免疫組織化学のための合成抗原コントロール
Summary
この研究は、免疫組織化学のための合成抗原コントロールを作成する簡単な方法を文書化しています。この技術は、広範囲の濃度で様々な抗原に適応可能である。サンプルは、アッセイ内およびアッセイ間の性能と再現性を評価するための基準を提供します。
Abstract
免疫組織化学(IHC)アッセイは、タンパク質発現パターンに関する貴重な洞察を提供し、その信頼性の高い解釈には、十分に特徴付けられた陽性および陰性対照サンプルが必要です。適切な組織または細胞株コントロールが常に利用できるとは限らないため、合成IHCコントロールを作成する簡単な方法が有益であり得る。このような方法をここで説明する。これは、タンパク質、ペプチド、またはオリゴヌクレオチドを含む様々な抗原タイプに、広範囲の濃度で適応可能である。このプロトコルは、様々な診断的に関連する抗体によって認識されるヒト赤芽球性癌遺伝子B2(ERBB2/HER2)細胞内ドメイン(ICD)からのペプチドを例として用いて、合成抗原コントロールを作成するために必要なステップを説明する。ウシ血清アルブミン(BSA)溶液中のHER2 ICDペプチドの段階希釈物をホルムアルデヒドと混合し、85°Cで10分間加熱してペプチド/BSA混合物を固化および架橋する。得られたゲルは、組織のように処理、切片化、および染色することができ、広範囲の染色強度にまたがる既知の抗原濃度の一連のサンプルを生じる。
この単純なプロトコルは、日常的な組織学ラボ手順と一致しています。この方法は、ユーザが所望の抗原の十分な量を有することのみを必要とする。関連するエピトープをコードする組換えタンパク質、タンパク質ドメイン、または直鎖状ペプチドは、局所的または商業的に合成され得る。社内抗体を生成するラボは、免疫抗原のアリコートを合成制御標的として予約することができます。幅広い濃度にわたって明確に定義されたポジティブコントロールを作成する機会により、ユーザーは実験室内および実験室間のアッセイ性能を評価し、アッセイのダイナミックレンジと直線性に関する洞察を得て、特定の実験目標に合わせてアッセイ条件を最適化することができます。
Introduction
免疫組織化学(IHC)は、ホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)組織切片における標的抗原の高感度かつ特異的で空間的に正確な検出を可能にします。しかし、IHC染色結果は、温冷虚血時間、組織固定、組織前処理、抗体反応性および濃度、アッセイ検出化学、および反応時間1を含む複数の変数によって影響を受ける可能性がある。したがって、IHC反応の再現性のある性能および解釈には、これらの変数の厳密な制御、および十分に特徴付けられた陽性および陰性対照サンプルの使用が必要である。頻繁に使用される対照には、目的抗原を発現するために独立した分析から知られているパラフィン包埋組織または培養細胞株が含まれるが、そのようなサンプルは必ずしも利用可能ではない1。さらに、組織および細胞株対照における標的抗原の発現レベルは、一般に定性的にのみ理解され、可変であり得る。再現可能で正確に既知の濃度の標的抗原を含むコントロールは、IHC反応条件の最適化を支援することができます。合成IHC対照試料を作成するために生理学的に関連する濃度範囲で様々な抗原タイプに適応可能な一般的な方法が、著者ら2によって記載されている。ここでは、このタイプの標準の作成と使用のための詳細なプロトコルを提供しています。
適切なコントロールは、IHCアッセイ1、3、4の有効な解釈に不可欠である。組織、培養細胞、およびペプチドコーティングされた基質は、研究者の特定のニーズに応じてIHC対照として採用されている。組織をIHC対照として使用することに内在する利点と限界は、広範囲に議論されてきた1,4。多くの抗体について、適切なコントロールを、広いダイナミックレンジにわたって標的抗原を発現する細胞集団を含む選択された正常組織から選択することができる。組織対照は、標的抗原が発現部位または存在量に関して十分に特徴付けられていない場合、または潜在的に交差反応する抗原が同じ細胞または組織部位で共発現される場合にはあまり適さない。これらの文脈において、目的抗原を発現する培養細胞株のブロックが有用であり得る。標的特異性のさらなる証拠を提供するために、細胞株は、標的抗原を過剰発現または過小発現するように操作することができる。例えば、このようなアプローチは、最近、PD−L1抗原5の範囲を発現する同種性細胞株の組織マイクロアレイを用いた様々な抗PD−L1アッセイを評価するために使用された。細胞株ブロックの日常的な使用に対する実際的な制限には、十分な細胞数を生成するのに必要なコストと時間、およびクローン細胞株6内でも、一部の抗原の発現が確実に一貫していない可能性があるという事実が含まれます。合成ペプチドは、短い線状エピトープを認識する抗体のIHCコントロールの3番目の選択肢です。今回、Steven Bogenたちの研究グループは、スライドガラス7,8およびガラスビーズ9の表面に結合させたペプチドの使用について広く発表している。このグループによるある研究は、ペプチドベースのIHC対照の定量的分析が、並行して分析された組織対照の定性的評価によって見逃された染色プロセス変動を検出できることを実証した10。ビーズベースの抗原を使用する標準は広く適用可能である可能性があるが、多くの詳細は著者に独占的であり、広範な採用を制限している。
IHC標準に対する別のアプローチは、人工的に作成されたタンパク質ゲルに標的抗原を組み込む。この概念は、1972年にPer Brandzaegによって、正常なウサギ血清がグルタルアルデヒド11を使用して重合された研究で初めて実証されました。次いで、得られたゲルの小さなブロックを、様々な濃度で目的の免疫グロブリン抗原を含む溶液に1〜4週間浸漬した。アルコール固定およびパラフィン包埋後、得られた対照の切片は、それらが浸漬された抗原溶液の対数に対応する強度で染色されることが示された。その後、研究者らは、免疫電子顕微鏡研究における陽性対照として、希釈BSAまたは脳ホモジネート溶液中の特定のアミノ酸のグルタルアルデヒドコンジュゲートを調製した12,13。より最近の研究は、質量分析におけるFFPE組織の代用物としてのホルムアルデヒド固定タンパク質溶液から作られたゲルの使用を調査した14。別の最近の研究は、ヒトまたはウシの血清アルブミン溶液を様々な濃度およびpH15で加熱することによって形成されるゲルの構造および特性を調査した。これらの著者らは、血清アルブミンが実験条件に応じて機械的弾力性、二次構造保存、脂肪酸結合能が異なる3種類のゲルを形成することを見出した。これらの論文は、ここで採用されているアプローチの一般的な実現可能性を示しています。定義された組成のタンパク質溶液は、日常的な組織学的方法を使用してさらに処理、切片化、および染色することができる組織様ゲルを作成する。
このプロトコールは、熱およびホルムアルデヒドで重合されたウシ血清アルブミン(BSA)から作製された合成IHCコントロールの形成を記載している。ゲルには、完全長タンパク質、タンパク質ドメイン、および直鎖状ペプチドを含む多種多様な抗原、ならびにオリゴヌクレオチド2を含む非タンパク質抗原を組み込むことができる。この実証では、ヒトERBB2(HER2/neu)タンパク質TPTAENPEYLGLDVPV-COOHのC末端16アミノ酸をコードする直鎖状ペプチドである抗原の例を使用します( 材料表を参照)。この配列は、ハーセプトストポリクローナル試薬(ENPEYLGLDVP)およびモノクローナル抗体CB11(AENPEYL)および4B5(TAENPEYLGL)を含む3つの市販の診断関連抗体によって認識されるエピトープを含む( 材料表を参照のこと)16。
ここで実証された方法は、組織学研究室で実践されているあらゆる組織学検査室に馴染みのあるプロセスおよび技術を使用して、容易に入手可能な試薬を使用する。最も重要な制限は、標的抗原を同定して購入する必要性であり、多くの場合、比較的控えめなコストで達成することができる。これらの合成コントロールは完全に定義された組成であり、簡単な方法で作られているため、再現可能な結果で多くのラボで実装できます。それらの使用は、IHC染色結果の客観的で定量化可能な評価を容易にし、実験室内および実験室間の再現性を高めることができる。
Protocol
Representative Results
Discussion
この方法により、ユーザーは、ほとんどの組織学研究所で使い慣れた材料と技術を使用して、IHC反応の標準として既知の組成と抗原濃度の均一なサンプルを作成できます。最も重要なステップは、目的の抗体が結合するエピトープを特定することです。このプロトコルは、ERBB2/HER2 ICDからの線状ペプチド抗原の使用を記載している。同じプロトコールを使用して、オリゴヌクレオチド、蛍光?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、ペプチド合成の同僚であるJeffrey TomとAimin Song、TMA構築のNianfeng Ge、IHC染色のShari Lau、デジタル顕微鏡スキャンのMelissa Edick、デジタル画像定量化のHai Nguに感謝の意を表している。
Materials
| Anti-HER2/neu clone 4B5 | Ventana | 5278368001 | |
| Biopsy Wraps | Leica | 3801090 | |
| Bovine Serum Albumin, ultra pure | Cell Signaling Technology | BSA #9998 | |
| 50 mL Conical Tube | Corning | 352070 | |
| Disposable base mold (15 mm x 15 mm) | Fisher | 22-363-553 | |
| Disposable base mold (24 mm x 24 mm) |
Fisher | 22-363-554 | |
| Disposable spatula | VWR | 80081-188 | |
| Eppendorf Thermomixer | Eppendorf | 22331 | |
| 37% Formaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15686 | |
| ERBB2 / HER2 peptide | UniProt P04626-1; a.a. 1240-55 | ||
| Leica Autostainer XL | Leica | ST5010 | |
| Magnetic Stir Bar | |||
| NanoZoomer 2.0 HT whole slide imager | Hamamatsu | ||
| 10% Neutral Buffered Formalin | VWR | 16004-128 | |
| Nuclease-free microfuge tubes 1.5 mL | |||
| Paraplast paraffin | Leica | 39601006 | |
| Peptide parameter calculator | Pep-Calc17 | https://www.pep-calc.com/ | |
| Peptide suppliers | ABclonal Science | Users should contact peptide vendors for details of mass, purity and cost. | |
| Anaspec Peptide | Users should contact peptide vendors for details of mass, purity and cost. | ||
| CPC Scientific | Users should contact peptide vendors for details of mass, purity and cost. | ||
| New England Peptide | Users should contact peptide vendors for details of mass, purity and cost. | ||
| Phosphate Buffered Saline pH 7.2 | |||
| Reagent Alcohol | Thermo Scientific | 9111 | |
| Single Edge Razor | VWR | 55411-050 | |
| Superfrost Plus positively charged microscope slides | Thermo Scientific | 6776214 | |
| TMA Tissue Grand Master | 3DHISTECH | ||
| Xylenes | VWR | 89370-088 |
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