM. Nucleic Acids Res. 39, 456-464 (2011).
- Frederik, P. M., Hubert, D. H. Cryoelectron Microscopy of Liposomes. Methods in Enzymology. 391, 431-448 (2005).
- Dambacher, C. M., Worden, E. J., Herzik, M. A., Martin, A., Lander, G. C. Atomic Structure of the 26S Proteasome Lid Reveals the Mechanism of Deubiquitinase Inhibition. eLife. 5, 13027 (2016).
- Zubcevic, L., et al. Conformational Ensemble of the Human TRPV3 Ion Channel. Nature Communications. 9 (1), 4773 (2018).
- Zubcevic, L., et al. Cryo-Electron Microscopy Structure of the TRPV2 Ion Channel. Nature Structural & Molecular Biology. 23 (2), 180-186 (2016).
- Yoo, J., Wu, M., Yin, Y., Herzik, M. A., Lander, G. C., Lee, S. -. Y. Cryo-EM Structure of a Mitochondrial Calcium Uniporter. Science. 361 (6401), 506-511 (2018).
- Fribourgh, J. L., et al. Dynamics at the Serine Loop Underlie Differential Affinity of Cryptochromes for CLOCK:BMAL1 to Control Circadian Timing. eLife. 9, 55275 (2020).
- Hirschi, M., et al. AcrIF9 Tethers Non-Sequence Specific DsDNA to the CRISPR RNA-Guided Surveillance Complex. Nature Communications. 11 (1), 2730 (2020).
- Herzik, M. A. Manual-Plunging CryoEM Grids | Herzik Lab. Herzik Lab UCSD. , (2021).
