Manuell Blot-and-Plunge frysning av biologiska exemplar för enpartikel kryogen elektronmikroskopi
Summary
Detta manuskript beskriver blot-and-plunge-metoden för att manuellt frysa biologiska exemplar för enpartikel kryogen elektronmikroskopi.
Abstract
Att avbilda biologiska prover med elektroner för högupplöst strukturbestämning av enstaka kryogen elektronmikroskopi (cryoEM) kräver ett tunt lager glasaktig is som innehåller de biomolekyler av intresse. Trots många tekniska framsteg under de senaste åren som har drivit enpartikel cryoEM till framkanten av strukturell biologi, är de metoder genom vilka exemplar vitrifieras för högupplöst avbildning ofta det hastighetsbegränsande steget. Även om många nya ansträngningar har gett medel för att övervinna hinder som ofta påträffas under provvitrifiering, inklusive utvecklingen av nya provstöd och innovativ vitrifikation instrumentering, är den traditionella manuellt drivna kolven fortfarande en häftklammer i cryoEM-samhället på grund av den låga kostnaden för inköp och användarvänlighet. Här tillhandahåller vi detaljerade metoder för att använda en standard, giljotin-stil manuellt manövrerad blot-and-plunge enhet för vitrifikation av biologiska exemplar för högupplöst avbildning av en partikel cryoEM. Dessutom beskrivs ofta påträffade problem och felsökningsrekommendationer för när en standardpreparat inte ger ett lämpligt prov också.
Introduction
Enpartikel kryogen elektronmikroskopi (cryoEM) är en kraftfull strukturell teknik som kan användas för att lösa strukturer av dynamiska biologiska exemplar till nära atomupplösning1,2,3,4. De senaste framstegen inom direkt elektrondetektorteknik4,5,6,7,8,9,10, förbättringar av elektronkällor4,11,12,13,14 och elektromagnetisk linsstabilitet15, i kombination med den fortsatta utvecklingen av datainsamling 16,17 och analysprogrampaket18,19, har gjort det möjligt för forskare att nu rutinmässigt bestämma strukturer av väluppfostrade exemplar till 3 Å-upplösning eller bättre4,11,13,14,20,21,22 23 . Trots dessa förbättrade bild- och databehandlingsfunktioner är kryoEM-nätberedning fortfarande det största hindret för framgångsrik högupplöst strukturbestämning och fungerar ofta som en betydande flaskhals i EM-arbetsflödet24,25,26,27.
CryoEM förlitar sig på avbildning av biologiska prover i vattenlösningar som fryses för att bilda en tunn film av “glasliknande” is – en process som kallas vitrifikation – som bevarar det inhemska biokemiska tillståndet. Vitrifikation av biologiska prover för cryoEM går tillbaka över 40 år28,29,30 och många tekniker och utrustning som har utvecklats för denna process förlitar sig på den ursprungligen detaljerade blot-and-plunge-metoden31,32,33,34,35 , varigenom en liten mängd prov (t.ex. 1-5 μL) appliceras på ett specialiserat EM-nät innan överskottslösningen avlägsnas med hjälp av fysisk interaktion mellan gallret och blottingpapper. Tidpunkten för denna process bestäms vanligtvis empiriskt för varje prov eftersom en kritisk komponent i frysprover är tjockleken på glaskroppens isfilm – om isen är för tjock försämras bildkvaliteten dramatiskt på grund av ökad spridning av elektronstrålen medan is som är för tunn kan begränsa proteinorienteringen och / eller utesluta partiklar från mitten av rutnätsfoliehålen36 . Detta beroende av den perfekta istjockleken för enpartikel cryoEM har lett till ett brett utbud av tekniker och utrustning som kan frysa prover, inklusive robotteknik37,38, mikrofluidik42 och ultraljuds- eller sprutanordningar27,39,40,41,42,43,44 . Under de senaste åren förlitar sig några av de mest populära provberedningsenheterna på användningen av robotteknik för automatiserad frysning av prover med hjälp av blot-and-plunge-tekniken45. Även om dessa enheter är utformade för att reproducerbart skapa korrekt istjocklek för avbildning, förblir de ofta för dyra för enskilda laboratorier att köpa och använda och finns i allmänhet i kryoEM-anläggningar till timpriser för användning. Under de senaste åren har den ursprungliga manuella blot-and-plunge-tekniken kommit tillbaka till ökad användning3,47,48,49,50,51,52. Faktum är att en manuellt manövrerad blot-and-plunge-enhet kan uppnå högkvalitativa kryoEM-nät till en bråkdel av kostnaden för robotmotsvarigheter. Dessutom erbjuder manuell blotting också fler användare kontroll över blotting eftersom forskare kan justera typen av blotting (dvs. back-blotting av gallret, front-blotting av nätet etc.) och blottingtid baserat på varje enskilt prov och forskningsfrågor.
I den här artikeln ger vi information om hur du effektivt fryser biologiska prover med hjälp av en traditionell manuell blot-and-plunge vitrification-enhet i kombination med en specialdesignad dewarplattform53. Bästa praxis, inklusive förberedelse av kryogen, näthantering, provapplikation och blotting, samt vanliga fallgropar och rekommendationer om hur man kan övervinna dessa hinder tillhandahålls. Råd om hur man kan öka istjocklekens reproducerbarhet mellan gallerberedningar och hur man modifierar provutplåning baserat på biologisk provtyp diskuteras. Med tanke på den låga kostnaden i samband med inköp och drift av den manuella kolven som beskrivs i detta manuskript, kan laboratorier över hela världen förbereda biologiska exemplar för cryoEM på ett kostnadseffektivt och reproducerbart sätt.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vitrifikation av biologiska exemplar för avbildning av en partikel kryogen elektronmikroskopi (cryoEM) är fortfarande ett kritiskt viktigt steg för framgångsrik strukturbestämning. Den manuella blot-and-plunge-metoden som beskrivs i detta protokoll representerar en kostnadseffektiv, tillförlitlig och robust metod för att snabbt frysa biologiska prover i tunna filmer av glaskroppsis för cryoEM-avbildning. Med hjälp av de metoder som beskrivs i manuskriptet kommer forskare att kunna montera och använda den manuel…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Herzik-labbmedlemmarna för kritiskt tänkande och feedback på detta manuskript och videoinnehållet. M.A.H.Jr. stöds av NIH R35 GM138206 och som Searle Scholar. H.P.M.N stöds av Molecular Biophysics Training Grant (NIH T32 GM008326). Vi vill också tacka Bill Anderson, Charles Bowman och Dr. Gabriel Lander vid Scripps Research Institute för hjälp med att designa, montera och testa den manuella kolven som visas i videon.
Materials
| 4 slot grid storage box | Ted Pella | 160-40 | |
| 14 gauge flat metal dispensing tip | Amazon | B07M7YWWLT | |
| 22×22 mm square glass coverslip | Sigma | C9802-1PAK | |
| 60 mm glass Petri dish to store grids | Fisher | 08-747A | |
| 100 mm glass Petri dish to store Whatman paper | Fisher | 08-747D | |
| 150 mm glass Petri dish to store Whatman paper | Fisher | 08-747F | |
| 250 mL beaker | Fisher | 02-555-25B | |
| Blue styrofoam dewar | Spear Lab | FD-500 | |
| Brass ethane vessel | Lasco | 17-4075 | |
| Clamping tweezers | Ted Pella | 38825 | |
| Delicate task wipes | Fisher | 06-666 | |
| Dual-stage regulator with control valve | Airgas | Y12N245D580-AG | |
| Dewer grid base | UCSD | ||
| Ethane platform | UCSD | ||
| Ethane propane tank | Praxair | ET PR50ZU-G | ethane (50%) : propane (50%) in a high-pressure tank |
| Ethane tank | Praxair | UN1035 | ethane (100%) |
| Flexible arm task light | Amscope | LED-11CR | |
| Grids (UltrAufoil R 1.2/1.3 300 mesh) | Electron Microscopy Sciences | Q325AR1.3 | |
| Humidifier | Target | 719438 | |
| Hygrometer | ThermoPro | B01H1R0K68 | |
| Lab coat | UCSD | ||
| Liquid Nitrogen dewar | Worthington | LD4 | |
| Liquid Nitrogen gloves | Fisher | 19-059-925 | |
| Manual plunger stand (black stand + foot pedal) | UCSD | ||
| Mark 5 (plunging platform) | UCSD | ||
| Nitrile gloves | VWR | 82026-424 | |
| P20 pipette | Eppendorf | 13-690-029 | |
| PCR tubes | Eppendorf | E0030124286 | |
| Pipette tips | ibis scientific | 63300005 | |
| Ring lamp | Amazon | B07HMR4H8G | |
| Safety glasses | UCSD | ||
| Scissors | Amazon | Fiskars 01-004761J | |
| Screw driver | Ironside | 354711 | |
| Tape | Fisher | 15-901-10R | |
| Tweezer to transfer grid box | Amazon | LTS-3 | |
| Tygon tubing | Fisher | 14-171-130 | |
| Whatman blotting paper | Fisher | 1001-090 |
References
- Hofmann, S., et al. Conformation Space of a Heterodimeric ABC Exporter under Turnover Conditions. Nature. 571 (7766), 580-583 (2019).
- Fica, S. M., Nagai, K. Cryo-Electron Microscopy Snapshots of the Spliceosome: Structural Insights into a Dynamic Ribonucleoprotein Machine. Nature Structural & Molecular Biology. 24 (10), 791-799 (2017).
- Hirschi, M., et al. Cryo-Electron Microscopy Structure of the Lysosomal Calcium-Permeable Channel TRPML3. Nature. 550 (7676), 411-414 (2017).
- Nakane, T., et al. Single-Particle Cryo-EM at Atomic Resolution. Nature. 587 (7832), 152-156 (2020).
- Li, X., Zheng, S. Q., Egami, K., Agard, D. A., Cheng, Y. Influence of Electron Dose Rate on Electron Counting Images Recorded with the K2 Camera. Journal of Structural Biology. 184 (2), 251-260 (2013).
- Campbell, M. G., et al. Movies of Ice-Embedded Particles Enhance Resolution in Electron Cryo-Microscopy. Structure. 20 (11), 1823-1828 (2012).
- Brilot, A. F., et al. Beam-Induced Motion of Vitrified Specimen on Holey Carbon Film. Journal of Structural Biology. 177 (3), 630-637 (2012).
- McMullan, G., et al. Experimental Observation of the Improvement in MTF from Backthinning a CMOS Direct Electron Detector. Ultramicroscopy. 109 (9), 1144-1147 (2009).
- Feathers, J. R., Spoth, K. A., Fromme, J. C. Experimental evaluation of super-resolution imaging and magnification choice in single-particle cryo-EM. Journal of Structural Biology: X. 5, 100047 (2021).
- Zheng, S. Q., et al. MotionCor2: Anisotropic Correction of Beam-Induced Motion for Improved Cryo-Electron Microscopy. Nature Methods. 14 (4), 331-332 (2017).
- Yip, K. M., Fischer, N., Paknia, E., Chari, A., Stark, H. Atomic-Resolution Protein Structure Determination by Cryo-EM. Nature. 587 (7832), 157-161 (2020).
- Fislage, M., Shkumatov, A. V., Stroobants, A., Efremov, R. G. Assessing the JEOL CRYO ARM 300 for High-Throughput Automated Single-Particle Cryo-EM in a Multiuser Environment. IUCrJ. 7 (4), 707-718 (2020).
- Zhang, K., Pintilie, G. D., Li, S., Schmid, M. F., Chiu, W. Resolving Individual Atoms of Protein Complex by Cryo-Electron Microscopy. Cell Research. 30 (12), 1136-1139 (2020).
- Danev, R., Yanagisawa, H., Kikkawa, M. Cryo-Electron Microscopy Methodology: Current Aspects and Future Directions. Trends in Biochemical Sciences. 44 (10), 837-848 (2019).
- Herzik, M. A. Cryo-Electron Microscopy Reaches Atomic Resolution. Nature. 587 (7832), 39-40 (2020).
- Cheng, A., et al. Leginon: New Features and Applications. Protein Science. 30 (1), 136-150 (2021).
- Suloway, C., et al. Automated Molecular Microscopy: The New Leginon System. Journal of Structural Biology. 151 (1), 41-60 (2005).
- de la Rosa-Trevín, J. M., et al. Scipion: A Software Framework toward Integration, Reproducibility and Validation in 3D Electron Microscopy. Journal of Structural Biology. 195 (1), 93-99 (2016).
- Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. CryoSPARC: Algorithms for Rapid Unsupervised Cryo-EM Structure Determination. Nature Methods. 14 (3), 290-296 (2017).
- Danev, R., Tegunov, D., Baumeister, W. Using the Volta Phase Plate with Defocus for Cryo-EM Single Particle Analysis. eLife. 6, 23006 (2017).
- Naydenova, K., Jia, P., Russo, C. J. Cryo-EM with Sub-1 Å Specimen Movement. Science. 370 (6513), 223-226 (2020).
- Watson, Z. L., et al. Structure of the Bacterial Ribosome at 2 Å Resolution. eLife. 9, 60482 (2020).
- Josephs, T. M., et al. Structure and Dynamics of the CGRP Receptor in Apo and Peptide-Bound Forms. Science. 372 (6538), (2021).
- Tan, Y. Z., et al. Addressing Preferred Specimen Orientation in Single-Particle Cryo-EM through Tilting. Nature Methods. 14 (8), 793-796 (2017).
- D’Imprima, E., Floris, D., Joppe, M., Sánchez, R., Grininger, M., Kühlbrandt, W. Protein Denaturation at the Air-Water Interface and How to Prevent It. eLife. 8, 42747 (2019).
- Han, Y., et al. High-Yield Monolayer Graphene Grids for near-Atomic Resolution Cryoelectron Microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (2), 1009-1014 (2020).
- Dandey, V. P., et al. Time-Resolved Cryo-EM Using Spotiton. Nature Methods. 17 (9), 897-900 (2020).
- McDowall, A. W., et al. Electron Microscopy of Frozen Hydrated Sections of Vitreous Ice and Vitrified Biological Samples. Journal of Microscopy. 131 (1), 1-9 (1983).
- Dubochet, J., McDowall, A. W. Vitrification of pure water for electron microscopy. Journal of Microscopy. 124 (3), 3-4 (1981).
- Dubochet, J., McDowall, A. W., Menge, B., Schmid, E. N., Lickfeld, K. G. Electron Microscopy of Frozen-Hydrated Bacteria. Journal of Bacteriology. 155 (1), 381-390 (1983).
- Depelteau, J. S., Koning, G., Yang, W., Briegel, A. An Economical, Portable Manual Cryogenic Plunge Freezer for the Preparation of Vitrified Biological Samples for Cryogenic Electron Microscopy. Microscopy and Microanalysis. 26 (3), 413-418 (2020).
- Dobro, M. J., Melanson, L. A., Jensen, G. J., McDowall, A. W. Plunge Freezing for Electron Cryomicroscopy. Methods in Enzymology. 481, 63-82 (2010).
- Cavalier, A., Spehner, D., Humbel, B. M. Handbook of Cryo-Preparation Methods for Electron Microscopy. Microscopy and Microanalysis. 15 (5), 469-470 (2009).
- Grassucci, R. A., Taylor, D. J., Frank, J. Preparation of Macromolecular Complexes for Cryo-Electron Microscopy. Nat. Protoc. 2 (12), 3239-3246 (2007).
- Carragher, B., et al. Current Outcomes When Optimizing ‘Standard’ Sample Preparation for Single-particle Cryo-EM. Journal of Microscopy. 276 (1), 39-45 (2019).
- Noble, A. J., et al. Routine Single Particle CryoEM Sample and Grid Characterization by Tomography. eLife. 7, 34257 (2018).
- Resch, G. P., Brandstetter, M., Konigsmaier, L., Urban, E., Pickl-Herk, A. M. Immersion Freezing of Suspended Particles and Cells for Cryo-Electron Microscopy. Cold Spring Harbor Protocols. 7, 803-814 (2011).
- Resch, G. P., et al. Immersion Freezing of Biological Specimens: Rationale, Principles, and Instrumentation. Cold Spring Harbor Protocols. 7, 778-782 (2011).
- Jain, T., Sheehan, P., Crum, J., Carragher, B., Potter, C. S. Spotiton: A Prototype for an Integrated Inkjet Dispense and Vitrification System for Cryo-TEM. Journal of Structural Biology. 179 (1), 68-75 (2012).
- Razinkov, I., et al. A New Method for Vitrifying Samples for CryoEM. Journal of Structural Biology. 195 (2), 190-198 (2016).
- Dandey, V. P., et al. Spotiton: New Features and Applications. Journal of Structural Biology. 202 (2), 161-169 (2018).
- Lu, Z., et al. Monolithic Microfluidic Mixing-Spraying Devices for Time-Resolved Cryo-Electron Microscopy. Journal of Structural Biology. 168 (3), 388-395 (2009).
- Feng, X., et al. A Fast and Effective Microfluidic Spraying-Plunging Method for High-Resolution Single-Particle Cryo-EM. Structure. 25 (4), 663-670 (2017).
- Rubinstein, J. L., et al. Shake-It-off: A Simple Ultrasonic Cryo-EM Specimen-Preparation Device. Acta Crystallographica Section D. 75 (12), 1063-1070 (2019).
- Lawson, C. L., et al. EMDataBank.Org: Unified Data Resource for CryoEM. Nucleic Acids Res. 39, 456-464 (2011).
- Frederik, P. M., Hubert, D. H. Cryoelectron Microscopy of Liposomes. Methods in Enzymology. 391, 431-448 (2005).
- Dambacher, C. M., Worden, E. J., Herzik, M. A., Martin, A., Lander, G. C. Atomic Structure of the 26S Proteasome Lid Reveals the Mechanism of Deubiquitinase Inhibition. eLife. 5, 13027 (2016).
- Zubcevic, L., et al. Conformational Ensemble of the Human TRPV3 Ion Channel. Nature Communications. 9 (1), 4773 (2018).
- Zubcevic, L., et al. Cryo-Electron Microscopy Structure of the TRPV2 Ion Channel. Nature Structural & Molecular Biology. 23 (2), 180-186 (2016).
- Yoo, J., Wu, M., Yin, Y., Herzik, M. A., Lander, G. C., Lee, S. -. Y. Cryo-EM Structure of a Mitochondrial Calcium Uniporter. Science. 361 (6401), 506-511 (2018).
- Fribourgh, J. L., et al. Dynamics at the Serine Loop Underlie Differential Affinity of Cryptochromes for CLOCK:BMAL1 to Control Circadian Timing. eLife. 9, 55275 (2020).
- Hirschi, M., et al. AcrIF9 Tethers Non-Sequence Specific DsDNA to the CRISPR RNA-Guided Surveillance Complex. Nature Communications. 11 (1), 2730 (2020).
- Herzik, M. A. Manual-Plunging CryoEM Grids | Herzik Lab. Herzik Lab UCSD. , (2021).
