Controles de Antígeno Sintético para Imunohistoquímica

Summary

Este trabalho documenta um método simples para criar controles de antígeno sintético para a imunohistoquímica. A técnica é adaptável a uma variedade de antígenos em uma ampla gama de concentrações. As amostras fornecem uma referência para avaliar o desempenho intra e o ensaio e a reprodutibilidade.

Abstract

Os ensaios de imunohistoquímica (IHC) fornecem insights valiosos sobre padrões de expressão proteica, a interpretação confiável da qual requer amostras de controle positivas e negativas bem caracterizadas. Como os controles adequados de tecido ou linha celular nem sempre estão disponíveis, um método simples para criar controles sintéticos de IHC pode ser benéfico. Tal método é descrito aqui. É adaptável a vários tipos de antígeno, incluindo proteínas, peptídeos ou oligonucleotídeos, em uma ampla gama de concentrações. Este protocolo explica as etapas necessárias para a criação de controles de antígeno sintético, utilizando como exemplo um peptídeo do domínio intracelular oncogene B2 (ERBB2/HER2) reconhecido por uma variedade de anticorpos diagnosticicamente relevantes. Diluições seriais do peptídeo HER2 ICD em grédulo bovino (BSA) são misturadas com formaldeído e aquecidas por 10 min a 85 °C para solidificar e cruzar a mistura peptídeo/BSA. O gel resultante pode ser processado, seccionado e manchado como um tecido, produzindo uma série de amostras de concentrações de antígeno conhecidas abrangendo uma ampla gama de intensidades de coloração.

Este protocolo simples é consistente com procedimentos de laboratório de histologia de rotina. O método exige apenas que o usuário tenha uma quantidade suficiente do antígeno desejado. Proteínas recombinantes, domínios proteicos ou peptídeos lineares que codificam epítopos relevantes podem ser sintetizados localmente ou comercialmente. Laboratórios que geram anticorpos internos podem reservar alíquotas do antígeno imunizante como alvo de controle sintético. A oportunidade de criar controles positivos bem definidos em uma ampla gama de concentrações permite que os usuários avaliem o desempenho de ensaios intra e inter-laboratorial, obtenham insights sobre o alcance dinâmico e linearidade de seus ensaios e otimizem condições de ensaio para seus objetivos experimentais particulares.

Introduction

A imunohistoquímica (IHC) permite a detecção sensível e específica e espacialmente precisa de antígenos de destino em seções de tecido com fixo de formalina e parafina (FFPE). No entanto, os resultados de coloração do IHC podem ser afetados por múltiplas variáveis, incluindo tempo de isquemia quente e fria, fixação tecidual, pré-tratamento de tecido, reatividade e concentração de anticorpos, química de detecção de ensaios e vezes^{de reação 1}. Assim, o desempenho reprodutível e a interpretação das reações do IHC requerem um controle rigoroso dessas variáveis e o uso de amostras de controle positivas e negativas bem caracterizadas. Os controles frequentemente utilizados incluem tecidos embutidos em parafina ou linhas de células cultivadas conhecidas a partir de análises independentes para expressar o antígeno de interesse, mas essas amostras nem sempre estão disponíveis¹. Além disso, os níveis de expressão dos antígenos alvo em tecidos e controles de linha celular são geralmente compreendidos apenas qualitativamente e podem ser variáveis. Controles contendo concentrações reprodutíveis e precisamente conhecidas de antígeno alvo podem auxiliar na otimização das condições de reação do IHC. Um método geral, adaptável a uma variedade de tipos de antígenos em uma gama fisiologicamente relevante de concentrações para criar amostras de controle de IHC sintéticas, foi descrito pelos autores². Um protocolo detalhado é fornecido aqui para a criação e uso deste tipo de padrão.

Os controles apropriados são essenciais para a interpretação válida dos ensaios^{iHC 1,3,4}. Tecidos, células cultivadas e substratos revestidos de peptídeos têm sido empregados como controles de IHC de acordo com as necessidades específicas dos investigadores. As vantagens e limitações inerentes ao uso de tecidos como controles de IHC foram amplamente discutidas ^1,4. Para muitos anticorpos, os controles apropriados podem ser escolhidos a partir de tecidos normais selecionados contendo populações celulares expressando o antígeno alvo em uma ampla faixa dinâmica. Os controles teciduais são menos adequados quando o antígeno alvo não é bem caracterizado em relação ao local de expressão ou abundância, ou quando antígenos potencialmente de reação cruzada são co-expressos nas mesmas células ou locais de tecido. Nesses contextos, blocos de linhas de células cultivadas expressando o antígeno de interesse podem ser úteis. Para fornecer mais evidências de especificidade de alvo, as linhas de celular podem ser projetadas para antígenos de alvos sobre-ou menos expressos. Por exemplo, tal abordagem foi recentemente usada para avaliar uma variedade de ensaios anti-PD-L1 usando uma microarraia tecidual de linhas celulares isogênicas expressando uma gama de antígeno PD-L1⁵. Limitações práticas ao uso rotineiro de blocos de linha celular incluem o custo e o tempo necessários para produzir números celulares suficientes e o fato de que a expressão de alguns antígenos pode não ser confiável consistente, mesmo dentro das linhas de células clonais⁶. Peptídeos sintéticos são uma terceira opção para controles IHC para anticorpos que reconhecem epítopos lineares curtos. Steven Bogen e colegas publicaram extensivamente sobre o uso de peptídeos acoplado à superfície de lâminas de vidro ^7,8 e contas de vidro⁹. Um estudo desse grupo demonstrou que a análise quantitativa dos controles de IHC baseados em peptídeos poderia detectar variação do processo de coloração perdida pela avaliação qualitativa dos controles teciduais analisados em^{paralelo 10}. Embora os padrões que usam antígenos baseados em contas possam ser amplamente aplicáveis, muitos detalhes são proprietários dos autores, limitando a adoção generalizada.

Outra abordagem aos padrões de IHC incorpora antígenos-alvo em géis proteicos criados artificialmente. Este conceito foi demonstrado pela primeira vez por Per Brandtzaeg em 1972 em um estudo no qual o soro de coelho normal foi polimerizado usando glutaraldeído¹¹. Pequenos blocos do gel resultante foram então encharcados por 1-4 semanas em soluções contendo os antígenos de imunoglobulina de interesse em várias concentrações. Após a fixação do álcool e a incorporação de parafinas, seções dos controles resultantes mostraram-se manchas com intensidades correspondentes ao logaritmo das soluções de antígeno em que haviam sido encharcadas. Mais tarde, os pesquisadores prepararam conjugados de glutaraldeído de aminoácidos específicos em soluções de BSA diluída ou homogeneizar cérebro como controles positivos em estudos de microscopia imuno-elétron^12,13. Trabalho mais recente investigou o uso de géis feitos a partir de soluções proteicas fixas por formaldeído como substitutos para o tecido FFPE na análise de espectrometria de massa¹⁴. Outro trabalho recente investigou a estrutura e propriedades dos géis formados pelo aquecimento de soluções de albumina de soro humano ou bovino em diversas concentrações e pH¹⁵. Esses autores descobriram que a albumina séum forma três tipos de géis que diferem na elasticidade mecânica, preservação da estrutura secundária e capacidade de ligação de ácidos graxos, dependendo das condições experimentais. Juntos, esses trabalhos demonstram a viabilidade geral da abordagem aqui empregada. Soluções proteicas de composição definida criam géis semelhantes a tecidos que podem ser processados, seccionados e manchados usando métodos histológicos de rotina.

Este protocolo descreve a formação de um controle de IHC sintético feito de albumina de soro bovino (BSA) polimerizada com calor e formaldeído. Os géis podem incorporar uma grande variedade de antígenos, incluindo proteínas de comprimento total, domínios de proteínas e peptídeos lineares, bem como antígenos não proteicos, incluindo oligonucleotídeos². Esta demonstração usa um exemplo de antígeno um peptídeo linear codificando os aminoácidos C-terminal 16 da proteína humana ERBB2 (HER2/neu) TPTAENPEYLGLDVPV-COOH (ver Tabela de Materiais). Esta sequência inclui os epítos reconhecidos por três anticorpos comercialmente disponíveis e relevantes diagnósticos, incluindo o reagente policlonal Herceptest (ENPEYLGLDVP) e os anticorpos monoclonais CB11 (AENPEYL) e 4B5 (TAENPEYLGL) (ver Tabela de Materiais)¹⁶.

O método aqui demonstrado emprega reagentes prontamente disponíveis utilizando processos e técnicas familiares a qualquer laboratório de histologia praticante. A limitação mais significativa é a necessidade de identificar e comprar os antígenos alvo, que podem ser realizados em muitos casos a um custo relativamente modesto. Como esses controles sintéticos são de composição totalmente definida e feitos com métodos simples, eles podem ser implementados em muitos laboratórios com resultados reprodutíveis. Seu uso pode facilitar a avaliação objetiva e quantificável dos resultados de coloração do IHC e permitir maior reprodutibilidade intra e interseção de laboratório.

Protocol

1. Elaboração de solução de estoque e ferramentas Prepare 20 mL de uma solução BSA de 25% w/v misturando pó BSA de 5 g em 14 mL de PBS, pH 7,2 em um tubo cônico de 50 mL até dispersar uniformemente. Vórtice, conforme necessário, para dispersar o pó BSA.Mantenha a solução durante a noite a 4 °C para permitir a dissolução completa. Ajuste o volume final para 20 mL com PBS para fazer uma solução de estoque de 25% em w/v. Prepare 20 mL de uma solução BSA de 31,3% w…

Representative Results

Os peptídeos devem dissolver-se inteiramente em um solvente apropriado à temperatura ambiente para formar uma solução opticamente clara. Se o material de partículas visíveis ainda estiver presente após 30-60 min, pode ser útil adicionar volumes adicionais do solvente original ou um solvente alternativo não excedendo o volume pretendido da solução de estoque de peptídeo de 5x calculada na Tabela 1. Da mesma forma, a solução de peptídeo/BSA combinada deve permanecer translúcida (<strong cla…

Discussion

Este método permite ao usuário criar amostras uniformes de composição conhecida e concentração de antígenos como padrões em reações de IHC, utilizando materiais e técnicas familiares à maioria dos laboratórios de histologia. O passo mais crucial é identificar o epítope ao qual o anticorpo de interesse se liga. Este protocolo descreve o uso de um antígeno de peptídeo linear da CID ERBB2/HER2. O mesmo protocolo pode ser usado para formar géis BSA contendo oligonucleotídeos, rótulos fluorescentes, domín…

Materials

Anti-HER2/neu clone 4B5	Ventana	5278368001
Biopsy Wraps	Leica	3801090
Bovine Serum Albumin, ultra pure	Cell Signaling Technology	BSA #9998
50 mL Conical Tube	Corning	352070
Disposable base mold (15 mm x 15 mm)	Fisher	22-363-553
Disposable base mold (24 mm x 24 mm)	Fisher	22-363-554
Disposable spatula	VWR	80081-188
Eppendorf Thermomixer	Eppendorf	22331
37% Formaldehyde	Electron Microscopy Sciences	15686
ERBB2 / HER2 peptide			UniProt P04626-1; a.a. 1240-55
Leica Autostainer XL	Leica	ST5010
Magnetic Stir Bar
NanoZoomer 2.0 HT whole slide imager	Hamamatsu
10% Neutral Buffered Formalin	VWR	16004-128
Nuclease-free microfuge tubes 1.5 mL
Paraplast paraffin	Leica	39601006
Peptide parameter calculator	Pep-Calc17	https://www.pep-calc.com/
Peptide suppliers	ABclonal Science		Users should contact peptide vendors for details of mass, purity and cost.
	Anaspec Peptide		Users should contact peptide vendors for details of mass, purity and cost.
	CPC Scientific		Users should contact peptide vendors for details of mass, purity and cost.
	New England Peptide		Users should contact peptide vendors for details of mass, purity and cost.
Phosphate Buffered Saline pH 7.2
Reagent Alcohol	Thermo Scientific	9111
Single Edge Razor	VWR	55411-050
Superfrost Plus positively charged microscope slides	Thermo Scientific	6776214
TMA Tissue Grand Master	3DHISTECH
Xylenes	VWR	89370-088