Bu makale, tek parçacıklı kriyojenik elektron mikroskopisi için biyolojik örnekleri manuel olarak dondurmak için leke ve dalma yöntemini özetlemektedir.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Tek Parçacıklı Kriyojenik Elektron Mikroskopisi için Biyolojik Örneklerin Manuel Blot ve Dalma Dondurması
* These authors contributed equally
Bu makalede
Özet
Özet
Tek parçacıklı kriyojenik elektron mikroskopisi (cryoEM) ile yüksek çözünürlüklü yapı tespiti için elektronlu biyolojik örneklerin görüntülenmesi, ilgi çekici biyomolekülleri içeren ince bir vitreus buz tabakası gerektirir. Son yıllarda tek parçacıklı cryoEM'i yapısal biyolojinin ön saflarına taşıyan çok sayıda teknolojik ilerlemeye rağmen, numunelerin yüksek çözünürlüklü görüntüleme için vitrifiye edildiği yöntemler genellikle hız sınırlayıcı adım olmaya devam etmektedir. Son zamanlarda çok sayıda çaba, yeni örnek desteklerinin geliştirilmesi ve yenilikçi vitrifikasyon enstrümantasyonu da dahil olmak üzere numune vitrifikasyonu sırasında sıkça karşılaşılan engellerin üstesinden gelmek için araçlar sağlasa da, geleneksel manuel olarak işletilen piston, düşük satın alma maliyeti ve kullanım kolaylığı nedeniyle cryoEM topluluğunda temel bir unsur olmaya devam etmektedir. Burada, tek parçacıklı cryoEM ile yüksek çözünürlüklü görüntüleme için biyolojik örneklerin vitrifikasyonu için standart, giyotin tarzı elle çalıştırılan blot ve dalma cihazını kullanmak için ayrıntılı yöntemler sunuyoruz. Ayrıca, standart bir preparat uygun bir numune veremediğinde sık karşılaşılan sorunlar ve sorun giderme önerileri de açıklanmıştır.
Giriş
Tek parçacıklı kriyojenik elektron mikroskopisi (cryoEM), dinamik biyolojik örneklerin yapılarını atoma yakın çözünürlüğe çözmek için kullanılabilecek güçlü bir yapısal tekniktir1,2,3,4. Nitekim, doğrudan elektron dedektörü teknolojilerindeki son gelişmeler4,5,6,7,8,9,10, elektron kaynaklarında iyileşmeler4,11....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
1. Manuel dalma ortamını hazırlayın
NOT: Tahmini çalışma süresi: 5-30 dakika
- Manuel pistonu, odayı %100 bağıl neme (RH) yakın tutmak için bir nemlendiricinin birlikte bulunabileceği 4 °C soğuk bir odada bulun (Şekil 1A).
DİkKAT: Manuel pistonun güvenli konumu ve önerilen işlemler için lütfen kurumun Çevre Sağlığı ve Güvenliği yönergelerine bakın. - Izgara hazırlamadan önce, soğuk odanın RH'sinin% 95'≥ emin olmak için soğuk odadaki nemlendiriciyi açın.
NOT: Düşük nemde ızgara hazırlığı, ince filmlerin susuz kalmasına, buharlaşmaya bağlı tampon bileşenlerinin değiştirilmesine ve şebekeden ....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Burada açıklanan blot ve dalma protokolünün başarılı bir şekilde yürütülmesi, elektron mikroskobu altında gözlemlenebilen altıgen buz, kirleticiler ve kullanılamaz buzun büyük gradyanlarından arınmış ince, düzgün bir vitreus buz tabakası ile sonuçlanacaktır (Şekil 3). Şişkinlik kağıdının ızgara yüzeyi ile tutarsız teması, şişkin kağıdın zamanından önce çıkarılması veya ızgara teması sırasında şişkin kağıdın hareket ettirilerek vitreus buzun kalitesi düşebilir ve EM ızgarası boyunca tutarsız .......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Tek parçacıklı kriyojenik elektron mikroskopisi (cryoEM) ile görüntüleme için biyolojik örneklerin vitrifikasyonu, başarılı yapı tespiti için kritik öneme sahip bir adım olmaya devam etmektedir. Bu protokolde açıklanan manuel blot-and-plunge yöntemi, cryoEM görüntüleme için ince vitreus buz filmlerindeki biyolojik örneklerin hızlı bir şekilde dondurulması için uygun maliyetli, güvenilir ve sağlam bir yöntemi temsil eder. Araştırmacılar, el yazmasında belirtilen yöntemleri kullanarak manuel pistonu bir araya getirip çalış.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Açıklayacak bir şeyimiz yok.
Teşekkürler
Herzik laboratuvar üyelerine bu makale ve video içeriği hakkında eleştirel düşünmeleri ve geri bildirimde bulunmaları için teşekkür ederiz. M.A.H.Jr. NIH R35 GM138206 ve Searle Scholar tarafından desteklenmektedir. H.P.M.N Moleküler Biyofizik Eğitim Hibesi (NIH T32 GM008326) tarafından desteklenmektedir. Ayrıca Scripps Araştırma Enstitüsü'ndeki Bill Anderson, Charles Bowman ve Dr. Gabriel Lander'a videoda gösterilen manuel pistonun tasarlanması, montajı ve testine yardımcı olduğu için teşekkür ederiz.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 4 yuvalı ızgara saklama kutusu | Ted Pella | 160-40 | |
| 14 gauge düz metal dağıtım ucu | Amazon | B07M7YWWLT | |
| 22x22 mm kare cam lamel | Sigma | C9802-1PAK | |
| Izgaraları saklamak için 60 mm cam Petri kabı | Fisher | 08-747A | |
| Whatman kağıdını saklamak için 100 mm cam Petri kabı | Fisher | 08-747D | |
| Whatman kağıdını saklamak için 150 mm cam Petri kabı | Fisher | 08-747F | |
| 250 mL beher | Fisher | 02-555-25B | |
| Mavi strafor dewar | Spear Lab | FD-500 | |
| Pirinç etan kabı | Lasco | 17-4075 | |
| Sıkıştırma cımbızı | Ted Pella | 38825 | |
| Hassas görev mendilleri | Fisher | 06-666 | |
| Kontrol vanalı çift kademeli regülatör | Airgas | Y12N245D580-AG | |
| Kanalizasyon şebekesi tabanı | UCSD | ||
| Etan platformu | UCSD | ||
| Etan propan tankı | Praxair | ET PR50ZU-G | etan (%50): yüksek basınçlı tankta propan (%50) |
| Etan tankı | Praxair | UN1035 | etan (%100) |
| Esnek kol görev lambası | Amscope | LED-11CR | |
| Izgaralar (UltrAufoil R 1.2 / 1.3 300 mesh) | Elektron Mikroskobu Bilimleri | Q325AR1.3 | |
| Nemlendirici | Hedef | 719438 | |
| Higrometre | ThermoPro | B01H1R0K68 | |
| Laboratuvar önlüğü | UCSD | ||
| Sıvı Nitrojen dewar | Worthington | LD4 | |
| Sıvı Nitrojen eldivenleri | Fisher | 19-059-925 | |
| Manuel piston standı (siyah stand + ayak pedalı) | UCSD | ||
| Mark 5 (dalma platformu) | UCSD | ||
| Nitril eldivenler | VWR | 82026-424 | |
| P20 pipet | Eppendorf | 13-690-029 | |
| PCR tüpleri | Eppendorf | ||
| Pipet uçları | ibis scientific | 63300005 | |
| Halka lamba | Amazon | B07HMR4H8G | |
| Güvenlik gözlükleri | UCSD | ||
| Makas | Amazon | Fiskars 01-004761J | |
| Tornavida | Ironside | 354711 | |
| Bant | Fisher | 15-901-10R | |
| Izgara kutusunu aktarmak için cımbız | Amazon | LTS-3 | |
| Tygon boru | Fisher | 14-171-130 | |
| Whatman kurutma kağıdı | Fisher | 1001-090 |
Kaynaklar
- Hofmann, S., et al. Conformation Space of a Heterodimeric ABC Exporter under Turnover Conditions. Nature. 571 (7766), 580-583 (2019).
- Fica, S. M., Nagai, K. Cryo-Electron Microscopy Snapshots of....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
