JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Biochemistry

Manuel blot-og-plunge frysning af biologiske prøver til enkelt-partikel kryogen elektronmikroskopi

Published: February 07, 2022
doi:
10.3791/62765
, , ,
1Department of Chemistry and Biochemistry,University of California, San Diego

Summary

Dette manuskript skitserer blot-and-plunge metode til manuelt at fryse biologiske prøver til enkelt-partikel kryogen elektronmikroskopi.

Abstract

Imaging biologiske prøver med elektroner til høj opløsning struktur bestemmelse af enkelt-partikel kryogen elektronmikroskopi (cryoEM) kræver et tyndt lag af glasagtig is, der indeholder biomolekyler af interesse. På trods af talrige teknologiske fremskridt i de seneste år, der har drevet enkelt-partikel cryoEM på forkant med strukturel biologi, de metoder, hvormed prøver er vitrified for høj opløsning billeddannelse ofte forbliver den sats-begrænsende skridt. Selv om talrige nylige bestræbelser har givet midler til at overvinde forhindringer, der ofte opstår under prøve vitrificering, herunder udvikling af nye prøvestøtter og innovativ vitrifikationsinstrumentering, forbliver det traditionelle manuelt betjente stempel et dagligt syn i kryoEM-samfundet på grund af de lave omkostninger til køb og brugervenlighed. Her giver vi detaljerede metoder til brug af en standard, guillotine-stil manuelt betjent blot-and-plunge enhed til vitrificering af biologiske prøver til høj opløsning billeddannelse af enkelt-partikel cryoEM. Derudover beskrives ofte stødte problemer og fejlfindingsanbefalinger til, hvornår et standardpræparat ikke giver en passende prøve.

Introduction

Enkelt-partikel kryogen elektronmikroskopi (cryoEM) er en kraftfuld strukturel teknik, der kan bruges til at løse strukturer af dynamiske biologiske prøver til næsten atomare opløsning1,2,3,4. Faktisk er de seneste fremskridt inden for direkte elektrondetektorteknologier4,5,6,7,8,9,10, forbedringer i elektronkilder4,11,12,13,14 og elektromagnetisk linsestabilitet15 kombineret med den fortsatte udvikling af dataindsamling 16,17 og analyse softwarepakker18,19, har gjort det muligt for forskere til nu rutinemæssigt at bestemme strukturer af velopdragne prøver til 3 Å opløsning eller bedre4,11,13,14,20,21,22,23 . På trods af disse forbedrede billed- og databehandlingsfunktioner er kryoEM-gitterforberedelse fortsat den største hindring for vellykket strukturbestemmelse med høj opløsning og fungerer ofte som en betydelig flaskehals i EM-arbejdsgangen24,25,26,27.

CryoEM er afhængig af billeddannelse af biologiske prøver i vandige opløsninger, der er frosset til at danne en tynd film af “glaslignende” is – en proces kendt som vitrificering – der bevarer den indfødte biokemiske tilstand. Vitrifikation af biologiske prøver til cryoEM går tilbage over 40 år28,29,30 og mange teknikker og udstyr, der er udviklet til denne proces stole på den oprindeligt detaljerede blot-and-plunge metode31,32,33,34,35 , hvorved der påføres en lille prøvevolumen (f.eks. 1-5 μL) på et specialiseret EM-gitter, før den overskydende opløsning fjernes ved hjælp af nettets fysiske interaktion med blottingpapir. Timingen af denne proces er normalt empirisk bestemt for hver prøve som en kritisk komponent i frysning prøver er tykkelsen af glaslegeme is film – hvis isen er for tyk derefter billeddannelse kvalitet forringes dramatisk på grund af øget spredning af elektronstrålen, mens is, der er for tynd kan begrænse protein orienteringer og / eller udelukke partikler fra midten af gitteret folie huller36 . Denne afhængighed af den perfekte istykkelse til enkeltpartikel kryoEM har ført til en bred vifte af teknikker og udstyr, der kan fryse prøver, herunder robotteknologi37,38, mikrofluidics42, og ultralyd eller sprøjtning enheder27,39,40,41,42,43,44 . I de senere år er nogle af de mest populære prøveforberedelsesenheder afhængige af brugen af robotteknologi til automatiseret frysning af prøver ved hjælp af blot-and-plunge-teknikken45. Mens disse enheder er designet til at reproducer korrekt istykkelse til billeddannelse, forbliver de ofte for dyre for individuelle laboratorier at købe og betjene og findes generelt inden for cryoEM-faciliteter til timepriser for brug. I de senere år er den oprindelige manuelle blot-and-plunge teknik kommet tilbage i øget brug3,47,48,49,50,51,52. Faktisk kan en manuelt betjent blot-and-plunge enhed opnå høj kvalitet cryoEM gitre til en brøkdel af omkostningerne ved robot kolleger. Desuden giver manuel blotting også flere brugere kontrol over blotting, da forskere kan justere typen af blotting (dvs. back-blotting af nettet, front-blotting af nettet osv.) og blotting tid baseret på hver enkelt prøve og forskningsspørgsmål.

I denne artikel giver vi detaljer om, hvordan man effektivt fryser biologiske prøver ved hjælp af en traditionel manuel blot-and-plunge vitrifikationsenhed kombineret med en specialdesignet dewar platform53. Bedste praksis, herunder forberedelse af cryogen, nethåndtering, prøveanvendelse og blotting samt almindelige faldgruber og anbefalinger til, hvordan man overvinder disse forhindringer, leveres. Der diskuteres råd om, hvordan man øger reproducerbarheden af istykkelse mellem gitterpræparater, og hvordan prøvepletter ændres baseret på biologisk prøvetype. I betragtning af de lave omkostninger forbundet med køb og drift af den manuelle stempel beskrevet i dette manuskript, laboratorier over hele kloden kan forberede biologiske prøver til cryoEM i en omkostningseffektiv og reproducerbar måde.

Protocol

1. Forbered det manuelle kastemiljø BEMÆRK: Anslået driftstid: 5-30 minutter Find det manuelle stempel i et 4 °C koldt rum, hvor en luftfugter kan placeres sammen for at opretholde rummet tæt på 100% relativ luftfugtighed (RH) (figur 1A).FORSIGTIG: Kontakt institutionens retningslinjer for miljøsundhed og sikkerhed for sikker placering af det manuelle stempel og de anbefalede operationer. Før gitterforberedelse skal du tænde for lu…

Representative Results

Vellykket udførelse af blot-and-plunge protokol beskrevet her vil resultere i et tyndt, ensartet lag af glasagtig is, der er fri for enhver sekskantet is, forurenende stoffer, og store gradienter af ubrugelig is, som kan observeres under elektronmikroskop (Figur 3). Inkonsekvent kontakt af blotting papir med gitteret overfladen, for tidligt at fjerne blotting papir, eller flytte blotting papir under gitter kontakt kan forringe kvaliteten af glaslegemet is og føre til inkonsekvent is tykkel…

Discussion

Vitrificeringen af biologiske prøver til billeddannelse ved enkeltpartikel kryogen elektronmikroskopi (cryoEM) er fortsat et kritisk vigtigt skridt for vellykket strukturbestemmelse. Den manuelle blot-and-plunge metode, der er beskrevet i denne protokol repræsenterer en omkostningseffektiv, pålidelig og robust metode til hurtigt at fryse biologiske prøver i tynde film af glasagtig is til kryoEM billeddannelse. Ved hjælp af de metoder, der er skitseret i manuskriptet, vil forskerne være i stand til at samle og betje…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vi takker Herzik lab medlemmer for kritisk tænkning og give feedback på dette manuskript og videoindhold. M.A.H.Jr. er støttet af NIH R35 GM138206 og som Searle Scholar. H.P.M.N er støttet af Molecular Biophysics Training Grant (NIH T32 GM008326). Vi vil også gerne takke Bill Anderson, Charles Bowman, og Dr. Gabriel Lander på Scripps Research Institute for hjælp til at designe, samle, og teste den manuelle stemplet vist i videoen.

Materials

4 slot grid storage box Ted Pella 160-40
14 gauge flat metal dispensing tip Amazon B07M7YWWLT
22×22 mm square glass coverslip Sigma C9802-1PAK
60 mm glass Petri dish to store grids Fisher 08-747A
100 mm glass Petri dish to store Whatman paper Fisher 08-747D
150 mm glass Petri dish to store Whatman paper Fisher 08-747F
250 mL beaker Fisher 02-555-25B
Blue styrofoam dewar Spear Lab FD-500
Brass ethane vessel Lasco 17-4075
Clamping tweezers Ted Pella 38825
Delicate task wipes Fisher 06-666
Dual-stage regulator with control valve Airgas Y12N245D580-AG
Dewer grid base UCSD
Ethane platform UCSD
Ethane propane tank Praxair ET PR50ZU-G ethane (50%) : propane (50%) in a high-pressure tank
Ethane tank Praxair UN1035 ethane (100%)
Flexible arm task light Amscope LED-11CR
Grids (UltrAufoil R 1.2/1.3 300 mesh) Electron Microscopy Sciences Q325AR1.3
Humidifier Target 719438
Hygrometer ThermoPro B01H1R0K68
Lab coat UCSD
Liquid Nitrogen dewar Worthington LD4
Liquid Nitrogen gloves Fisher 19-059-925
Manual plunger stand (black stand + foot pedal) UCSD
Mark 5 (plunging platform) UCSD
Nitrile gloves VWR 82026-424
P20 pipette Eppendorf 13-690-029
PCR tubes Eppendorf E0030124286
Pipette tips ibis scientific 63300005
Ring lamp Amazon B07HMR4H8G
Safety glasses UCSD
Scissors Amazon Fiskars 01-004761J
Screw driver Ironside 354711
Tape Fisher 15-901-10R
Tweezer to transfer grid box Amazon LTS-3
Tygon tubing Fisher 14-171-130
Whatman blotting paper Fisher 1001-090
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hofmann, S., et al. Conformation Space of a Heterodimeric ABC Exporter under Turnover Conditions. Nature. 571 (7766), 580-583 (2019).
  2. Fica, S. M., Nagai, K. Cryo-Electron Microscopy Snapshots of the Spliceosome: Structural Insights into a Dynamic Ribonucleoprotein Machine. Nature Structural & Molecular Biology. 24 (10), 791-799 (2017).
  3. Hirschi, M., et al. Cryo-Electron Microscopy Structure of the Lysosomal Calcium-Permeable Channel TRPML3. Nature. 550 (7676), 411-414 (2017).
  4. Nakane, T., et al. Single-Particle Cryo-EM at Atomic Resolution. Nature. 587 (7832), 152-156 (2020).
  5. Li, X., Zheng, S. Q., Egami, K., Agard, D. A., Cheng, Y. Influence of Electron Dose Rate on Electron Counting Images Recorded with the K2 Camera. Journal of Structural Biology. 184 (2), 251-260 (2013).
  6. Campbell, M. G., et al. Movies of Ice-Embedded Particles Enhance Resolution in Electron Cryo-Microscopy. Structure. 20 (11), 1823-1828 (2012).
  7. Brilot, A. F., et al. Beam-Induced Motion of Vitrified Specimen on Holey Carbon Film. Journal of Structural Biology. 177 (3), 630-637 (2012).
  8. McMullan, G., et al. Experimental Observation of the Improvement in MTF from Backthinning a CMOS Direct Electron Detector. Ultramicroscopy. 109 (9), 1144-1147 (2009).
  9. Feathers, J. R., Spoth, K. A., Fromme, J. C. Experimental evaluation of super-resolution imaging and magnification choice in single-particle cryo-EM. Journal of Structural Biology: X. 5, 100047 (2021).
  10. Zheng, S. Q., et al. MotionCor2: Anisotropic Correction of Beam-Induced Motion for Improved Cryo-Electron Microscopy. Nature Methods. 14 (4), 331-332 (2017).
  11. Yip, K. M., Fischer, N., Paknia, E., Chari, A., Stark, H. Atomic-Resolution Protein Structure Determination by Cryo-EM. Nature. 587 (7832), 157-161 (2020).
  12. Fislage, M., Shkumatov, A. V., Stroobants, A., Efremov, R. G. Assessing the JEOL CRYO ARM 300 for High-Throughput Automated Single-Particle Cryo-EM in a Multiuser Environment. IUCrJ. 7 (4), 707-718 (2020).
  13. Zhang, K., Pintilie, G. D., Li, S., Schmid, M. F., Chiu, W. Resolving Individual Atoms of Protein Complex by Cryo-Electron Microscopy. Cell Research. 30 (12), 1136-1139 (2020).
  14. Danev, R., Yanagisawa, H., Kikkawa, M. Cryo-Electron Microscopy Methodology: Current Aspects and Future Directions. Trends in Biochemical Sciences. 44 (10), 837-848 (2019).
  15. Herzik, M. A. Cryo-Electron Microscopy Reaches Atomic Resolution. Nature. 587 (7832), 39-40 (2020).
  16. Cheng, A., et al. Leginon: New Features and Applications. Protein Science. 30 (1), 136-150 (2021).
  17. Suloway, C., et al. Automated Molecular Microscopy: The New Leginon System. Journal of Structural Biology. 151 (1), 41-60 (2005).
  18. de la Rosa-Trevín, J. M., et al. Scipion: A Software Framework toward Integration, Reproducibility and Validation in 3D Electron Microscopy. Journal of Structural Biology. 195 (1), 93-99 (2016).
  19. Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. CryoSPARC: Algorithms for Rapid Unsupervised Cryo-EM Structure Determination. Nature Methods. 14 (3), 290-296 (2017).
  20. Danev, R., Tegunov, D., Baumeister, W. Using the Volta Phase Plate with Defocus for Cryo-EM Single Particle Analysis. eLife. 6, 23006 (2017).
  21. Naydenova, K., Jia, P., Russo, C. J. Cryo-EM with Sub-1 Å Specimen Movement. Science. 370 (6513), 223-226 (2020).
  22. Watson, Z. L., et al. Structure of the Bacterial Ribosome at 2 Å Resolution. eLife. 9, 60482 (2020).
  23. Josephs, T. M., et al. Structure and Dynamics of the CGRP Receptor in Apo and Peptide-Bound Forms. Science. 372 (6538), (2021).
  24. Tan, Y. Z., et al. Addressing Preferred Specimen Orientation in Single-Particle Cryo-EM through Tilting. Nature Methods. 14 (8), 793-796 (2017).
  25. D’Imprima, E., Floris, D., Joppe, M., Sánchez, R., Grininger, M., Kühlbrandt, W. Protein Denaturation at the Air-Water Interface and How to Prevent It. eLife. 8, 42747 (2019).
  26. Han, Y., et al. High-Yield Monolayer Graphene Grids for near-Atomic Resolution Cryoelectron Microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (2), 1009-1014 (2020).
  27. Dandey, V. P., et al. Time-Resolved Cryo-EM Using Spotiton. Nature Methods. 17 (9), 897-900 (2020).
  28. McDowall, A. W., et al. Electron Microscopy of Frozen Hydrated Sections of Vitreous Ice and Vitrified Biological Samples. Journal of Microscopy. 131 (1), 1-9 (1983).
  29. Dubochet, J., McDowall, A. W. Vitrification of pure water for electron microscopy. Journal of Microscopy. 124 (3), 3-4 (1981).
  30. Dubochet, J., McDowall, A. W., Menge, B., Schmid, E. N., Lickfeld, K. G. Electron Microscopy of Frozen-Hydrated Bacteria. Journal of Bacteriology. 155 (1), 381-390 (1983).
  31. Depelteau, J. S., Koning, G., Yang, W., Briegel, A. An Economical, Portable Manual Cryogenic Plunge Freezer for the Preparation of Vitrified Biological Samples for Cryogenic Electron Microscopy. Microscopy and Microanalysis. 26 (3), 413-418 (2020).
  32. Dobro, M. J., Melanson, L. A., Jensen, G. J., McDowall, A. W. Plunge Freezing for Electron Cryomicroscopy. Methods in Enzymology. 481, 63-82 (2010).
  33. Cavalier, A., Spehner, D., Humbel, B. M. Handbook of Cryo-Preparation Methods for Electron Microscopy. Microscopy and Microanalysis. 15 (5), 469-470 (2009).
  34. Grassucci, R. A., Taylor, D. J., Frank, J. Preparation of Macromolecular Complexes for Cryo-Electron Microscopy. Nat. Protoc. 2 (12), 3239-3246 (2007).
  35. Carragher, B., et al. Current Outcomes When Optimizing ‘Standard’ Sample Preparation for Single-particle Cryo-EM. Journal of Microscopy. 276 (1), 39-45 (2019).
  36. Noble, A. J., et al. Routine Single Particle CryoEM Sample and Grid Characterization by Tomography. eLife. 7, 34257 (2018).
  37. Resch, G. P., Brandstetter, M., Konigsmaier, L., Urban, E., Pickl-Herk, A. M. Immersion Freezing of Suspended Particles and Cells for Cryo-Electron Microscopy. Cold Spring Harbor Protocols. 7, 803-814 (2011).
  38. Resch, G. P., et al. Immersion Freezing of Biological Specimens: Rationale, Principles, and Instrumentation. Cold Spring Harbor Protocols. 7, 778-782 (2011).
  39. Jain, T., Sheehan, P., Crum, J., Carragher, B., Potter, C. S. Spotiton: A Prototype for an Integrated Inkjet Dispense and Vitrification System for Cryo-TEM. Journal of Structural Biology. 179 (1), 68-75 (2012).
  40. Razinkov, I., et al. A New Method for Vitrifying Samples for CryoEM. Journal of Structural Biology. 195 (2), 190-198 (2016).
  41. Dandey, V. P., et al. Spotiton: New Features and Applications. Journal of Structural Biology. 202 (2), 161-169 (2018).
  42. Lu, Z., et al. Monolithic Microfluidic Mixing-Spraying Devices for Time-Resolved Cryo-Electron Microscopy. Journal of Structural Biology. 168 (3), 388-395 (2009).
  43. Feng, X., et al. A Fast and Effective Microfluidic Spraying-Plunging Method for High-Resolution Single-Particle Cryo-EM. Structure. 25 (4), 663-670 (2017).
  44. Rubinstein, J. L., et al. Shake-It-off: A Simple Ultrasonic Cryo-EM Specimen-Preparation Device. Acta Crystallographica Section D. 75 (12), 1063-1070 (2019).
  45. Lawson, C. L., et al. EMDataBank.Org: Unified Data Resource for CryoEM. Nucleic Acids Res. 39, 456-464 (2011).
  46. Frederik, P. M., Hubert, D. H. Cryoelectron Microscopy of Liposomes. Methods in Enzymology. 391, 431-448 (2005).
  47. Dambacher, C. M., Worden, E. J., Herzik, M. A., Martin, A., Lander, G. C. Atomic Structure of the 26S Proteasome Lid Reveals the Mechanism of Deubiquitinase Inhibition. eLife. 5, 13027 (2016).
  48. Zubcevic, L., et al. Conformational Ensemble of the Human TRPV3 Ion Channel. Nature Communications. 9 (1), 4773 (2018).
  49. Zubcevic, L., et al. Cryo-Electron Microscopy Structure of the TRPV2 Ion Channel. Nature Structural & Molecular Biology. 23 (2), 180-186 (2016).
  50. Yoo, J., Wu, M., Yin, Y., Herzik, M. A., Lander, G. C., Lee, S. -. Y. Cryo-EM Structure of a Mitochondrial Calcium Uniporter. Science. 361 (6401), 506-511 (2018).
  51. Fribourgh, J. L., et al. Dynamics at the Serine Loop Underlie Differential Affinity of Cryptochromes for CLOCK:BMAL1 to Control Circadian Timing. eLife. 9, 55275 (2020).
  52. Hirschi, M., et al. AcrIF9 Tethers Non-Sequence Specific DsDNA to the CRISPR RNA-Guided Surveillance Complex. Nature Communications. 11 (1), 2730 (2020).
  53. Herzik, M. A. Manual-Plunging CryoEM Grids | Herzik Lab. Herzik Lab UCSD. , (2021).

Tags

Manual Blot-and-plunge FreezingBiological SpecimensSingle-particle Cryogenic Electron MicroscopyTransmission Electron MicroscopyCryogen DewarManual PlungerEthane VesselPlunging ArmCryogen PreparationLiquid NitrogenEthane Gas
check_url/62765?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Nguyen, H. P. M., McGuire, K. L., Cook, B. D., Herzik, Jr., M. A. Manual Blot-and-Plunge Freezing of Biological Specimens for Single-Particle Cryogenic Electron Microscopy. J. Vis. Exp. (180), e62765, doi:10.3791/62765 (2022).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image