Synthetische Antigenkontrollen für die Immunhistochemie

Summary

Diese Arbeit dokumentiert eine einfache Methode zur Erstellung synthetischer Antigenkontrollen für die Immunhistochemie. Die Technik ist an eine Vielzahl von Antigenen in einem breiten Konzentrationsbereich anpassbar. Die Proben bieten eine Referenz zur Beurteilung der Intra- und Inter-Assay-Leistung und Reproduzierbarkeit.

Abstract

Immunhistochemische (IHC) Assays liefern wertvolle Einblicke in Proteinexpressionsmuster, deren zuverlässige Interpretation gut charakterisierte positive und negative Kontrollproben erfordert. Da nicht immer geeignete Gewebe- oder Zelllinienkontrollen verfügbar sind, kann eine einfache Methode zur Erstellung synthetischer IHC-Kontrollen von Vorteil sein. Eine solche Methode wird hier beschrieben. Es ist anpassungsfähig an verschiedene Antigentypen, einschließlich Proteine, Peptide oder Oligonukleotide, in einem breiten Konzentrationsbereich. Dieses Protokoll erklärt die Schritte, die notwendig sind, um synthetische Antigenkontrollen zu erstellen, wobei als Beispiel ein Peptid aus der intrazellulären Domäne (ICD) des humanen erythroblastischen Onkogens B2 (ERBB2 / HER2) verwendet wird, das von einer Vielzahl von diagnostisch relevanten Antikörpern erkannt wird. Serielle Verdünnungen des HER2 ICD-Peptids in Rinderserumalbumin (BSA)-Lösung werden mit Formaldehyd gemischt und 10 min bei 85 °C erhitzt, um das Peptid/BSA-Gemisch zu verfestigen und zu vernetzen. Das resultierende Gel kann wie ein Gewebe verarbeitet, geschnitten und gefärbt werden, was zu einer Reihe von Proben bekannter Antigenkonzentrationen führt, die einen weiten Bereich von Färbeintensitäten abdecken.

Dieses einfache Protokoll steht im Einklang mit routinemäßigen histologischen Laborverfahren. Die Methode erfordert lediglich, dass der Benutzer über eine ausreichende Menge des gewünschten Antigens verfügt. Rekombinante Proteine, Proteindomänen oder lineare Peptide, die für relevante Epitope kodieren, können lokal oder kommerziell synthetisiert werden. Labore, die hauseigene Antikörper erzeugen, können Aliquots des immunisierenden Antigens als synthetisches Kontrollziel reservieren. Die Möglichkeit, gut definierte Positivkontrollen für einen breiten Konzentrationsbereich zu erstellen, ermöglicht es Benutzern, die Leistung von Intra- und Inter-Laboratory-Assays zu bewerten, Einblicke in den Dynamikbereich und die Linearität ihrer Assays zu erhalten und die Assay-Bedingungen für ihre jeweiligen experimentellen Ziele zu optimieren.

Introduction

Die Immunhistochemie (IHC) ermöglicht den sensitiven und spezifischen, räumlich präzisen Nachweis von Zielantigenen in formalinfixierten, paraffineingebetteten (FFPE) Gewebeschnitten. Die Ergebnisse der IHC-Färbung können jedoch durch mehrere Variablen beeinflusst werden, einschließlich der warmen und kalten Ischämiezeit, der Gewebefixierung, der Gewebevorbehandlung, der Antikörperreaktivität und -konzentration, der Assay-Erkennungschemie und der Reaktionszeiten¹. Dementsprechend erfordern die reproduzierbare Leistung und Interpretation von IHC-Reaktionen eine strenge Kontrolle dieser Variablen und die Verwendung gut charakterisierter positiver und negativer Kontrollproben. Zu den häufig verwendeten Kontrollen gehören in Paraffin eingebettete Gewebe oder kultivierte Zelllinien, von denen aus unabhängigen Analysen bekannt ist, dass sie das Antigen von Interesse ausdrücken, aber solche Proben sind nicht immer verfügbar¹. Darüber hinaus werden die Expressionsniveaus der Zielantigene in Geweben und Zelllinienkontrollen im Allgemeinen nur qualitativ verstanden und können variabel sein. Kontrollen, die reproduzierbare, genau bekannte Konzentrationen von Zielantigen enthalten, können bei der Optimierung der IHC-Reaktionsbedingungen helfen. Eine allgemeine Methode, die an eine Vielzahl von Antigentypen in einem physiologisch relevanten Konzentrationsbereich angepasst werden kann, um synthetische IHC-Kontrollproben zu erzeugen, wurde von den Autoren^{beschrieben 2}. Für die Erstellung und Verwendung dieser Art von Standard wird hier ein detailliertes Protokoll bereitgestellt.

Geeignete Kontrollen sind für die gültige Interpretation der ^{IHC-Assays 1,3,4} unerlässlich. Gewebe, kultivierte Zellen und peptidbeschichtete Substrate wurden als IHC-Kontrollen entsprechend den spezifischen Bedürfnissen der Forscher eingesetzt. Die Vorteile und Einschränkungen, die der Verwendung von Geweben als IHC-Kontrollen innewohnen, wurden ausführlich diskutiert ^1,4. Für viele Antikörper können geeignete Kontrollen aus ausgewählten normalen Geweben ausgewählt werden, die Zellpopulationen enthalten, die das Zielantigen über einen weiten Dynamikbereich exprimieren. Gewebekontrollen sind weniger geeignet, wenn das Zielantigen hinsichtlich der Expressionsstelle oder -häufigkeit nicht gut charakterisiert ist oder wenn potenziell kreuzreagierende Antigene in denselben Zellen oder Gewebestellen koexprimiert werden. In diesen Kontexten können Blöcke von kultivierten Zelllinien, die das Antigen von Interesse ausdrücken, hilfreich sein. Um weitere Beweise für die Zielspezifität zu liefern, können Zelllinien so konstruiert werden, dass sie Zielantigene über- oder unterexprimieren. Zum Beispiel wurde ein solcher Ansatz kürzlich verwendet, um eine Vielzahl von Anti-PD-L1-Assays unter Verwendung eines Gewebe-Microarrays von isogenen Zelllinien zu bewerten, die eine Reihe von PD-L1-Antigen⁵ exprimieren. Zu den praktischen Einschränkungen bei der routinemäßigen Verwendung von Zelllinienblöcken gehören die Kosten und der Zeitaufwand für die Erzeugung ausreichender Zellzahlen und die Tatsache, dass die Expression einiger Antigene möglicherweise nicht zuverlässig konsistent ist, selbst innerhalb klonaler Zelllinien⁶. Synthetische Peptide sind eine dritte Option für IHC-Kontrollen für Antikörper, die kurze lineare Epitope erkennen. Steven Bogen und Kollegen haben ausführlich über die Verwendung von Peptiden publiziert, die an die Oberfläche von ^{Objektträgern 7,8} und Glasperlen⁹ gekoppelt sind. Eine Studie dieser Gruppe zeigte, dass die quantitative Analyse von peptidbasierten IHC-Kontrollen die Variation des Färbeprozesses erkennen konnte, die bei der qualitativen Bewertung der parallel analysierten Gewebekontrollen übersehen^{wurde 10}. Während Standards, die perlenbasierte Antigene verwenden, weit verbreitet sein könnten, sind viele Details Eigentum der Autoren, was die weit verbreitete Akzeptanz einschränkt.

Ein weiterer Ansatz für IHC-Standards integriert Zielantigene in künstlich hergestellte Proteingele. Dieses Konzept wurde erstmals¹⁹⁷² von Per Brandtzaeg in einer Studie demonstriert, in der normales Kaninchenserum mit Glutaraldehyd 11 polymerisiert wurde. Kleine Blöcke des resultierenden Gels wurden dann für 1-4 Wochen in Lösungen eingeweicht, die die Immunglobulin-Antigene von Interesse in verschiedenen Konzentrationen enthielten. Nach Alkoholfixierung und Paraffineinbettung wurde gezeigt, dass Abschnitte der resultierenden Kontrollen mit Intensitäten färbten, die dem Logarithmus der Antigenlösungen entsprachen, in denen sie eingeweicht worden waren. Später stellten die Forscher Glutaraldehyd-Konjugate spezifischer Aminosäuren in verdünnten BSA- oder Gehirnhomogenatlösungen als Positivkontrollen in Immunelektronenmikroskopie-Studien^{vor 12,13}. Neuere Arbeiten untersuchten die Verwendung von Gelen aus formaldehydfixierten Proteinlösungen als Surrogate für FFPE-Gewebe in der Massenspektrometrie-Analyse¹⁴. Eine weitere neuere Arbeit untersuchte die Struktur und Eigenschaften von Gelen, die durch Erhitzen von menschlichen oder bovinen Serumalbuminlösungen bei verschiedenen Konzentrationen und^pH-15 gebildet wurden. Diese Autoren fanden heraus, dass Serumalbumin drei Arten von Gelen bildet, die sich in Abhängigkeit von den experimentellen Bedingungen in mechanischer Elastizität, Sekundärstrukturerhaltung und Fettsäurebindungsfähigkeit unterscheiden. Zusammen demonstrieren diese Papiere die allgemeine Machbarkeit des hier verwendeten Ansatzes. Proteinlösungen definierter Zusammensetzung erzeugen gewebeähnliche Gele, die mit histologischen Routinemethoden weiterverarbeitet, geschnitten und gefärbt werden können.

Dieses Protokoll beschreibt die Bildung einer synthetischen IHC-Kontrolle aus Rinderserumalbumin (BSA), das mit Hitze und Formaldehyd polymerisiert ist. Die Gele können eine Vielzahl von Antigenen enthalten, darunter Proteine in voller Länge, Proteindomänen und lineare Peptide sowie Nicht-Protein-Antigene einschließlich Oligonukleotide². Diese Demonstration verwendet ein Beispielantigen, ein lineares Peptid, das für die C-terminalen 16 Aminosäuren des humanen ERBB2 (HER2/neu) Proteins TPTAENPEYLGLDVPV-COOH kodiert (siehe Materialtabelle). Diese Sequenz umfasst die Epitope, die von drei kommerziell erhältlichen, diagnostisch relevanten Antikörpern erkannt wurden, darunter das polyklonale Reagenz Herceptest (ENPEYLGLDVP) und die monoklonalen Antikörper CB11 (AENPEYL) und 4B5 (TAENPEYLGL) (siehe Materialtabelle⁾¹⁶.

Die hier demonstrierte Methode verwendet leicht verfügbare Reagenzien unter Verwendung von Prozessen und Techniken, die jedem praktizierenden Histologielabor vertraut sind. Die wichtigste Einschränkung ist die Notwendigkeit, die Zielantigene zu identifizieren und zu kaufen, was in vielen Fällen zu relativ geringen Kosten erreicht werden kann. Da diese synthetischen Kontrollen von vollständig definierter Zusammensetzung sind und mit einfachen Methoden hergestellt werden, können sie in vielen Labors mit reproduzierbaren Ergebnissen implementiert werden. Ihre Verwendung kann die objektive, quantifizierbare Bewertung der Ergebnisse der IHC-Färbung erleichtern und eine größere Reproduzierbarkeit innerhalb und zwischen den Labors ermöglichen.

Protocol

1. Vorbereitung der Lagerlösung und der Werkzeuge Bereiten Sie 20 ml einer 25% w/v BSA-Lösung vor, indem Sie 5 g BSA-Pulver in 14 ml PBS, pH 7,2 in einem 50 ml konischen Röhrchen mischen, bis es gleichmäßig dispergiert ist. Vortex nach Bedarf, um das BSA-Pulver zu dispergieren.Halten Sie die Lösung über Nacht bei 4 °C, um eine vollständige Auflösung zu ermöglichen. Stellen Sie das Endvolumen mit PBS auf 20 ml ein, um eine 25% w/v Lagerlösung zu erhalten. Bereiten Sie 20…

Representative Results

Peptide sollten sich bei Raumtemperatur vollständig in einem geeigneten Lösungsmittel auflösen, um eine optisch klare Lösung zu bilden. Wenn nach 30-60 min noch sichtbares partikuläres Material vorhanden ist, kann es hilfreich sein, zusätzliche Volumina des ursprünglichen Lösungsmittels oder eines alternativen Lösungsmittels hinzuzufügen, das das beabsichtigte Volumen der in Tabelle 1 berechneten 5-fachen Peptidlagerlösung nicht überschreitet. Ebenso sollte die kombinierte Peptid/BSA-Lösung …

Discussion

Diese Methode ermöglicht es dem Benutzer, einheitliche Proben der bekannten Zusammensetzung und Antigenkonzentration als Standards für IHC-Reaktionen zu erstellen, wobei Materialien und Techniken verwendet werden, die den meisten Histologielabors vertraut sind. Der wichtigste Schritt besteht darin, das Epitop zu identifizieren, an das der Antikörper von Interesse bindet. Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung eines linearen Peptidantigens aus dem ERBB2/HER2-ICD. Das gleiche Protokoll kann verwendet werden, um BSA-…

Materials

Anti-HER2/neu clone 4B5	Ventana	5278368001
Biopsy Wraps	Leica	3801090
Bovine Serum Albumin, ultra pure	Cell Signaling Technology	BSA #9998
50 mL Conical Tube	Corning	352070
Disposable base mold (15 mm x 15 mm)	Fisher	22-363-553
Disposable base mold (24 mm x 24 mm)	Fisher	22-363-554
Disposable spatula	VWR	80081-188
Eppendorf Thermomixer	Eppendorf	22331
37% Formaldehyde	Electron Microscopy Sciences	15686
ERBB2 / HER2 peptide			UniProt P04626-1; a.a. 1240-55
Leica Autostainer XL	Leica	ST5010
Magnetic Stir Bar
NanoZoomer 2.0 HT whole slide imager	Hamamatsu
10% Neutral Buffered Formalin	VWR	16004-128
Nuclease-free microfuge tubes 1.5 mL
Paraplast paraffin	Leica	39601006
Peptide parameter calculator	Pep-Calc17	https://www.pep-calc.com/
Peptide suppliers	ABclonal Science		Users should contact peptide vendors for details of mass, purity and cost.
	Anaspec Peptide		Users should contact peptide vendors for details of mass, purity and cost.
	CPC Scientific		Users should contact peptide vendors for details of mass, purity and cost.
	New England Peptide		Users should contact peptide vendors for details of mass, purity and cost.
Phosphate Buffered Saline pH 7.2
Reagent Alcohol	Thermo Scientific	9111
Single Edge Razor	VWR	55411-050
Superfrost Plus positively charged microscope slides	Thermo Scientific	6776214
TMA Tissue Grand Master	3DHISTECH
Xylenes	VWR	89370-088