筋萎縮性側索硬化症のモデルにおけるシナプス機能のリアルタイム蛍光測定

Summary

シナプス伝達に必要な細胞内事象を視覚化するために、2つの関連する方法が記載されている。これらのプロトコルは、 in vitro 培養ニューロンの生細胞イメージングを使用して、シナプス前カルシウム流入およびシナプス小胞膜融合のダイナミクスのリアルタイムモニタリングを可能にする。

Abstract

神経変性の前に、筋萎縮性側索硬化症(ALS)および/または前頭葉性認知症(FTLD)患者の運動および認知障害の原因は、ニューロンと運動ニューロンおよび筋肉との間のコミュニケーションの機能不全である。シナプス伝達の根底にあるプロセスは、膜脱分極依存性シナプス小胞融合およびシナプスへの神経伝達物質の放出を含む。このプロセスは、シナプス小胞が存在するシナプス前終末への局在的なカルシウム流入によって起こる。ここで、プロトコルは、培養ニューロンにおける脱分極媒介シナプス小胞エキソサイトーシスおよびシナプス前末端カルシウム流入ダイナミクスを確実に報告する蛍光ベースのライブイメージング方法論を記載する。

シナプス小胞膜に取り込まれたスチリル色素を用いて、シナプス小胞放出が解明される。一方、カルシウムの侵入を研究するために、遺伝子コードされた蛍光レポーターであるGcamp6mが使用される。我々は、ニューロン活性を模倣するために、高い塩化カリウム媒介性脱分極を採用している。シナプス小胞エキソサイトーシスを明確に定量するために、我々は、時間の関数として正規化されたスチリル色素蛍光の損失を測定する。同様の刺激条件下では、カルシウム流入の場合、Gcamp6m蛍光が増加する。この蛍光変化の正規化および定量化は、スチリル色素プロトコールと同様の方法で行われる。これらの方法は、蛍光標識された変異タンパク質のトランスフェクションベースの過剰発現と多重化することができる。これらのプロトコルは、初代げっ歯類皮質および運動ニューロンを利用して、 FUS−ALSおよび C9ORF72−ALSのモデルにおけるシナプス機能障害を研究するために広く使用されている。これらのプロトコルは、ニューロン通信を改善し得る化合物の迅速なスクリーニングを容易に可能にする。したがって、これらの方法は、ALSの研究だけでなく、神経変性および発達神経科学研究のすべての分野にとって貴重です。

Introduction

実験室での筋萎縮性側索硬化症(ALS)のモデリングは、症例の80%以上が圧倒的に散発的な性質^{を持っている1}と、疾患の原因であることが知られている膨大な数の遺伝子変異2のために、他に類を見ないほど困難になっています²。それにもかかわらず、ALSのすべての症例は、完全なニューロン変性の前に、シナプス前運動ニューロンとシナプス後筋細胞との間に機能不全のコミュニケーションがあるという統一的な特徴を共有しています^3,4。臨床的には、患者が残りの上部および下部運動ニューロンの接続性を失うにつれて、それらは疾患全体にわたってニューロンの過興奮性および低興奮性の特徴を呈し⁵、⁶、⁷、^8、9、これらのシナプスへの複雑な根底にある分子変化を反映しており^、ALS研究者として理解しようとしている。

複数のトランスジェニックモデルが、SOD110、FUS11,12、C9orf7213、¹⁴、¹⁵、¹⁶、およびTDP4317,18,19を含むALS原因遺伝子変異の発現とともに神経筋接合部の劣化および解体が起こることを実証している。 シナプスブートン、脊椎密度、シナプス前/シナプス後組織の評価を含む形態学的評価を通じて。機構的には、1930年代にコール、ホジキン、ハクスリーの画期的な論文が発表されて以来、in vitro細胞培養または組織スライス調製物のいずれかにおいて、電気生理学的手法を通じてシナプス応答を評価することも可能であった²⁰。これらの戦略を通じて、ALSの多くのモデルはシナプス伝達欠損を実証している。例えば、TDP43の変異変異体は、NSC-34(脊髄x神経芽腫ハイブリッド細胞株34)の運動ニューロン様細胞²¹において発火頻度を増強し、活動電位閾値を低下させる。この同じ変異はまた、マウスモデルにおける行動運動欠損の発症前に神経筋接合部(NMJ)で機能不全のシナプス伝達を引き起こす²²。変異型FUS発現は、自発運動障害前のFUS-ALSのショウジョウバエモデルにおいてNMJにおけるシナプス伝達の減少をもたらすことが以前に示された¹¹。C9orf72増殖キャリアに由来する誘導多能性幹細胞を用いた最近の報告は、シナプス小胞の容易に放出可能なプールの減少を明らかにした²³。全体として、これらの研究や他の研究は、ALSの疾患関連モデルにおけるシナプスシグナル伝達の根底にあるメカニズムのより包括的な理解を構築することの重要性を強調しています。これは、ALSの病態生物学を理解し、患者のための潜在的な治療標的を開発する上で極めて重要である。

電流および電圧クランプ細胞の方法は、コンダクタンス、静止膜電位、および個々のシナプスの量子的含有量などの膜特性を決定する上で非常に貴重であった^20,24。しかし、電気生理学の重大な限界の1つは、それが技術的に困難であり、一度に単一のニューロンからの洞察しか提供しないことです。生細胞共焦点顕微鏡は、特異的蛍光プローブと相まって、ニューロンのシナプス伝達を時空間的に調査する機会を提供する^25,26,27。ニューロン興奮性の直接的な尺度ではないが、この蛍光アプローチは、シナプス機能の2つの分子相関、すなわちシナプス小胞放出およびシナプス末端におけるカルシウム過渡現象の相対的測定を提供することができる。

活動電位がニューロンのシナプス前終末領域に到達すると、カルシウム一過性が誘発され、電気信号から神経伝達物質放出の過程への移行が容易になる²⁸。これらの領域に局在する電位依存性カルシウムチャネルは、カルシウムシグナル伝達を厳密に調節して、神経伝達物質放出の動態を調節する²⁹。カルシウム過渡現象の最初に報告された蛍光ベースの記録は、二波長指示薬Fura-2 AMまたは単一波長色素Fluo-3 AM30^、31、32のいずれかを使用して実施された。これらの色素は当時、大きな新しい洞察を提供していましたが、細胞内の非特異的な区画化、標識細胞からの能動的または受動的な色素損失、フォトブリーチング、長期間にわたって画像化された場合の毒性など、いくつかの制限に苦しんでいます³³。過去10年間で、遺伝的にコードされたカルシウム指標は、様々な形態のニューロン活動を画像化するための主力製品となっている。これらの指標は、修飾蛍光タンパク質と、^Ca2+イオンの結合後に蛍光強度を急速に切り替えるカルシウムキレートタンパク質とを組み合わせる³⁴。これらの新しい指標の適用は広範であり、in vitroおよびin vivo設定の両方で細胞内カルシウム過渡現象の視覚化をはるかに容易にすることを可能にする。GCaMPとして知られるこれらの遺伝的にコードされたレポーターの1つのファミリーは、現在広く利用されている。これらの指標は、C末端カルモジュリンドメインを含み、続いて緑色蛍光タンパク質(GFP)を含み、N末端カルモジュリン結合領域によってキャップされている^35、36。カルモジュリンドメインへのカルシウム結合は、カルモジュリン結合領域との相互作用を誘発し、タンパク質全体の構造における立体構造変化およびGFP部分の蛍光の実質的な増加をもたらす^35,36。長年にわたり、このレポーターファミリーは、それぞれがわずかに異なる特性を有する特定の動態(低速、中速、および高速)を有する特定のカルシウム過渡現象について、異なる読み出しを可能にするために、いくつかの進化を遂げてきた^37,38。ここで、レポーターGcaMP6の使用が強調されており、これは、インビボおよびインビトロの両方のニューロンにおける単一活動電位および樹状カルシウム一過性を検出することが以前に示されている³⁷。

シナプス前領域のカルシウム一過性はシナプス小胞融合事象を誘発し、シナプスへの神経伝達物質放出を引き起こし、シナプス後細胞におけるシグナル伝達事象の開始を引き起こす^28,39。シナプス小胞は、細胞が恒常的に安定した細胞膜表面積および容易に放出可能な融合可能な膜結合小胞のプールを維持するので、急速に放出され、リサイクルされる⁴⁰。ここで使用されるスチリル色素は、脂質膜に対して親和性を有し、周囲の脂質環境の秩序に基づいてその発光特性を特異的に変化させる^41、42。したがって、これは、シナプス小胞のリサイクルを標識し、ニューロン刺激後に後に放出されるこれらの小胞のその後の追跡のための理想的なツールである^41,42。生成および最適化されたプロトコルは、Gaffieldらによって最初に記述された概念の適応であり、スチリル色素標識シナプス小胞穿刺を経時的に連続的に視覚化することを可能にする⁴¹。

ここでは、2つの関連する蛍光ベースの方法論が記載されており、シナプス伝達に関与する特定の細胞事象を確実に報告する。培養ニューロンにおける脱分極媒介シナプス前終末カルシウム流入およびシナプス小胞エキソサイトーシスのダイナミクスをプローブするためのプロトコルが定義されている。ここで、方法および代表的な結果は、これらの細胞型を用いた公表された研究があるように、インビトロモデル系として原発性げっ歯類皮質または運動ニューロンを使用することに焦点を当てている^43,44。しかし、これらの方法は、分化したヒトⁱ³皮質様ニューロン⁴⁵にも適用可能であり、現在、当研究室で進行中の実験では、両方のプロトコルでも成功しています。一般的なプロトコルは、図1に示すステップワイズ線形形式で概説されています。要するに、神経突起におけるカルシウム動態を研究するために、成熟ニューロンをプラスミドDNAでトランスフェクトし、サイトメガロウイルス(CMV)プロモーター下で蛍光レポーターGCaMP6mを発現させる^37、46。トランスフェクトされた細胞は、低レベルの基底緑色蛍光を有し、カルシウムの存在下で増加する。関心領域は、我々の操作全体を通して蛍光変化を監視するために指定される。これにより、カルシウムの高度に空間的および時間的に局在する変動を測定することができます^37,46。シナプス小胞の融合と放出を評価するために、成熟ニューロンはシナプス前細胞で神経伝達物質でリサイクルされ、改質され、リロードされるにつれてシナプス小胞膜に取り込まれたスチリル色素をロードされる^{41,42,43,47,48}。この目的のために使用されている現在の色素は、神経突起に沿ってシナプス小胞を標識し、Kraszewskiらによるスチリル色素とシナプトタグミンの共染色によって示されたように、ライブイメージング実験においてこれらの領域の代理として使用されている⁴⁹。ここにも実施された同様の染色の代表的な画像が含まれる(図2A)。これまでの研究者らは、神経筋接合部および海馬ニューロンにおけるシナプス小胞ダイナミクスを報告するために、このような色素を広範囲に使用してきた48,49,50,51,52,53,54,55,56.色素を負荷した小胞の点状領域を選択し、小胞放出後の蛍光強度の低下をモニタリングすることにより、刺激後の機能的シナプス伝達能力および放出の時間的ダイナミクスを研究することができる⁴³。両方の方法において、高濃度の塩化カリウムを含む培地が使用され、細胞を脱分極させてニューロン活性を模倣する。イメージングパラメータは、ベースライン正規化とそれに続く刺激キャプチャ期間にまたがる1秒未満の間隔をキャプチャするように指定されます。各時点での蛍光測定値が決定され、バックグラウンドに正規化され、実験期間にわたって定量化されます。カルシウム流入媒介性GCaMP6m蛍光増加または効果的なシナプス小胞エキソサイトーシスチリル色素放出蛍光減少は、この戦略を通して検出することができる。これら2つのプロトコルの詳細な方法論的セットアップとパラメータ、およびそれらの利点と制限事項に関する議論については、以下で説明します。

図 1: 一般的なプロトコル プロセス全体の視覚的レンダリング。 (1)初代げっ歯類ニューロンを単離し、選択した成熟時点まで インビトロで 培養する。(2)シナプス活性のレポーターとしてGCaMP DNAまたはスチリル色素を導入する。(3)ライブイメージング搭載共焦点顕微鏡と関連ソフトウェアを用いたイメージングパラダイムの設定ベースライン記録期間を開始します。(4)細胞がまだライブ画像キャプチャを受けている間、高いKCl浴灌流を介してニューロンを刺激する。(5)蛍光強度測定値を経時的に評価し、カルシウム過渡現象またはシナプス小胞融合を測定する。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

Protocol

この研究で実施されたすべての動物処置は、ジェファーソン大学の施設動物ケアおよび使用委員会によって承認された。 1. 胚性ラット皮質由来のニューロンの初代培養 注:初代皮質ニューロンは、前述のようにE17.5ラット胚から単離される57,58。この培養プロトコルの成功により、株の偏りは存在しないよう?…

Representative Results

上記のプロトコールの成功した実施に続いて、典型的なスチリル色素シナプス小胞放出実験について代表的な結果が示されている。培養ラット初代皮質ニューロンは、セクション6に記載の方法を用いて色素を負荷した。色素負荷の特異性は、シナプス小胞マーカーシナプトフィジンとの共標識によって決定した。陽性の点状穿刺のスチリル色素の大部分は、このマーカーに対して共陽性であ…

Discussion

記載されている両方の方法に共通する3つのステップは、実験の成功と定量化可能な結果にとって非常に重要です。まず、各実験ラウンドの前に新鮮なaCSFの調製が不可欠であり、添付の指示に従ってください。そうしないと、適切なニューロン脱分極を妨げる可能性があります。未処理の対照ニューロンのサンプルは、適切な細胞脱分極を確実にし、そのイメージングセッションで得られた?…

Materials

20x air objective	Nikon		For imaging
40x oil immersion objective	Nikon		For imaging
B27 supplement	Thermo Scientific	17504044	Neuronal growth supplement
BD Syringes without Needle, 50 mL	Thermo Scientific	13-689-8	Part of gravity perfusion assembly
Biosafety cell culture hood	Baker	SterilGARD III SG403A	Asceptic cell culturing, transfection, and dye loading
b-Mercaptoethanol	Millipore Sigma	M3148	For culturing and maintenance of neuronal cultures
Bovine Serum Albumin	Millipore Sigma	A9418	For preparing neuronal cultures
Calcium chloride dihydrate	Millipore Sigma	223506	Component of aCSF solutions
Cell culture CO2 incubator	Thermo Scientific	13-998-123	For culturing and maintenance of neurons
Centrifuge	Eppendorf	5810R	For neuronal culture preparation
Confocal microscope	Nikon	Eclipse Ti +A1R core	For fluorescence imaging
CoolSNAP ES2  CCD camera	Photometrics		For image acquisition
D-Glucose	Millipore Sigma	G8270	Component of aCSF solutions
DNase	Millipore Sigma	D5025	For neuronal culture preparation
Female, timed-pregnancy Sprague Dawley rats	Charles river	400SASSD	For preparing embryonic cortical and spinal motor neuron cultures
FITC Filter cube	Nikon	77032509	For imaging Gcamp calcium transients
FM4-64 styryl dye	Invitrogen	T13320	For imaging synaptic vesicle release
Glass bottom petri dishes (Thickness #1.5)	CellVis	D35-10-1.5-N	For growth of neurons on imaging-compatible culture dish
Glass Pasteur pipette	Grainger	52NK56	For preparing neuronal cultures
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)	Millipore Sigma	H6648	For preparing neuronal cultures
HEPES	Millipore Sigma	H3375	Component of aCSF solutions
High KCl artifical cerebrospinal fluid (aCSF)			For imaging. Please see recipes*
horse serum	Millipore Sigma	H1138	For culturing and maintenance of neurons
Laminar flow dissection hood	NUAIRE	NU-301-630	For preparing neuronal cultures
Laminin	Thermo Scientific	23017015	For preparing neuronal cultures
Leibovitz's L-15 Medium	Thermo Scientific	11415064	For preparing neuronal cultures
Leibovitz's L-15 Medium, no phenol red	Thermo Scientific	21083027	For preparing neuronal cultures
L-Glutamine (200 mM)	Thermo Scientific	25030149	Neuronal culture supplement
Lipofectamine 2000 Transfection Reagent	Thermo Scientific	11668019	For neuronal transfections
Low KCl artifical cerebrospinal fluid (aCSF)			For imaging. Please see recipes*
Magnesium chloride	Millipore Sigma	208337	Component of aCSF solutions
Microsoft Excel	Microsoft		Software for data analysis/normalization
Nalgene  Filter Units, 0.2 µm PES	Thermo Scientific	565-0020	Filter unit for aCSF solution
Neurobasal medium	Thermo Scientific	21103049	For culturing and maintenance of neuronal cultures
NIS-Elements Advanced Research	Nikon		Software for image capture and analysis
Nunc 15 mL Conical tubes	Thermo Scientific	339650	For preparing neuronal culture and buffer solutions
Nunc 50 mL conical tubes	Thermo Scientific	339652	For preparing neuronal culture and buffer solutions
Optiprep	Millipore Sigma	D1556	For preparing neuronal cultures
Papain	Millipore Sigma	P4762	For preparing neuronal cultures
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Thermo Scientific	15140122	To prevent bacterial contamination of neuronal cultures
Perfusion system	Warner Instruments	SF-77B	For exchange of aCSF
Perfusion tubing	Cole-Parmer	UX-30526-14	Part of gravity perfusion assembly
pGP-CMV-Gcamp6m plasmid	Addgene	40754	For imaging calcium transients
Poly-D-lysine hydrobromide	Millipore Sigma	P7886	Coating agent for glass bottom petri dishes
Potassium chloride	Millipore Sigma	P3911	Component of aCSF solutions
Sodium bicarbonate	Millipore Sigma	S5761	Component of aCSF solutions
Sodium Chloride	Millipore Sigma	S9888	Component of aCSF solutions
Stage Top Incubator	Tokai Hit		For incubation of live neurons during imaging period
TRITC Filter cube	Nikon	77032809	For imaging FM4-64
Trypsin Inhibitor	Millipore Sigma	T6414	For preparing neuronal cultures
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red	Thermo Scientific	25200056	For preparing neuronal cultures
Vibration Isolation table	New Port	VIP320X2430-135520	Table/stand for microscope