Tek Parçacıklı Kriyojenik Elektron Mikroskopisi için Biyolojik Örneklerin Manuel Blot ve Dalma Dondurması
Summary
Bu makale, tek parçacıklı kriyojenik elektron mikroskopisi için biyolojik örnekleri manuel olarak dondurmak için leke ve dalma yöntemini özetlemektedir.
Abstract
Tek parçacıklı kriyojenik elektron mikroskopisi (cryoEM) ile yüksek çözünürlüklü yapı tespiti için elektronlu biyolojik örneklerin görüntülenmesi, ilgi çekici biyomolekülleri içeren ince bir vitreus buz tabakası gerektirir. Son yıllarda tek parçacıklı cryoEM’i yapısal biyolojinin ön saflarına taşıyan çok sayıda teknolojik ilerlemeye rağmen, numunelerin yüksek çözünürlüklü görüntüleme için vitrifiye edildiği yöntemler genellikle hız sınırlayıcı adım olmaya devam etmektedir. Son zamanlarda çok sayıda çaba, yeni örnek desteklerinin geliştirilmesi ve yenilikçi vitrifikasyon enstrümantasyonu da dahil olmak üzere numune vitrifikasyonu sırasında sıkça karşılaşılan engellerin üstesinden gelmek için araçlar sağlasa da, geleneksel manuel olarak işletilen piston, düşük satın alma maliyeti ve kullanım kolaylığı nedeniyle cryoEM topluluğunda temel bir unsur olmaya devam etmektedir. Burada, tek parçacıklı cryoEM ile yüksek çözünürlüklü görüntüleme için biyolojik örneklerin vitrifikasyonu için standart, giyotin tarzı elle çalıştırılan blot ve dalma cihazını kullanmak için ayrıntılı yöntemler sunuyoruz. Ayrıca, standart bir preparat uygun bir numune veremediğinde sık karşılaşılan sorunlar ve sorun giderme önerileri de açıklanmıştır.
Introduction
Tek parçacıklı kriyojenik elektron mikroskopisi (cryoEM), dinamik biyolojik örneklerin yapılarını atoma yakın çözünürlüğe çözmek için kullanılabilecek güçlü bir yapısal tekniktir1,2,3,4. Nitekim, doğrudan elektron dedektörü teknolojilerindeki son gelişmeler4,5,6,7,8,9,10, elektron kaynaklarında iyileşmeler4,11,12,13,14 ve elektromanyetik lens stabilitesi15, veri toplamanın sürekli gelişimi ile birleştiğinde 16,17 ve analiz yazılım paketleri18,19, araştırmacıların artık 3 şçözünürlüğe veya daha iyi 4,11,13,14,20,21,22,23’e iyi huylu örneklerin yapılarını rutin olarak belirlemelerini sağladı . Bu gelişmiş görüntüleme ve veri işleme yeteneklerine rağmen, cryoEM ızgara hazırlığı başarılı yüksek çözünürlüklü yapı belirleme için en büyük engel olmaya devam ediyor ve genellikle EM iş akışında önemli bir darboğaz görevi görüyor24,25,26,27.
CryoEM, biyolojik örneklerin, yerel biyokimyasal durumu koruyan “cam benzeri” buzun ince bir filmini oluşturmak için dondurulan sulu çözeltilerde görüntülenmesine dayanır – vitrifikasyon olarak bilinen bir süreç. CryoEM için biyolojik örneklerin vitrifikasyonu 40 yıl öncesine dayanıyor28,29,30 ve bu işlem için geliştirilen birçok teknik ve ekipman başlangıçta ayrıntılı blot ve dalma yöntemine güveniyor31,32,33,34,35 , örneğin, 1-5 μL) küçük bir numune hacminin, ızgaranın şişirme kağıdı ile fiziksel etkileşimi kullanılarak fazla çözelti çıkarılmadan önce özel bir EM ızgarasına uygulandığı yer. Bu işlemin zamanlaması genellikle her numune için ampirik olarak belirlenir, çünkü donma örneklerinin kritik bir bileşeni vitreus buz filminin kalınlığıdır – buz çok kalınsa, çok ince olan buz protein yönelimlerini kısıtlayabilir ve / veya parçacıkları ızgara folyo deliklerinin merkezinden dışlayabilirken elektron ışınının daha fazla saçılması nedeniyle görüntüleme kalitesi önemli ölçüde bozulur36 . Tek parçacıklı cryoEM için mükemmel buz kalınlığına olan bu güven, robotik37,38, mikroakışkanlar42 ve ultrasonik veya püskürtme cihazları27,39,40,41,42,43,44 dahil olmak üzere örnekleri dondurabilen çok çeşitli teknik ve ekipmanlara yol açmıştır. . Son yıllarda, en popüler numune hazırlama cihazlarından bazıları, blot ve dalma tekniğini kullanarak numunelerin otomatik olarak dondurulması için robotik kullanımına güveniyor45. Bu cihazlar görüntüleme için uygun buz kalınlığını yeniden oluşturmak üzere tasarlanmış olsa da, genellikle bireysel laboratuvarların satın alması ve çalışması için çok pahalı kalır ve genellikle kullanım için saatlik fiyatlarla cryoEM tesislerinde bulunur. Son yıllarda, orijinal manuel blot-and-plunge tekniği artmış kullanıma geri döndü3,47,48,49,50,51,52. Gerçekten de, elle çalıştırılan bir blot-and-plunge cihazı, robotik meslektaşlarının maliyetinin çok altında yüksek kaliteli cryoEM ızgaraları elde edebilir. Ayrıca, manuel şişkinlik, araştırmacılar her bir örnek ve araştırma sorusuna göre şişkinlik türünü (örneğin, ızgaranın geri blottingi, ızgaranın ön blottingi vb.) ve blotting süresini ayarlayabildiğinden, daha fazla kullanıcıya şişkinlik üzerinde kontrol sağlar.
Bu makalede, özel tasarlanmış bir dewar platformu53 ile birlikte geleneksel bir manuel blot ve dalma vitrifikasyon cihazı kullanarak biyolojik örneklerin etkili bir şekilde nasıl dondurulacağı hakkında ayrıntılı bilgi veriyoruz. Kriyojenin hazırlanması, ızgara işleme, örnek uygulama ve şişkinlik dahil olmak üzere en iyi uygulamaların yanı sıra bu engellerin nasıl aşılacağına dair yaygın tuzaklar ve öneriler sağlanmaktadır. Izgara preparatları arasında buz kalınlığı tekrarlanabilirliğinin nasıl artırılacağı ve numune şişkinliğinin biyolojik numune tipine göre nasıl değiştirilerek değiştirilmeleri konusunda tavsiyeler tartışılmıştır. Bu yazıda açıklanan manuel pistonun satın alınması ve işletilmesiyle ilgili düşük maliyet göz önüne alındığında, dünyanın dört bir yanındaki laboratuvarlar cryoEM için biyolojik örnekleri uygun maliyetli ve tekrarlanabilir bir şekilde hazırlayabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Tek parçacıklı kriyojenik elektron mikroskopisi (cryoEM) ile görüntüleme için biyolojik örneklerin vitrifikasyonu, başarılı yapı tespiti için kritik öneme sahip bir adım olmaya devam etmektedir. Bu protokolde açıklanan manuel blot-and-plunge yöntemi, cryoEM görüntüleme için ince vitreus buz filmlerindeki biyolojik örneklerin hızlı bir şekilde dondurulması için uygun maliyetli, güvenilir ve sağlam bir yöntemi temsil eder. Araştırmacılar, el yazmasında belirtilen yöntemleri kullanarak ma…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Herzik laboratuvar üyelerine bu makale ve video içeriği hakkında eleştirel düşünmeleri ve geri bildirimde bulunmaları için teşekkür ederiz. M.A.H.Jr. NIH R35 GM138206 ve Searle Scholar tarafından desteklenmektedir. H.P.M.N Moleküler Biyofizik Eğitim Hibesi (NIH T32 GM008326) tarafından desteklenmektedir. Ayrıca Scripps Araştırma Enstitüsü’ndeki Bill Anderson, Charles Bowman ve Dr. Gabriel Lander’a videoda gösterilen manuel pistonun tasarlanması, montajı ve testine yardımcı olduğu için teşekkür ederiz.
Materials
| 4 slot grid storage box | Ted Pella | 160-40 | |
| 14 gauge flat metal dispensing tip | Amazon | B07M7YWWLT | |
| 22×22 mm square glass coverslip | Sigma | C9802-1PAK | |
| 60 mm glass Petri dish to store grids | Fisher | 08-747A | |
| 100 mm glass Petri dish to store Whatman paper | Fisher | 08-747D | |
| 150 mm glass Petri dish to store Whatman paper | Fisher | 08-747F | |
| 250 mL beaker | Fisher | 02-555-25B | |
| Blue styrofoam dewar | Spear Lab | FD-500 | |
| Brass ethane vessel | Lasco | 17-4075 | |
| Clamping tweezers | Ted Pella | 38825 | |
| Delicate task wipes | Fisher | 06-666 | |
| Dual-stage regulator with control valve | Airgas | Y12N245D580-AG | |
| Dewer grid base | UCSD | ||
| Ethane platform | UCSD | ||
| Ethane propane tank | Praxair | ET PR50ZU-G | ethane (50%) : propane (50%) in a high-pressure tank |
| Ethane tank | Praxair | UN1035 | ethane (100%) |
| Flexible arm task light | Amscope | LED-11CR | |
| Grids (UltrAufoil R 1.2/1.3 300 mesh) | Electron Microscopy Sciences | Q325AR1.3 | |
| Humidifier | Target | 719438 | |
| Hygrometer | ThermoPro | B01H1R0K68 | |
| Lab coat | UCSD | ||
| Liquid Nitrogen dewar | Worthington | LD4 | |
| Liquid Nitrogen gloves | Fisher | 19-059-925 | |
| Manual plunger stand (black stand + foot pedal) | UCSD | ||
| Mark 5 (plunging platform) | UCSD | ||
| Nitrile gloves | VWR | 82026-424 | |
| P20 pipette | Eppendorf | 13-690-029 | |
| PCR tubes | Eppendorf | E0030124286 | |
| Pipette tips | ibis scientific | 63300005 | |
| Ring lamp | Amazon | B07HMR4H8G | |
| Safety glasses | UCSD | ||
| Scissors | Amazon | Fiskars 01-004761J | |
| Screw driver | Ironside | 354711 | |
| Tape | Fisher | 15-901-10R | |
| Tweezer to transfer grid box | Amazon | LTS-3 | |
| Tygon tubing | Fisher | 14-171-130 | |
| Whatman blotting paper | Fisher | 1001-090 |
References
- Hofmann, S., et al. Conformation Space of a Heterodimeric ABC Exporter under Turnover Conditions. Nature. 571 (7766), 580-583 (2019).
- Fica, S. M., Nagai, K. Cryo-Electron Microscopy Snapshots of the Spliceosome: Structural Insights into a Dynamic Ribonucleoprotein Machine. Nature Structural & Molecular Biology. 24 (10), 791-799 (2017).
- Hirschi, M., et al. Cryo-Electron Microscopy Structure of the Lysosomal Calcium-Permeable Channel TRPML3. Nature. 550 (7676), 411-414 (2017).
- Nakane, T., et al. Single-Particle Cryo-EM at Atomic Resolution. Nature. 587 (7832), 152-156 (2020).
- Li, X., Zheng, S. Q., Egami, K., Agard, D. A., Cheng, Y. Influence of Electron Dose Rate on Electron Counting Images Recorded with the K2 Camera. Journal of Structural Biology. 184 (2), 251-260 (2013).
- Campbell, M. G., et al. Movies of Ice-Embedded Particles Enhance Resolution in Electron Cryo-Microscopy. Structure. 20 (11), 1823-1828 (2012).
- Brilot, A. F., et al. Beam-Induced Motion of Vitrified Specimen on Holey Carbon Film. Journal of Structural Biology. 177 (3), 630-637 (2012).
- McMullan, G., et al. Experimental Observation of the Improvement in MTF from Backthinning a CMOS Direct Electron Detector. Ultramicroscopy. 109 (9), 1144-1147 (2009).
- Feathers, J. R., Spoth, K. A., Fromme, J. C. Experimental evaluation of super-resolution imaging and magnification choice in single-particle cryo-EM. Journal of Structural Biology: X. 5, 100047 (2021).
- Zheng, S. Q., et al. MotionCor2: Anisotropic Correction of Beam-Induced Motion for Improved Cryo-Electron Microscopy. Nature Methods. 14 (4), 331-332 (2017).
- Yip, K. M., Fischer, N., Paknia, E., Chari, A., Stark, H. Atomic-Resolution Protein Structure Determination by Cryo-EM. Nature. 587 (7832), 157-161 (2020).
- Fislage, M., Shkumatov, A. V., Stroobants, A., Efremov, R. G. Assessing the JEOL CRYO ARM 300 for High-Throughput Automated Single-Particle Cryo-EM in a Multiuser Environment. IUCrJ. 7 (4), 707-718 (2020).
- Zhang, K., Pintilie, G. D., Li, S., Schmid, M. F., Chiu, W. Resolving Individual Atoms of Protein Complex by Cryo-Electron Microscopy. Cell Research. 30 (12), 1136-1139 (2020).
- Danev, R., Yanagisawa, H., Kikkawa, M. Cryo-Electron Microscopy Methodology: Current Aspects and Future Directions. Trends in Biochemical Sciences. 44 (10), 837-848 (2019).
- Herzik, M. A. Cryo-Electron Microscopy Reaches Atomic Resolution. Nature. 587 (7832), 39-40 (2020).
- Cheng, A., et al. Leginon: New Features and Applications. Protein Science. 30 (1), 136-150 (2021).
- Suloway, C., et al. Automated Molecular Microscopy: The New Leginon System. Journal of Structural Biology. 151 (1), 41-60 (2005).
- de la Rosa-Trevín, J. M., et al. Scipion: A Software Framework toward Integration, Reproducibility and Validation in 3D Electron Microscopy. Journal of Structural Biology. 195 (1), 93-99 (2016).
- Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. CryoSPARC: Algorithms for Rapid Unsupervised Cryo-EM Structure Determination. Nature Methods. 14 (3), 290-296 (2017).
- Danev, R., Tegunov, D., Baumeister, W. Using the Volta Phase Plate with Defocus for Cryo-EM Single Particle Analysis. eLife. 6, 23006 (2017).
- Naydenova, K., Jia, P., Russo, C. J. Cryo-EM with Sub-1 Å Specimen Movement. Science. 370 (6513), 223-226 (2020).
- Watson, Z. L., et al. Structure of the Bacterial Ribosome at 2 Å Resolution. eLife. 9, 60482 (2020).
- Josephs, T. M., et al. Structure and Dynamics of the CGRP Receptor in Apo and Peptide-Bound Forms. Science. 372 (6538), (2021).
- Tan, Y. Z., et al. Addressing Preferred Specimen Orientation in Single-Particle Cryo-EM through Tilting. Nature Methods. 14 (8), 793-796 (2017).
- D’Imprima, E., Floris, D., Joppe, M., Sánchez, R., Grininger, M., Kühlbrandt, W. Protein Denaturation at the Air-Water Interface and How to Prevent It. eLife. 8, 42747 (2019).
- Han, Y., et al. High-Yield Monolayer Graphene Grids for near-Atomic Resolution Cryoelectron Microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (2), 1009-1014 (2020).
- Dandey, V. P., et al. Time-Resolved Cryo-EM Using Spotiton. Nature Methods. 17 (9), 897-900 (2020).
- McDowall, A. W., et al. Electron Microscopy of Frozen Hydrated Sections of Vitreous Ice and Vitrified Biological Samples. Journal of Microscopy. 131 (1), 1-9 (1983).
- Dubochet, J., McDowall, A. W. Vitrification of pure water for electron microscopy. Journal of Microscopy. 124 (3), 3-4 (1981).
- Dubochet, J., McDowall, A. W., Menge, B., Schmid, E. N., Lickfeld, K. G. Electron Microscopy of Frozen-Hydrated Bacteria. Journal of Bacteriology. 155 (1), 381-390 (1983).
- Depelteau, J. S., Koning, G., Yang, W., Briegel, A. An Economical, Portable Manual Cryogenic Plunge Freezer for the Preparation of Vitrified Biological Samples for Cryogenic Electron Microscopy. Microscopy and Microanalysis. 26 (3), 413-418 (2020).
- Dobro, M. J., Melanson, L. A., Jensen, G. J., McDowall, A. W. Plunge Freezing for Electron Cryomicroscopy. Methods in Enzymology. 481, 63-82 (2010).
- Cavalier, A., Spehner, D., Humbel, B. M. Handbook of Cryo-Preparation Methods for Electron Microscopy. Microscopy and Microanalysis. 15 (5), 469-470 (2009).
- Grassucci, R. A., Taylor, D. J., Frank, J. Preparation of Macromolecular Complexes for Cryo-Electron Microscopy. Nat. Protoc. 2 (12), 3239-3246 (2007).
- Carragher, B., et al. Current Outcomes When Optimizing ‘Standard’ Sample Preparation for Single-particle Cryo-EM. Journal of Microscopy. 276 (1), 39-45 (2019).
- Noble, A. J., et al. Routine Single Particle CryoEM Sample and Grid Characterization by Tomography. eLife. 7, 34257 (2018).
- Resch, G. P., Brandstetter, M., Konigsmaier, L., Urban, E., Pickl-Herk, A. M. Immersion Freezing of Suspended Particles and Cells for Cryo-Electron Microscopy. Cold Spring Harbor Protocols. 7, 803-814 (2011).
- Resch, G. P., et al. Immersion Freezing of Biological Specimens: Rationale, Principles, and Instrumentation. Cold Spring Harbor Protocols. 7, 778-782 (2011).
- Jain, T., Sheehan, P., Crum, J., Carragher, B., Potter, C. S. Spotiton: A Prototype for an Integrated Inkjet Dispense and Vitrification System for Cryo-TEM. Journal of Structural Biology. 179 (1), 68-75 (2012).
- Razinkov, I., et al. A New Method for Vitrifying Samples for CryoEM. Journal of Structural Biology. 195 (2), 190-198 (2016).
- Dandey, V. P., et al. Spotiton: New Features and Applications. Journal of Structural Biology. 202 (2), 161-169 (2018).
- Lu, Z., et al. Monolithic Microfluidic Mixing-Spraying Devices for Time-Resolved Cryo-Electron Microscopy. Journal of Structural Biology. 168 (3), 388-395 (2009).
- Feng, X., et al. A Fast and Effective Microfluidic Spraying-Plunging Method for High-Resolution Single-Particle Cryo-EM. Structure. 25 (4), 663-670 (2017).
- Rubinstein, J. L., et al. Shake-It-off: A Simple Ultrasonic Cryo-EM Specimen-Preparation Device. Acta Crystallographica Section D. 75 (12), 1063-1070 (2019).
- Lawson, C. L., et al. EMDataBank.Org: Unified Data Resource for CryoEM. Nucleic Acids Res. 39, 456-464 (2011).
- Frederik, P. M., Hubert, D. H. Cryoelectron Microscopy of Liposomes. Methods in Enzymology. 391, 431-448 (2005).
- Dambacher, C. M., Worden, E. J., Herzik, M. A., Martin, A., Lander, G. C. Atomic Structure of the 26S Proteasome Lid Reveals the Mechanism of Deubiquitinase Inhibition. eLife. 5, 13027 (2016).
- Zubcevic, L., et al. Conformational Ensemble of the Human TRPV3 Ion Channel. Nature Communications. 9 (1), 4773 (2018).
- Zubcevic, L., et al. Cryo-Electron Microscopy Structure of the TRPV2 Ion Channel. Nature Structural & Molecular Biology. 23 (2), 180-186 (2016).
- Yoo, J., Wu, M., Yin, Y., Herzik, M. A., Lander, G. C., Lee, S. -. Y. Cryo-EM Structure of a Mitochondrial Calcium Uniporter. Science. 361 (6401), 506-511 (2018).
- Fribourgh, J. L., et al. Dynamics at the Serine Loop Underlie Differential Affinity of Cryptochromes for CLOCK:BMAL1 to Control Circadian Timing. eLife. 9, 55275 (2020).
- Hirschi, M., et al. AcrIF9 Tethers Non-Sequence Specific DsDNA to the CRISPR RNA-Guided Surveillance Complex. Nature Communications. 11 (1), 2730 (2020).
- Herzik, M. A. Manual-Plunging CryoEM Grids | Herzik Lab. Herzik Lab UCSD. , (2021).
